Name: 脱细胞和细胞肺模型研究肿瘤转移 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 了解离体脱细胞和细胞肺模型用于肿瘤转移研究的方法。该技术可在缩短时间内模拟原发肿瘤形成、循环肿瘤细胞产生及转移灶发展，为个性化癌症治疗评估提供研究平台。

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Min P. Kim 获得了美国胸外科协会第二届 John W. Kirklin 研究奖学金、Graham 研究基金会、休斯顿卫理公会专科医生集团资助项目以及 Michael M. 和 Joann H. Cone 研究奖的资助。我们感谢 Ann Saikin 对稿件的语言编辑工作。

动物实验方案已获休斯敦卫理公会&#160;研究所机构动物护理与使用委员会批准，并严格依照所有相关法规、适用法律、指南和政策执行。
1. 大鼠肺组织采集
<ol>
	<li>通过在侧腹进行腹腔注射（IP）给予4至6周龄雄性Sprague-Dawley大鼠氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）以实施麻醉。用镊子夹捏后肢脚趾，确认无运动反应以确保麻醉成功。&#160;</li>
	<li>10 分钟后，剃除胸部和腹部的毛发，并用氯己定棉签擦拭皮肤。</li>
	<li>用镊子夹起皮肤并进行切开以去除皮肤&#160;用一次性手术刀打开胸腔后。&#160;切开&#160;用手术刀行双侧开胸术，用剪刀切开左侧肋骨前缘和右侧膈肌。 
	注意：本手术为非存活性手术。</li>
	<li>握住肋骨，使用27 G针头向跳动心脏的右心室注入2 mL肝素（1,000单位/mL）。 
	注意：这将防止肺部形成任何血凝块。</li>
	<li>用剪刀完全去除肋骨笼，并将一支18 G针头插入左心室作为排气孔，直至血液流出。然后，使用25 G针头向右心室注入15 mL含肝素的磷酸盐缓冲液（12.5 单位/mL；肝素化PBS）。</li>
	<li>剪断位于心脏右侧的两条大静脉——下腔静脉和上腔静脉，并用27 G针头在右心室注入额外10 mL含肝素的PBS冲洗肺部。 
	注意：下腔静脉位于心脏底部下方，为一条充满红色血液的大血管。同样，上腔静脉位于心脏上部，也为一条大血管。</li>
	<li>在甲状腺基底部切断气管。在半奇静脉水平小心分离并移除降主动脉，以及主动脉弓的分支血管。</li>
	<li>从胸腔和大鼠其余身体中取出心肺组织块。</li>
	<li>通过切开左右心室的各一半进行心室切开术，并将一根定制的预充18 G不锈钢针套管经右心室插入主肺动脉（PA）。</li>
	<li>用2-0丝线固定套管，仔细暴露右心室和右心房。</li>
	<li>在左心室放置一个雌性鲁尔接头，并用2-0丝线结扎固定。</li>
	<li>通过肺动脉插管用20 mL含肝素的PBS冲洗心肺组织块，并将其置于含有培养基或含肝素PBS的50 mL离心管中。 
	注意：如需构建细胞模型，请转至步骤 3.1 以设置生物反应器；如需构建无细胞模型，请转至步骤 2.1 进行脱细胞处理。</li>
</ol>
2. 肺脏脱细胞
<ol>
	<li>脱细胞装置的准备
	<ol>
		<li>通过在瓶盖上钻两个孔，并将两个雌性鲁尔接头 snap 进孔中来准备每个脱细胞室/瓶（图1A 和 1B）。在另一侧用黑色尼龙环固定。类似地，在另一个瓶盖上钻一个单孔，用于连接静脉输液装置（图1C）。 
		注意：图1A 和 1B 是同一瓶盖从两个不同侧面拍摄的图像。图1C 是另一个具有单孔的瓶盖，如步骤 2.1.1 中所述。</li>
		<li>将一段 0.5 英寸的管子（连接至肺动脉或 PA 端）和一段 6 英寸的管子（图1J）从瓶盖内部连接到雌性鲁尔接头（图1A 和 1B），并在末端连接雄性鲁尔锁紧接头。将该装置与一个 500 mL 的瓶子组装，作为脱细胞室/瓶。</li>
		<li>将两段 2 英尺长的管子（两端均带有雄性鲁尔锁紧接头）的一端连接至泵管的两端（图1H），泵管通过一个带有雌性鲁尔锁紧接头的卡匣（图1G）固定在泵头（图1E 和 1F）上（图1I）。</li>
		<li>将步骤 2.1.3 中的两段 2 英尺长管子的另一端分别连接至脱细胞室/瓶盖上的雌性鲁尔锁紧接头（图1L）。</li>
		<li>准备一个装有 200 mL PBS 的 250 mL 肝素化 PBS 瓶，将其倒置悬挂在支架上，将静脉输液装置的近端插入瓶盖（图1D），远端替换连接在脱细胞室/瓶 PA 端的 2 英尺管子（图1B）。将此 2 英尺管子连接至废液瓶。 
		注意：如 图1K 所示，瓶子放置在纸板箱中。静脉输液管从悬挂的瓶子引出，用于向肺支架中输送试剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肺组织脱细胞过程
	<ol>
		<li>以 30 mm Hg 的生理灌注压力运行肝素化 PBS（图1K），直至其在脱细胞室/瓶中自由流动，然后通过肺动脉插管将心肺组织块连接至 PA 端。</li>
		<li>持续运行泵，使脱细胞室/瓶内的任何过量缓冲液/溶液被排出。</li>
		<li>以 30 mm Hg 的灌注压力通过肺动脉灌注肝素化 PBS 15 分钟，进行初步清洗（图1K）。</li>
		<li>将肝素化 PBS 瓶更换为含 0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS）的去离子水，并以该溶液灌注肺组织 2 小时，进行脱细胞处理。</li>
		<li>脱细胞完成后，通过肺支架灌注去离子灭菌水 15 分钟。</li>
		<li>随后，灌注含 1% 非离子型洗涤剂的去离子水 10 分钟。</li>
		<li>将脱细胞室/瓶更换为含 500 mL 灭菌 PBS 的瓶子，其中 PBS 添加 1x 抗生素（青霉素-链霉素-两性霉素），并将悬挂的肺组织保持完整，瓶盖置于瓶内。</li>
		<li>移除静脉输液装置，将连接至废液容器的 2 英尺管子重新接回脱细胞室的肺动脉端，并以 6 mL/min 的流速运行泵（图1L）。</li>
		<li>持续灌注肺组织 72 小时，并每隔 12 小时更换一次含抗生素的 PBS。 
		注意：无细胞肺支架已可立即使用。如需保存，可置于 -80 ˚C 冻存直至使用。若在肺叶中清晰可见粉红色斑点或血凝块，则应弃用该肺组织。可随机取样进行 DNA 检测或组织病理学分析。完全脱细胞的肺组织应无可见细胞，且 99.9% 的 DNA 应已被洗脱。 
		注意：当使用含细胞的肺模型时，跳过脱细胞步骤。收获的肺组织（步骤 1）可直接放入生物反应器中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 生物反应器设置
<ol>
	<li>准备生物反应器瓶及安装所需的物品。
	<ol>
		<li>在1个500 mL瓶盖上等距钻三个孔，并在三个孔中各固定一个雌性鲁尔接头，使用黑色尼龙环（图2A 和 2B). 
		注意：两个孔的鲁尔锁接头朝向外侧，另一个孔的接头朝向瓶内。</li>
		<li>为每个生物反应器切割一段6英寸的泵管、一段2英寸的管、一段6英寸的管、一段1.5英尺的管、一段2英尺的管，以及一段10英尺的氧合器管。</li>
		<li>剪断一根18 G不锈钢针，再次使用生物相容性管路连接两端，制成气管插管。</li>
		<li>将两端带有鲁尔锁接头的氧合器管用高压灭菌胶带缠绕固定在电磁阀金属网上图2C).</li>
		<li>将上述物品进行高压灭菌，并置于紫外光下照射10分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在常规细胞培养箱（37 °C，5% CO₂）内设置泵2）托盘之间留有适当间距，以便轻松放入一个500 mL的瓶子。</li>
	<li>将70%乙醇喷洒在泵的墨盒上，并使用两端带雌性鲁尔锁接头的泵管连接泵。</li>
	<li>在细胞培养孵育箱内，将氧合器缠绕在螺线管金属网周围，一端（流出端）连接至蠕动泵管，另一端通过1.5英尺长的管路连接至生物反应器。</li>
	<li>在生物安全柜内的无菌条件下安装生物反应器瓶。
	<ol>
		<li>将一个三通旋塞阀（黄色）连接至其中一根雌性鲁尔接头的头部，以控制通过 PA 的液体流动。</li>
		<li>将一个单向止流阀（蓝色）连接至另一个用于通过气管接种细胞的雌性鲁尔锁紧式贯通接头图 2F).</li>
		<li>将瓶外侧连接2英寸管路（白色），内侧连接6英寸管路，以实现培养基的循环。将一个公型鲁尔锁接头连接至2英尺长的管路，并连接一个母型鲁尔卡箍式三通接头，以便于添加或移除物品。</li>
		<li>将一个单向止流阀连接到三通接头（雌性鲁尔接头式三通）的一个开口上。</li>
		<li>将公型鲁尔锁和母型鲁尔锁分别连接至2英尺长的管子上。</li>
		<li>加入200 mL含10% FBS和1%抗生素的RPMI1640细胞培养基（根据细胞需求可调整），并将生物反应器转移至培养箱中。将氧合器管路连接至两个开放端口（单向止流阀和三通连接器），以形成闭路循环生物反应器。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在细胞培养孵育箱内以6 mL/min的流速用细胞培养基预运行泵，以填充氧合器和管路，确保管路中无气泡存在。</li>
	<li>待培养管加满培养基后，关闭旋塞阀，通过断开生物反应器瓶两端的氧合器，将生物反应器瓶从培养箱中取出。</li>
	<li>将生物反应器瓶放入生物安全柜中，使培养基通过旋塞阀，并通过公鲁尔接头将肺支架（去细胞或细胞化）的PA套管连接至旋塞阀。 
	注意：此处可使用无细胞模型（经脱细胞处理后）或新鲜收获的心肺组织块即，该细胞模型保留了大鼠的原代细胞。</li>
	<li>将培养基通过单向止流阀以排除其中的空气，并用丝线将气管插管结扎固定于气管上。</li>
	<li>确保避免肺动脉和气管发生扭曲。将含有肺支架的生物反应器瓶盖拧紧，并再次以无菌操作将生物反应器转移至培养箱中，启动泵，流速设为6 mL/min。</li>
	<li>运行培养基 10–15 分钟，以确保所有肺叶充分膨胀且肺组织形态良好（图2G).</li>
</ol>
4. 转移模型与细胞接种
注意：使用上述肺模型进行细胞接种，以开展原发性肿瘤生长研究。为构建转移模型，需对肺支架（无细胞或有细胞）进行如下修改。
<ol>
	<li>从培养箱中取出带有肺支架的生物反应器，并将其放入生物安全柜中。</li>
	<li>使用鲁尔锁接头注射器将5 mL培养基通过气管，并打开带有悬挂肺支架的生物反应器盖（图2F）。</li>
	<li>在此步骤中，需要另一名人员协助完成将肺组织改造为转移模型的操作。</li>
	<li>准备好2-0丝线，并使用持针钳在气管分叉处穿线。</li>
	<li>在分叉点处结扎通向右肺的气管，并通过注入培养基检查培养基是否能自由流经气管进入左肺。 
	注意：一旦在分叉点处结扎气管，经气管接种的细胞将自动导向左肺叶。可在接种细胞前通过推动培养基来测试该通路。在转移模型中，培养基仅流向左肺叶并使其膨胀，而不会进入右肺叶10。</li>
	<li>将一个20 mL鲁尔锁接头注射器连接至气管插管上方，并加入ATCC肺癌细胞（A549、H1299）于50 mL RPMI1640完全培养基中（图2F）。</li>
	<li>在生物安全柜内进行细胞接种。向注射器中加入15 mL细胞悬液，使其依靠重力流经肺叶。在气泡通过前，将剩余细胞全部加入。</li>
	<li>在无细胞肺支架接种过程中，收集从生物反应器瓶中滴下的灌注培养基，并通过注射器将其再次经气管回流，重复3次。 
	注意：灌注培养基中有时含有已接种的癌细胞。因此，为了实现高效接种，应将培养基重新通过注射器注入气管。</li>
	<li>接种完成后，移除注射器，静置15分钟，加入新鲜培养基，然后将生物反应器放回培养箱。同时清除管道中的任何气泡。</li>
	<li>启动泵，以6 mL/min的速度进行培养基灌注。</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Statistics%2C+2017%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer Statistics, 2017.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 67 (1), 7-30 (2017).</li>
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<li>Mishra, D. K., Miller, R. A., Pence, K. A., Kim, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+cell+and+non+small+cell+lung+cancer+form+metastasis+on+cellular+4D+lung+model%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Small cell and non small cell lung cancer form metastasis on cellular 4D lung model.</a> BMC Cancer. 18 (1), 441(2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这 离体 4-D 肺为在实验室环境中研究肿瘤生长和转移提供了机会。天然肺基质是一种复杂系统，可为正常组织提供支持，并维持细胞间相互作用、细胞与基质间的相互作用、细胞分化及组织结构。该模型允许添加任意肿瘤微环境组分，以研究这些组分对肿瘤生长的影响及其与其他细胞的相互作用。 
肺组织的获取是构建ex vivo 4-D肺模型的关键步骤。在打开胸腔后若延迟注射肝素，可能导致肺部形成血凝块，从而影响脱细胞过程中试剂的自由流动。使用含肝素的PBS充分灌注，直至流出液变为无色，这一步骤尤为重要，特别是在构建细胞模型时。需小心剪开上腔静脉，以避免损伤肺动脉（PA）。在脱细胞过程中，必须避免气泡进入肺支架。气泡的存在可能减缓或阻断试剂的流动，导致脱细胞不充分。可通过使用10–20 mL注射器抽吸的方式去除气泡。必须确保肺动脉插管未发生扭曲。在生物反应器组装过程中，若管路发生扭曲，可能导致连接处弹开，从而在培养箱内造成严重污染。为避免插管扭曲，可将插管或针头切断后使用生物相容性管路重新连接，以提供必要的灵活性，使插管旋转时不会影响连接稳定性。若培养基在培养箱内发生泄...

癌症转移是导致大多数癌症相关死亡的原因，也是抗癌斗争中的最终挑战。本方法的总体目标是设计一种四维（4-D）细胞培养方案，该培养体系在三维（3-D）细胞生长的基础上增加流动维度。该模型可表征转移过程的三个不同阶段[即原发性肿瘤、循环肿瘤细胞（CTCs）和转移病灶
在过去三十年中，全球科学家获得了前所未有的信息，以揭示不同癌症转移进展背后的机制，从而改善了治愈前景或无进展生存率。某些癌症（如乳腺癌）的临床管理已显著改善1；然而，其他一些癌症（如肺癌）的生存率仍然较低2。体外和体内动物模型在揭示疾病发生机制方面发挥了重要作用。近年来，细胞系来源的异种移植模型（CDX）和患者来源的异种移植模型（PDX）受到更多关注，因为它们保留了原发性人类肿瘤的许多相关特征3，例如生长动力学、组织学特征、行为特性以及对治疗的反应。然而，每种模型在理解循环肿瘤细胞（CTC）形成及向远端器官转移的机制方面均存在局限性4,5,6。
最近，我们开发了一种4-D 离体 利用器官重构和基于灌注的细胞培养技术构建肺癌模型。该模型通过形成可灌注的肿瘤结节，模拟人类肺癌的生长过程，这些结节随时间推移持续生长，并产生与人类癌症相似的分泌蛋白7它代表了一种基因表达特征，可预测癌症患者的不良生存预后，并在顺铂治疗后表现出通过肿瘤消退实现的治疗反应。8,9肺模型进一步经过改造，使其能够形成转移性病灶。循环肿瘤细胞（CTCs）起源于原发性肿瘤，侵入血管系统后，穿出至对侧组织&#160;肺部形成转移性病灶10基因表达研究表明，原发性肿瘤、循环肿瘤细胞（CTCs）和转移病灶具有不同的表达谱，且与表型相关的基因亚群出现上调10。这种转移过程的发生是由于癌症患者体内存在的生物学条件所致。该模型的优势在于具有天然的基质和结构，以及营养物质的灌注，从而促进肿瘤结节的形成。此外，它还为研究肿瘤微环境中的不同组分或药物随时间推移对肿瘤进展的影响提供了机会。该模型可用于培养多种癌细胞（肺癌、乳腺癌、肉瘤） 等等。在实验室设置中。

<table><tbody><tr><td>斯普拉格-道利大鼠</td><td>Harlan</td><td>206M</td><td>雄性</td></tr><tr><td>氯己定消毒棉片</td><td>Prevantics，美国纽约</td><td>NDC 10819-1080-1</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sagent Pharmaceuticals，美国伊利诺伊州绍姆堡</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>18号针头</td><td>McMaster Carr，美国</td><td>75165A249</td><td></td></tr><tr><td>2-0 丝线结扎线</td><td>Ethicon，美国德克萨斯州圣安吉洛</td><td>A305H</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 泵</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>EW-07554-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 泵头</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>EW-07519-05</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 泵管卡盒</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>EW-07519-70</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>14171211</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex 泵管</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>06598-16</td><td></td></tr><tr><td>雌性鲁尔锁接头</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>45508-34</td><td>75165A249</td></tr><tr><td>雄性鲁尔锁接头</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>45513-04</td><td></td></tr><tr><td>黑色尼龙环</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>EW-45509-04</td><td></td></tr><tr><td>静脉输液装置</td><td>CareFusion</td><td>41134E</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>CAS151-21-3</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-1L</td><td></td></tr><tr><td>抗生素</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>硅胶氧合器</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>ABW00011</td><td>Saint-GoBain-</td></tr><tr><td>金属丝网</td><td>1164610105</td><td>Lowes</td><td>New York Wire</td></tr><tr><td>雌性鲁尔螺纹式三通接头</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>45508-56</td><td></td></tr><tr><td>带整体锁环的雄性鲁尔接头转200系列卡套</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>45518-08</td><td></td></tr><tr><td>雌性鲁尔螺纹式连接器</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>45508-22</td><td></td></tr><tr><td>Clave 连接器</td><td>ICU Medical</td><td>11956</td><td></td></tr><tr><td>Hi-Flo &amp;trade;四通旋塞阀，带旋转式雄性鲁尔锁</td><td>smith Medical</td><td>MX9341L</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex 泵管</td><td>Cole-Parmer，美国伊利诺伊州弗农山</td><td>06598-13</td><td>用于插管</td></tr></tbody></table>

用于研究肿瘤转移的无细胞与细胞肺模型

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

在肿瘤进展的不同阶段分离肿瘤细胞具有较大难度。我们构建了一种ex vivo肺部模型，能够展示肿瘤细胞与天然基质之间的相互作用以及营养物质的持续流动；同时还构建了另一种模型，用于展示肿瘤细胞与正常细胞组分及天然基质之间的相互作用。无细胞ex vivo肺模型通过分离大鼠心肺组织块，并利用脱细胞化过程去除所有细胞而制备。将右侧主支气管结扎后，通过注射器将肿瘤细胞注入气管，细胞会迁移并定植于左肺。随后将肺组织置于生物反应器中，使肺动脉在闭合回路中持续接收培养基灌注。在左肺上生长的肿瘤为原发性肿瘤；在循环培养基中分离到的肿瘤细胞为循环肿瘤细胞，而右侧肺中的肿瘤细胞则代表转移病灶。细胞化ex vivo肺模型则通过省略脱细胞化步骤制备。这两种模型可用于回答不同的科研问题。

从大鼠收获的肺保持了完整的血管系统和肺泡11 (图3A 和 3B）。脱细胞后，无细胞肺的细胞外基质成分（如胶原蛋白、纤连蛋白和弹性蛋白）得以保留11 (图3C, 三维, 3E，以及 3F）。脱细胞化可完全去除肺组织中固有的大鼠细胞，这一点可通过苏木精-伊红（H&E）染色观察到&amp;E) 染色显示无细胞存在，并通过DNA分析证实11 显示DNA量减少（图 3D 和 3G）。该 离体 4-D 肺模型可用于培养任何类型的贴壁细胞12</...

本文介绍了一种模拟肿瘤进展过程的ex vivo肺癌模型方案，该模型有助于分离原发性肿瘤、循环肿瘤细胞以及转移性病灶。

在肿瘤进展的不同阶段分离肿瘤细胞十分困难。我们构建了一种离体肺模型，该模型能够展示肿瘤细胞与……之间的相互作用

该方法有助于解答与肿瘤进展相关的关键科学问题。这种离体无细胞和有细胞肺模型能够支持原发性肿瘤随时间生长，并形成循环肿瘤细胞及转移性病灶。该技术的主要优势在于，可在较短时间内研究癌症进展过程，并支持不同类型癌细胞的生长研究。该技术的应用可延伸至我们的个性化治疗，因为可利用患者来源的肿瘤细胞在模型中评估包括免疫细胞在内的治疗药物的疗效。首先，对大鼠进行深度麻醉。剃除胸部和腹部的毛发，并用氯己定棉签擦拭皮肤。打开胸腔后，在膈肌右侧沿左侧肋骨前侧进行双侧开胸术。抬起肋骨，用27号针头向跳动心脏的右心室注入2毫升浓度为每毫升1000单位的肝素，以防止肺部形成血凝块。移除肋骨后，将18号针头插入左心室作为排气口以排出血液，然后用25号针头向右心室注入15毫升浓度为每毫升12.5单位的含肝素磷酸盐缓冲液（PBS）。接下来，在甲状腺基底部切断气管，并在半奇静脉水平小心移除降主动脉以及主动脉弓处的主动脉分支。将心肺组织块从胸腔取出后，切除左右心室各一半，然后将一根定制的18号不锈钢针形导管经右心室插入主肺动脉。用2-0丝线结扎固定导管，并小心暴露右心室和右心房。首先，在生理灌注压力（30毫米汞柱）下灌注含肝素的磷酸盐缓冲液（PBS），直至液体自由流入脱细胞装置的收集瓶中，然后通过肺动脉插管将心肺组织块连接至脱细胞装置的肺动脉端。用含肝素的PBS冲洗15分钟后，将含肝素的PBS瓶更换为含有0.15%十二烷基硫酸钠（SDS）和去离子水的瓶子，持续灌注肺组织2小时以完成脱细胞过程。脱细胞完成后，先用去离子灭菌水对肺支架灌注15分钟，随后用含1%非离子型去污剂的去离子水灌注10分钟。最后，将瓶子更换为含有抗生素的500毫升高压灭菌PBS。以每分钟6毫升的速度运行泵，并对肺组织灌注72小时，此后无细胞肺即可立即使用。用70%乙醇喷洒泵的灌流盒，通过将氧合器的流出端连接到泵管，另一端连接至生物反应器内一段1.5英尺长的管子，完成氧合器的安装。在生物安全柜内的无菌条件下安装生物反应器瓶。将一个三通旋塞阀连接到雌性鲁尔锁接头的头部，以控制肺动脉中的液体流动，然后将一个单向旋塞阀连接到另一个用于经气管接种细胞的雌性鲁尔锁贯通接头。在瓶外连接两英寸管路，在瓶内连接六英寸管路，以循环培养基。准备连接生物反应器瓶与氧合器的管路。将一个公型鲁尔锁接头安装到一段两英尺长的管子上，并连接一个母型鲁尔卡口式三通以方便接入；另将公型鲁尔锁接头和母型鲁尔锁接头分别安装到两段两英尺长的管子上。加入细胞培养基，然后将生物反应器转移至培养箱中。将氧合器管路连接至两个开口端，形成一个封闭循环生物反应器。以每分钟6毫升的流速预运行泵，使培养基充满氧合器和管路，确保管路中无气泡存在。当管路充满培养基后，关闭旋塞阀，并将氧合器从生物反应器瓶的两端拆下。将生物反应器瓶放入生物安全柜中，使培养基通过旋塞阀，并连接肺支架的肺插管。若使用细胞化肺模型，则跳过脱细胞化步骤。收获的肺可成对地置于生物反应器中。再次将培养基通过单向止液阀，以排除任何空气，然后用丝线将气管套管结扎固定于气管上，随后盖紧生物反应器瓶盖。将生物反应器转移至培养箱中并启动泵，运行培养基10至15分钟，以确保所有肺叶充分膨胀且肺组织形态良好。为构建转移模型，按如下步骤修饰无细胞或有细胞肺支架。打开装有悬挂肺支架的生物反应器盖，使用鲁尔锁接头注射器将五毫升培养基经气管注入。在气管分叉处，使用持针钳将2-0丝线穿过气管。在分叉处结扎通向右肺的气管，并通过加入培养基检查培养基是否能自由流过气管到达左肺。用 RPMI 1640 完全培养基制备 50 毫升体积的肺癌细胞（如 A549 或 H1299），细胞浓度为每毫升 200 万至 300 万个。将一个 20 毫升的鲁尔锁式注射器置于气管插管上方，并向注射器中加入 15 毫升细胞悬液。让细胞悬液依靠重力流经肺叶。在气泡通过之前加入剩余的细胞。接种完成后，移除注射器，静置15分钟，然后向生物反应器中加入新鲜培养基。将其放回培养箱，并在去除所有气泡后，以每分钟6毫升的速度灌注肺支架。完整肺组织的组织病理学显示肺泡和肺细胞。如图所示，脱细胞化导致肺细胞被完全去除，无细胞肺的组织病理学揭示了完整的基底膜。脱细胞肺组织的Movat五色染色和弹性蛋白染色显示胶原蛋白、纤维蛋白和弹性蛋白的存在，且血管系统和支气管结构保持完整。脱细胞肺组织的DNA分析表明，其DNA含量减少了超过99%。该无细胞肺组织可直接用于生物反应器中进行细胞培养。组织学分析显示肿瘤生长的存在。进行该操作时，重要的是要记住将肝素注入心脏的右心室。该技术的发展为癌症研究领域的研究人员探索导致肺癌细胞在肺部转移的遗传和表观遗传改变铺平了道路。

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科研

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