Name: 一种研究细胞间分泌信号的近距离培养方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: 学习近距离培养方法研究细胞间旁分泌信号，使用卵巢癌细胞模型分离旁分泌与邻分泌作用。该技术可重复性强，有助于深入理解肿瘤微环境中的细胞通讯机制。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢患者参与本研究的组织样本采集工作。本研究得到了美国国防部卵巢癌研究计划学院奖（DoD OCRP Ovarian Cancer Academy Award，编号：W81XWH-15-0253）以及Colleen's Dream基金会向Anirban K. Mitra提供的试点项目资助。

该方案遵循印第安纳大学机构监管委员会的指导原则。
1. 细胞准备
<ol>
	<li>人原代间皮细胞的分离与培养
	<ol>
		<li>按照先前所述方法17,18从人网膜组织中分离人原代间皮细胞（HPMCs），并在完全生长培养基[含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、1%非必需氨基酸和1%维生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）]中，于37 °C、5% CO2条件下培养。 
		注：HPMCs通常培养至100%融合（图1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>卵巢癌细胞的培养条件
	<ol>
		<li>在完全生长培养基中，于37 °C、5% CO2条件下培养HeyA8卵巢癌细胞。 
		注：使用培养至约80%融合的HeyA8细胞（图1B）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞培养
<ol>
	<li>近端培养体系建立
	<ol>
		<li>使用适用于6孔板的Transwell小室，其包含经组织培养处理的10 μm厚聚碳酸酯膜，膜孔径为0.4 μm（108 孔/cm2）和一个4.67 cm2 生长区域。如有需要，可根据生长表面积按比例调整接种细胞数量，以优化不同插入片段大小的培养条件。使用前将完全培养基、胰蛋白酶和磷酸盐缓冲液（PBS）预热至 37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备插入片段
	<ol>
		<li>使用无菌镊子将插入物从包装中取出，倒置放入无菌的15 cm培养皿中，以在插入物膜的下表面接种HeyA8细胞。</li>
		<li>使用15 cm培养皿，因其深度足以容纳倒置的插入式培养小室，也可替换为其他合适的无菌容器。根据实验需要，将所需数量的插入式培养小室放入15 cm培养皿中。</li>
		<li>用记号笔在插入物的边缘相应地标记三个对照组和三个实验组。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备癌细胞
	<ol>
		<li>将生长至80%汇合度的HeyA8细胞进行胰蛋白酶消化处理2 烧瓶（约 2 x 106 细胞），加入1 mL胰蛋白酶（0.25%）消化40–60秒，随后加入6 mL完全培养基中和胰蛋白酶。</li>
		<li>以 500 x g 离心细胞 g 室温（RT）孵育3分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于5 mL完全培养基中。使用台盼蓝染色排除法计数活细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种癌细胞
	<ol>
		<li>将活的HeyA8细胞用完全培养基重悬至浓度为100,000个细胞/mL。轻轻将800 μL含80,000个HeyA8细胞的完全培养基接种至插入式培养小室底部（此时底部朝上，因小室已倒置）。</li>
		<li>将细胞接种成穹顶状，以确保细胞保留在小室中（图1C从膜的中心开始，一边缓慢移液，一边以同心圆方式向外移动。避免距离边缘超过3 mm，以防培养基溢出。 
		注意：接种的细胞数量取决于细胞的生长速率和实验持续时间。本项邻近共培养实验中接种的HeyA8细胞数量已优化，至第3天结束时细胞融合度将达到80–90%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>癌细胞黏附
	<ol>
		<li>盖上15 cm培养皿，小心地将含有插入物的培养皿转移至CO₂培养箱2 培养箱中。此步骤中切勿扰动插入物上的培养基液滴及细胞。将细胞置于37 °C孵育4 h，以使癌细胞贴附于插入物上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备间皮细胞
	<ol>
		<li>大约 4 小时后，将 75 cm² 培养瓶中生长至 100% 汇合度的 HPMC 进行胰酶消化2 烧瓶（约 4 x 106 用2 mL胰蛋白酶（0.25%）消化细胞1–2分钟，然后加入12 mL完全培养基中和胰蛋白酶。</li>
		<li>以 500 x g 离心细胞 g 室温孵育3分钟，将细胞沉淀重悬于10 mL完全培养基中，使用台盼蓝染色排除法计数活细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种间皮细胞
	<ol>
		<li>将活的HPMC细胞以300,000个细胞/mL的浓度悬浮于完全培养基中。向6孔板的每孔加入2.5 mL新鲜完全培养基。小心将含有小室的15 cm培养皿移至生物安全柜中。使用无菌镊子将小室翻转，轻轻放入6孔板的孔中，使其保持直立状态，使附着于下表面的HeyA8细胞浸入完全培养基中（图1C).</li>
		<li>将450,000个HPMCs悬浮于1.5 mL生长培养基中，接种至嵌套插件内，使HeyA8细胞附着于面向孔底部的表面（图1C）或不含任何HeyA8细胞的插入膜，用于HPMC对照。向HeyA8对照组中加入1.5 mL不含细胞的生长培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>扩增近端培养物
	<ol>
		<li>让近端培养物在CO₂培养箱中继续生长2 37 °C、5% CO₂ 培养箱2 72小时。如有需要，可按如下方法补充培养基。
		<ol>
			<li>对于插入物内部，移除750 µL培养基，并加入750 µL新鲜的完全生长培养基。</li>
			<li>对于插入物的外侧（6孔板），移除1 mL培养基并加入1 mL新鲜的完全生长培养基。选择1 mL是为了方便一步完成换液。如有需要，也可移除并替换1.25 mL。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集细胞
	<ol>
		<li>在近端培养72小时后收集细胞。此步骤需特别注意防止HeyA8细胞与HPMCs之间的交叉污染。将细胞进行胰酶消化，离心后收集细胞沉淀，直接裂解细胞沉淀，而非在膜上裂解细胞，以避免交叉污染。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化细胞
	<ol>
		<li>用 1× PBS 冲洗插入物的两侧。</li>
		<li>将小室转移至新孔，并加入胰蛋白酶。向小室内侧加入0.5 mL胰蛋白酶，向6孔板中加入2 mL胰蛋白酶，以消化贴附在小室底部表面的癌细胞。将培养板于37 °C孵育2 min。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>中和胰蛋白酶
	<ol>
		<li>向插入物内加入1 mL完全培养基以中和胰蛋白酶，用移液器吹打混匀，然后收集细胞并转移至已标记的收集管中。再加入额外的2 mL完全培养基以确保完全中和。移液时应小心避免刺穿膜，以防细胞交叉污染。</li>
		<li>为收集插入物底部的细胞，用移液器将步骤12.2中加入的2 mL胰蛋白酶反复吹打底部表面2–3次，使细胞脱落并落入6孔板底部。用6 mL培养基中和孔板底部的胰蛋白酶，然后将孔板中的内容物转移至已标记的收集管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集并裂解细胞 
	<ol>
		<li>以 500 x g 离心细胞 g 孵育3分钟，吸除培养基。用0.7 mL基于苯酚和硫氰酸胍的裂解试剂重悬并裂解细胞沉淀，用于RNA提取。使用任何合适的试剂盒分离RNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 定量实时聚合酶链式反应
注意：以下步骤描述了通过定量实时聚合酶链式反应（qPCR）来研究近端共培养引起的基因表达变化。
<ol>
	<li>使用合适的逆转录酶及其相应的缓冲液和随机引物，从RNA样品中制备cDNA，以确保所有mRNA的逆转录（参见材料表）。</li>
	<li>采用GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）作为内参，通过qPCR检测纤连蛋白（FN1）、E-钙黏蛋白（CDH1）和转化生长因子β1（TGFβ1）的mRNA表达水平变化。可使用标准化的商业化基因表达检测试剂盒（参见材料表），或自行设计引物。</li>
	<li>将与HPMCs共培养的HeyA8细胞与HeyA8对照组进行比较，同时将与HeyA8细胞共培养的HPMCs与HPMC对照组进行比较。</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessories+to+the+crime%3A+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li>
<li>Cupedo, T., Mebius, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+interactions+in+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular interactions in lymph node development.</a> The Journal of Immunology. 174 (1), 21-25 (2005).</li>
<li>Suvas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Substance+P+Neuropeptide+in+Inflammation%2C+Wound+Healing%2C+and+Tissue+Homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Role of Substance P Neuropeptide in Inflammation, Wound Healing, and Tissue Homeostasis.</a> The Journal of Immunology. 199 (5), 1543-1552 (2017).</li>
<li>Gnecchi, M., Danieli, P., Malpasso, G., Ciuffreda, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+Mechanisms+of+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Tissue+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine Mechanisms of Mesenchymal Stem Cells in Tissue Repair.</a> Methods in Molecular Biology. , 123-146 (2016).</li>
<li>Lionetti, V., Bianchi, G., Recchia, F. A., Ventura, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+autocrine+and+paracrine+myocardial+signals%3A+an+emerging+therapeutic+strategy+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Control of autocrine and paracrine myocardial signals: an emerging therapeutic strategy in heart failure.</a> Heart Failure Reviews. 15 (6), 531-542 (2010).</li>
<li>Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+regulation+of+angiogenesis+by+different+cell+types+in+the+aorta+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model.</a> International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).</li>
<li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (7), 497-512 (2014).</li>
<li>Plaks, V., Kong, N., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+stem+cell+niche%3A+how+essential+is+the+niche+in+regulating+stemness+of+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The cancer stem cell niche: how essential is the niche in regulating stemness of tumor cells.</a> Cell Stem Cell. 16 (3), 225-238 (2015).</li>
<li>Elenbaas, B., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterotypic+signaling+between+epithelial+tumor+cells+and+fibroblasts+in+carcinoma+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heterotypic signaling between epithelial tumor cells and fibroblasts in carcinoma formation.</a> Experimental Cell Research. 264 (1), 169-184 (2001).</li>
<li>Wilson, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR+ligands+exhibit+functional+differences+in+models+of+paracrine+and+autocrine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Growth+Factors%22%5BJournal%5D)">EGFR ligands exhibit functional differences in models of paracrine and autocrine signaling.</a> Growth Factors. 30 (2), 107-116 (2012).</li>
<li>Kopan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Notch signaling.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (10), (2012).</li>
<li>Singh, A. B., Sugimoto, K., Harris, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Juxtacrine+activation+of+epidermal+growth+factor+%28EGF%29+receptor+by+membrane-anchored+heparin-binding+EGF-like+growth+factor+protects+epithelial+cells+from+anoikis+while+maintaining+an+epithelial+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Juxtacrine activation of epidermal growth factor (EGF) receptor by membrane-anchored heparin-binding EGF-like growth factor protects epithelial cells from anoikis while maintaining an epithelial phenotype.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 32890-32901 (2007).</li>
<li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity%3A+emerging+roles+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Research. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+reprogram+normal+fibroblasts+into+cancer-associated+fibroblasts+in+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs reprogram normal fibroblasts into cancer-associated fibroblasts in ovarian cancer.</a> Cancer Discovery. 2 (12), 1100-1108 (2012).</li>
<li>Nieman, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+ovarian+cancer+metastasis+and+provide+energy+for+rapid+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1498-1503 (2011).</li>
<li>Salimian Rizi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+mediates+metabolic+coupling+of+omentum-derived+adipose+stroma+to+ovarian+and+endometrial+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide mediates metabolic coupling of omentum-derived adipose stroma to ovarian and endometrial cancer cells.</a> Cancer Research. 75 (2), 456-471 (2015).</li>
<li>Mitra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment-induced+downregulation+of+miR-193b+drives+ovarian+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Microenvironment-induced downregulation of miR-193b drives ovarian cancer metastasis.</a> Oncogene. 34 (48), 5923-5932 (2015).</li>
<li>Tomar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ETS1+induction+by+the+microenvironment+promotes+ovarian+cancer+metastasis+through+focal+adhesion+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">ETS1 induction by the microenvironment promotes ovarian cancer metastasis through focal adhesion kinase.</a> Cancer Letters. 414, 190-204 (2018).</li>
<li>Mitra, A. K. Ovarian Cancer Metastasis: A Unique Mechanism of Dissemination. Tumor Metastasis. Xu, K. , InTechOpen. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination">https://www.intechopen.com/books/tumor-metastasis/ovarian-cancer-metastasis-a-unique-mechanism-of-dissemination</a> 43-58 (2016).</li>
<li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discovery. 1 (2), 144-157 (2011).</li>
<li>Kenny, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesothelial+cells+promote+early+ovarian+cancer+metastasis+through+fibronectin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4614-4628 (2014).</li>
<li>Boelens, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+transfer+from+stromal+to+breast+cancer+cells+regulates+therapy+resistance+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exosome transfer from stromal to breast cancer cells regulates therapy resistance pathways.</a> Cell. 159 (3), 499-513 (2014).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+and+function+of+exosomes+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The biology and function of exosomes in cancer.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1208-1215 (2016).</li>
<li>Kohlhapp, F. J., Mitra, A. K., Lengyel, E., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+mediators+and+communicators+between+cancer+cells+and+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as mediators and communicators between cancer cells and the tumor microenvironment.</a> Oncogene. 34 (48), 5857-5868 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

理解细胞间旁分泌和邻分泌信号传导的机制，对于深入认识正常组织稳态及疾病状态至关重要7,8。目前大多数旁分泌信号研究通过收集一种细胞类型的条件培养基，并用其处理另一种细胞类型来开展。该方法具有操作简便的优点，但无法准确模拟分泌因子在细胞微环境中的局部浓度，也无法真实再现相关因子生成与消耗的动力学过程。尽管可通过浓缩条件培养基在一定程度上（尽管不精确）解决前一个问题，但要重现因子生成与消耗的动力学过程则极为困难。使用Transwell小室将细胞分别培养在插入膜上和孔板底部，可在一定程度上重现因子生成与消耗的动力学效应；然而，由于细胞之间被插入膜与孔底之间的距离所分隔，因而无法模拟旁分泌因子的局部高浓度环境。我们报道了一种简单的邻近共培养方法，可用于研究相互性的旁分泌信号传导，该方法既保留了分泌因子的局部高浓度特性，又维持了因子生成与消耗速率的动态变化。
在一项原理验证研究中，我们证明了近端共培养方法在重现卵巢癌细胞与腹膜间皮细胞（HPMCs）相互作用已知效应方面的有效性...

癌细胞与肿瘤微环境之间产生有益的相互作用在肿瘤进展中的作用已得到充分证实，并已成为癌症生物学研究的主要焦点之一1。类似的双向信号交流在伤口愈合、免疫反应、血管生成、干细胞微环境以及发育过程中也至关重要2,3,4,5,6,7,8。这些生物学过程的一个共同特点是，细胞以多种方式响应来自其微环境的胞外信号，从而决定细胞命运、组织生理功能以及疾病进展。因此，研究重点已日益转向深入理解此类细胞间通讯所涉及的机制。大多数此类相互作用涉及细胞间的旁分泌或接触依赖性信号传导。旁分泌信号传导是指一个细胞分泌特定的信号因子，被邻近细胞上的相应受体感知，从而在该细胞中引发反应9,10；而接触依赖性信号传导则需要两个参与细胞的细胞组分之间直接接触11,12。
此类信号传导在组织稳态以及肿瘤微环境中均起着关键作用。肿瘤细胞可受益于肿瘤间质中细胞分泌的旁分泌和邻分泌因子，这些细胞包括癌症相关成纤维细胞（CAFs）、免疫细胞和脂肪细胞。13,14,15,16旁分泌信号传导可由生长因子、细胞因子、趋化因子介导， 等等。，而旁分泌信号传导则涉及相邻的配体与受体，例如Notch信号通路，或整合素与其相应的细胞外基质蛋白之间的相互作用。我们已证实卵巢癌细胞与癌症相关成纤维细胞（CAFs）之间的双向相互作用在肿瘤进展和转移中的重要性14类似地，转移性卵巢癌细胞与覆盖转移部位的间皮细胞之间的相互作用可调控癌细胞中的关键微小RNA和转录因子，从而促进转移性定植17,18.
大多数关于旁分泌信号的研究采用从一种细胞类型收集的条件培养基来处理第二种细胞类型。尽管这种方法被广泛使用，但它无法有效模拟分泌因子在靶细胞微环境中的局部高浓度水平，也无法重现分泌因子由一个细胞持续产生并被邻近细胞接收的动力学过程。由于分泌因子仅在来源细胞附近达到所需浓度，随着距离增加会逐渐扩散并稀释，因此旁分泌信号仅在短距离内有效。这种局部高浓度的分泌因子对于激活受体细胞的响应至关重要。此外，靶细胞的响应还取决于新分泌因子与通过降解、结合、内化以及从来源细胞扩散导致的持续消耗之间的动态平衡。虽然可以通过浓缩条件培养基来模拟微环境中的较高局部浓度，但无法精确复制实际浓度，更无法模拟相关因子产生与消耗的自然动力学过程。为了更准确地模拟旁分泌信号并将其与邻近细胞信号机制区分开来，我们设计了一种新型的邻近共培养方法，该方法将两种细胞类型分别培养在多孔膜的两侧。膜上的孔径足够小，可防止发生邻近细胞相互作用，同时允许分泌因子以局部高浓度进行交换。通过这种方式，该系统保留了旁分泌因子产生与消耗的动力学特征。

<table><tbody><tr><td>24 mm Transwell 可穿透支持物，带 0.4 &amp;micro;m 孔径聚碳酸酯膜插入物</td><td>Corning (Costar)</td><td>3412</td><td>&amp;bull; 10 &amp;micro;m 厚半透明聚碳酸酯膜&lt;br/&gt; &amp;bull; 经处理以实现最佳细胞贴附&lt;br/&gt; &amp;bull; 每板6个插入物包装于6孔板中，每箱4板&lt;br/&gt; &amp;bull; 膜需染色以使细胞可见&lt;br/&gt; &amp;bull; 经γ射线灭菌</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353046</td><td>平底，TC处理，无菌，带盖</td></tr><tr><td>15 cm 培养皿</td><td>Corning (Falcon)</td><td>353025</td><td>无菌，TC处理细胞培养皿</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM 维生素</td><td>Corning (Cellgro)</td><td>25-020-CI</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td></td><td></td><td>任何品牌均可</td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td></td><td></td><td>任何品牌均可</td></tr><tr><td>生物安全二级柜</td><td></td><td></td><td>任何品牌均可</td></tr><tr><td>FN1 TaqMan 基因表达检测</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01549976_m1</td><td></td></tr><tr><td>TGFB1 TaqMan 基因表达检测</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00998133_m1</td><td></td></tr><tr><td>CDH1 TaqMan 基因表达检测</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs01023895_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH TaqMan 基因表达检测</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini RNA 提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>高容量 cDNA 反转录试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>43-688-13</td><td></td></tr><tr><td>HeyA8 卵巢癌细胞</td><td>来自芝加哥大学 Ernst Lengyel 实验室</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&amp;beta; 中和抗体</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB1835-100</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于研究细胞间旁分泌信号传导的近端共培养方法

A Proximal Culture Method to Study Paracrine Signaling Between Cells

细胞间相互作用在许多生物学过程中发挥着重要作用，包括肿瘤进展、免疫反应、血管生成以及发育过程。这类相互作用主要通过旁分泌或邻分泌信号通路介导。目前最常用的区分这两种相互作用的方法是使用条件培养基和共培养实验。然而，条件培养基无法准确模拟旁分泌相互作用过程中微环境中分泌因子局部高浓度的效应，因此可能导致结论不准确。为解决这一问题，我们设计了一种邻近培养方法用于研究旁分泌信号传导。该方法将两种细胞分别培养在厚度为10 µm、孔径为0.4 µm的聚碳酸酯膜的两侧。膜上的微孔允许分泌因子交换，同时有效阻断邻分泌信号传导。实验终点时可分别收集并裂解细胞，以评估旁分泌信号的影响。除了能够模拟分泌因子的局部浓度梯度外，该方法还适用于需要长时间培养的实验，以及抑制剂的应用。尽管我们使用该方法研究卵巢癌细胞与其在转移部位所接触的间皮细胞之间的相互作用，但该技术可适用于任意两种贴壁细胞类型，供研究人员在肿瘤微环境、免疫学及发育生物学等多个领域研究旁分泌信号传导。

转移性卵巢癌细胞在腹腔内转移部位会遇到间皮细胞19。与间皮细胞之间有效的旁分泌和邻近分泌相互作用有助于诱导卵巢癌细胞产生适应性反应，从而促进成功转移17,18,20,21。为了验证邻近共培养方法的有效性，我们检测了HeyA8卵巢癌细胞与HPMCs之间的旁分泌相互作用。已有研究报道，HeyA8细胞与HPMCs共培养可导致HPMCs中纤连蛋白表达水平升高21。这种纤连蛋白表达的上调是由HeyA8细胞分泌更多TGFβ所介导的21。因此，我们检测了HeyA8细胞与HPMCs进行邻近培养后，两种细胞中纤连蛋白和TGFβ的mRNA水平变化。与未在插入膜下表面附着HeyA8细胞的对照组相比，...

旁分泌和邻分泌细胞相互作用在多种生物过程中发挥重要作用，包括肿瘤进展、免疫应答、血管生成以及发育过程。本文采用一种邻近培养方法来研究旁分泌信号传导，该方法可在防止细胞直接接触的同时，维持分泌因子的局部浓度。

细胞间相互作用在多种生物过程中发挥着重要作用，包括肿瘤进展、免疫应答、血管生成以及……

该方法有助于回答细胞间通讯领域中的关键问题，即两种细胞之间的旁分泌与邻近分泌相互作用。该方法的主要优势在于，它是一种极为简单且可重复的技术，能够在典型的培养条件下准确捕捉旁分泌信号，同时有效阻止邻近分泌信号的产生。该技术的应用意义在于加深对癌细胞与肿瘤微环境之间相互作用机制的理解。尽管该方法可揭示癌细胞与肿瘤间质之间的相互作用，也可应用于其他系统，如伤口愈合和血管生成。首先将卵巢癌细胞从80%融合的培养物中分离，加入1毫升0.25%胰蛋白酶处理40至60秒，随后用6毫升完全培养基中和反应。通过离心收集细胞，并将细胞沉淀重悬于5毫升新鲜的完全培养基中。计数后，将细胞稀释至每毫升完全培养基中含有100,000个卵巢癌细胞，并在适当大小的无菌组织培养皿中，为每个实验条件放置三个倒置的、孔径为0.4微米、经组织培养处理的聚碳酸酯膜细胞培养小室。根据实验条件标记小室，然后小心地将癌细胞以同心圆方式从膜中心开始向外逐层加入每个小室的底部，形成800微升的液滴穹顶。在将细胞接种到小室底部时需格外小心，确保含有细胞的培养基液滴在孵育过程中不会从小室边缘流走。当所有插入物接种完毕后，盖上培养皿，并小心将插入物放入细胞培养箱中。约四小时后，用 2 毫升 0.25% 胰蛋白酶消化 1 至 2 分钟以解离 HPMC，随后加入 12 毫升完全生长培养基中和反应。通过离心收集 HPMC，并将沉淀重悬于 10 毫升完全生长培养基中进行细胞计数。将细胞稀释至每毫升完全培养基中含有300,000个单个核细胞（HPMC），并向六孔培养板的每个孔中加入2.5毫升新鲜的完全培养基。使用无菌镊子将每个插入式培养小室正面朝上放入六孔板的各个孔中，使附着有下层卵巢癌细胞的表面浸没于培养基中。然后，向每个插入式培养小室的孔中接种1.5毫升HPMC。然后将培养板放入细胞培养箱中孵育72小时。孵育结束后，小心地从每个孔中取出插入物，并用PBS冲洗插入物的两侧。将每个插入物放入一个新的六孔板中，在插入物的孔内加入0.5毫升胰蛋白酶，在底部的孔内加入2毫升胰蛋白酶。在37摄氏度条件下孵育两分钟后，向每个插入物中加入1毫升完全培养基，并小心地反复吹打数次，注意不要撕裂膜或使细胞悬液溢出到下方孔中。吹打时应小心操作，避免不同腔室间的细胞发生交叉污染。将重悬的细胞转移至已标记的收集管中，并加入额外的2毫升完全培养基以进一步中和胰蛋白酶。为收集插入膜底部的细胞，用六孔板对应孔中的2毫升胰蛋白酶冲洗膜底部2至3次，使脱落的细胞进入相应的孔底。待所有细胞脱落后，每孔加入6毫升新鲜培养基以中和胰蛋白酶，并将细胞悬液转移至预先标记的收集管中。随后通过离心收集全部细胞，并根据标准操作流程，每管加入0.7毫升含苯酚和硫氰酸胍的裂解试剂重悬沉淀，用于RNA的提取与分离。与未与癌细胞共培养的对照组HPMC相比，HPMC与卵巢癌细胞近距离共培养后，纤维连接蛋白及转化生长因子（TGF-β1）的表达显著升高。同时，与未与HPMC共培养的对照组卵巢癌细胞相比，卵巢癌细胞在与HPMC近距离共培养后，纤维连接蛋白和TGF-β1的表达也显著增加。相反，用HPMC条件培养基处理的卵巢癌细胞中，纤维连接蛋白的表达显著降低，而TGF-β1的表达无明显变化。然而，使用中和抗体阻断 TGF beta 1 会导致与腹膜间皮细胞（HPMCs）共培养的卵巢癌细胞中 TGF beta 1 表达显著下降。有趣的是，在对照组非邻近培养的卵巢癌细胞中，TGF beta 1 表达略有升高，可能是一种补偿性反应。与卵巢癌细胞邻近培养可轻微增加 HPMCs 中 E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达，而与 HPMCs 邻近培养的卵巢癌细胞中 E-钙黏蛋白表达则明显降低，与对照组相比进一步证明了邻近培养系统在研究卵巢癌细胞与转移部位正常细胞之间旁分泌信号传导方面的有效性。在进行该实验操作时，优化接种细胞数量以及共培养时间非常重要。完成该操作后，可进一步采用免疫印迹等其他方法，以探究肿瘤细胞与间皮细胞共培养过程中蛋白表达变化及下游信号通路激活等相关问题。该技术建立后，为肿瘤微环境、免疫学及发育生物学领域的研究人员探索细胞间通过分泌因子介导的相互旁分泌相互作用提供了重要途径。

a-proximal-culture-method-to-study-paracrine-signaling-between-cells

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

一种研究细胞间分泌信号的近距离培养方法

在本视频中，我们建立了一种卵巢癌细胞与原代人腹膜间皮细胞的近端共培养模型。这一具有生理相关性的模型可用于研究旁分泌信号传导，在防止细胞直接接触的同时，维持分泌因子的局部浓度。...

近端共培养系统：一种用于研究细胞间旁分泌信号传导的体外培养技术

我们采用了一种可渗透的微孔膜插入装置来模拟肿瘤微环境（TME）。该模型包含混合细胞培养体系，可在无需荧光标记或细胞分选的情况下，简便地获得高度富集的单一细胞群体，并允许在正常或应激条件下研究肿瘤微环境中细胞间的相互通讯。...

肿瘤微环境的模拟：一种用于富集细胞群体及研究细胞间通讯的简单方法

本文描述了一种阻力动脉的细胞培养模型，可用于解析内皮细胞、平滑肌细胞内或内皮细胞与平滑肌细胞之间（即肌内皮连接）的信号通路。利用该细胞培养模型，可选择性地应用激动剂或进行蛋白质分离、电子显微镜检测以及免疫荧光分析。...

一种阻力动脉的细胞培养模型

我们提出了一种研究X射线照射后的Caco-2细胞与外周血单个核细胞（PBMC）之间相互作用的实验方案。该方案首先对Caco-2细胞进行X射线照射，随后建立其与PBMC的共培养体系；在48小时内定期检测跨上皮电阻，并对Caco-2细胞和PBMC分别进行蛋白质印迹分析。...

一种共培养方法用于研究X射线照射的Caco-2细胞与PBMC之间的相互作用

我们提供了基于直接和间接共培养方法评估牙髓来源间充质干细胞与前列腺癌细胞相互作用的实验方案。使用条件培养基和Transwell小室膜适用于分析间接的旁分泌作用。将不同染色的细胞共同接种是研究直接细胞间相互作用的合适模型。...

从牙髓组织中分离间充质干细胞并与癌细胞共培养以研究其相互作用

本文介绍一种利用可渗透膜支持物的方法，以促进研究肿瘤细胞通过非接触性旁分泌信号抑制免疫反应的机制。该系统适用于研究肿瘤分泌因子在抑制巨噬细胞活化中的作用。...

利用可渗透膜支持物共培养研究肿瘤分泌的旁分泌配体对巨噬细胞活化的影响

我们描述了牙髓（DP）原代细胞的分离、分散和接种，并在上层的transwell小室滤膜上共培养三叉神经节（TG）神经元。可通过免疫荧光或RNA/蛋白质分析来检测DP细胞的细胞反应。利用共聚焦显微镜进行神经元标志物的免疫荧光染色，可分析神经突的生长反应。...

一种共培养方法用于研究神经突起对牙髓旁分泌信号的反应性生长

本研究概述了一种高度可重复且易于操作的方法，用于在体外研究旁分泌非经典Wnt信号事件。in...

模拟旁分泌非经典Wnt信号通路 体外

本文介绍了一种新设计的3D打印插入式装置，作为共培养模型，并通过研究内皮细胞与角质形成细胞之间的旁分泌细胞间通讯对其进行了验证。...

一种创新的3D打印插件，旨在实现简便的二维与三维细胞培养

利用操作性条件反射范式，通过播放随机点运动图和计算机生成的无脊椎动物视频来测试蜥蜴的视觉敏感性。...

测试蜥蜴对运动速度和方向的视觉敏感性

学习近距离培养方法研究细胞间旁分泌信号，使用卵巢癌细胞模型分离旁分泌与邻分泌作用。该技术可重复性强，有助于深入理解肿瘤微环境中的细胞通讯机制。

一种用于研究细胞间旁分泌信号传导的近端共培养方法

探索更多视频