用于研究肿瘤转移的无细胞与细胞肺模型

该方法有助于解答与肿瘤进展相关的关键科学问题。这种离体无细胞和有细胞肺模型能够支持原发性肿瘤随时间生长，并形成循环肿瘤细胞及转移性病灶。该技术的主要优势在于，可在较短时间内研究癌症进展过程，并支持不同类型癌细胞的生长研究。

该技术的应用可延伸至我们的个性化治疗，因为可利用患者来源的肿瘤细胞在模型中评估包括免疫细胞在内的治疗药物的疗效。首先，对大鼠进行深度麻醉。剃除胸部和腹部的毛发，并用氯己定棉签擦拭皮肤。

打开胸腔后，在膈肌右侧沿左侧肋骨前侧进行双侧开胸术。抬起肋骨，用27号针头向跳动心脏的右心室注入2毫升浓度为每毫升1000单位的肝素，以防止肺部形成血凝块。移除肋骨后，将18号针头插入左心室作为排气口以排出血液，然后用25号针头向右心室注入15毫升浓度为每毫升12.5单位的含肝素磷酸盐缓冲液（PBS）。

接下来，在甲状腺基底部切断气管，并在半奇静脉水平小心移除降主动脉以及主动脉弓处的主动脉分支。将心肺组织块从胸腔取出后，切除左右心室各一半，然后将一根定制的18号不锈钢针形导管经右心室插入主肺动脉。用2-0丝线结扎固定导管，并小心暴露右心室和右心房。

首先，在生理灌注压力（30毫米汞柱）下灌注含肝素的磷酸盐缓冲液（PBS），直至液体自由流入脱细胞装置的收集瓶中，然后通过肺动脉插管将心肺组织块连接至脱细胞装置的肺动脉端。用含肝素的PBS冲洗15分钟后，将含肝素的PBS瓶更换为含有0.15%十二烷基硫酸钠（SDS）和去离子水的瓶子，持续灌注肺组织2小时以完成脱细胞过程。脱细胞完成后，先用去离子灭菌水对肺支架灌注15分钟，随后用含1%非离子型去污剂的去离子水灌注10分钟。

最后，将瓶子更换为含有抗生素的500毫升高压灭菌PBS。以每分钟6毫升的速度运行泵，并对肺组织灌注72小时，此后无细胞肺即可立即使用。用70%乙醇喷洒泵的灌流盒，通过将氧合器的流出端连接到泵管，另一端连接至生物反应器内一段1.5英尺长的管子，完成氧合器的安装。

在生物安全柜内的无菌条件下安装生物反应器瓶。将一个三通旋塞阀连接到雌性鲁尔锁接头的头部，以控制肺动脉中的液体流动，然后将一个单向旋塞阀连接到另一个用于经气管接种细胞的雌性鲁尔锁贯通接头。在瓶外连接两英寸管路，在瓶内连接六英寸管路，以循环培养基。

准备连接生物反应器瓶与氧合器的管路。将一个公型鲁尔锁接头安装到一段两英尺长的管子上，并连接一个母型鲁尔卡口式三通以方便接入；另将公型鲁尔锁接头和母型鲁尔锁接头分别安装到两段两英尺长的管子上。加入细胞培养基，然后将生物反应器转移至培养箱中。

将氧合器管路连接至两个开口端，形成一个封闭循环生物反应器。以每分钟6毫升的流速预运行泵，使培养基充满氧合器和管路，确保管路中无气泡存在。当管路充满培养基后，关闭旋塞阀，并将氧合器从生物反应器瓶的两端拆下。

将生物反应器瓶放入生物安全柜中，使培养基通过旋塞阀，并连接肺支架的肺插管。若使用细胞化肺模型，则跳过脱细胞化步骤。收获的肺可成对地置于生物反应器中。

再次将培养基通过单向止液阀，以排除任何空气，然后用丝线将气管套管结扎固定于气管上，随后盖紧生物反应器瓶盖。将生物反应器转移至培养箱中并启动泵，运行培养基10至15分钟，以确保所有肺叶充分膨胀且肺组织形态良好。

为构建转移模型，按如下步骤修饰无细胞或有细胞肺支架。打开装有悬挂肺支架的生物反应器盖，使用鲁尔锁接头注射器将五毫升培养基经气管注入。在气管分叉处，使用持针钳将2-0丝线穿过气管。

在分叉处结扎通向右肺的气管，并通过加入培养基检查培养基是否能自由流过气管到达左肺。用 RPMI 1640 完全培养基制备 50 毫升体积的肺癌细胞（如 A549 或 H1299），细胞浓度为每毫升 200 万至 300 万个。将一个 20 毫升的鲁尔锁式注射器置于气管插管上方，并向注射器中加入 15 毫升细胞悬液。

让细胞悬液依靠重力流经肺叶。在气泡通过之前加入剩余的细胞。接种完成后，移除注射器，静置15分钟，然后向生物反应器中加入新鲜培养基。

将其放回培养箱，并在去除所有气泡后，以每分钟6毫升的速度灌注肺支架。完整肺组织的组织病理学显示肺泡和肺细胞。如图所示，脱细胞化导致肺细胞被完全去除，无细胞肺的组织病理学揭示了完整的基底膜。

脱细胞肺组织的Movat五色染色和弹性蛋白染色显示胶原蛋白、纤维蛋白和弹性蛋白的存在，且血管系统和支气管结构保持完整。脱细胞肺组织的DNA分析表明，其DNA含量减少了超过99%。该无细胞肺组织可直接用于生物反应器中进行细胞培养。组织学分析显示肿瘤生长的存在。

进行该操作时，重要的是要记住将肝素注入心脏的右心室。该技术的发展为癌症研究领域的研究人员探索导致肺癌细胞在肺部转移的遗传和表观遗传改变铺平了道路。