Name: 同位素稀释-高效液相色谱-抗生素在危重症患者中的多重治疗药物监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学习使用高效液相色谱-串联质谱法对重症患者进行抗生素治疗药物监测的方法。该方案可定量检测头孢吡肟、美罗培南、环丙沙星、莫西沙星、利奈唑胺和哌拉西林，支持临床剂量调整。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

作者感谢 Schütze 博士在建立本方法过程中提供的帮助，以及 Zoller 博士在合理校准范围方面提出的宝贵建议。作者同时感谢质谱平台的技术人员。

注意：处理甲醇等有机溶剂时，建议在通风橱中操作。所有缓冲液和流动相均需使用容量瓶配制。除非另有说明，溶液在配制后可在室温下保存最多1个月。
1. 校准品和质控样品的制备
注意：用于配制储备液和加标溶液的相应数据分析表见补充文件。为确保可追溯性，需在相应列中填入每种抗生素的生产厂家、目录号和批号。所有抗生素均应于4 °C 冷藏条件下溶解，并尽量缩短操作时间。
<ol>
	<li>配制100 mL 25%甲醇水溶液：取25 mL无水甲醇加入100 mL容量瓶中，再加蒸馏水定容至100 mL。</li>
	<li>配制10 mL 200 mM乙酸水溶液：将9 mL HPLC级水加入10 mL容量瓶中，然后加入 115 µL 加入冰醋酸（99.5% 纯度，17.4 M），再加蒸馏水至 10 mL。</li>
	<li>配制25 mL含20 mM乙酸的25%甲醇水溶液：取2.5 mL 200 mM乙酸水溶液加入25 mL容量瓶中，加入6.25 mL无水甲醇，再用蒸馏水定容至25 mL。</li>
	<li>使用精密天平在15 mL锥形管中称取适量抗生素，具体方法如所述 补充文件 在柱中 初始体重.</li>
	<li>配制氟喹诺酮类药物环丙沙星和莫西沙星的储备液，溶剂为含20 mM乙酸的25%甲醇-水溶液。具体操作为，按照下文所述，将相应体积的溶剂加入称重后的药物样品中。 补充文件 在“最终体积”一栏中。将氟喹诺酮类抗生素在超声波水浴中快速溶解2分钟，并通过剧烈涡旋混合。</li>
	<li>在25%甲醇-水溶液中配制头孢吡肟、美罗培南、利奈唑胺和哌拉西林的储备液。具体操作如下：根据下文所述，将相应体积的溶剂加入称量好的各药品中 补充文件 在柱中 最终体积 通过剧烈涡旋快速溶解抗生素。最后溶解美罗培南。</li>
	<li>按照所述方法混合所有抗生素的储备液 相应体积的储备液 图表在 补充文件 以制备十倍浓缩的刺突蛋白溶液。</li>
	<li>将九份未含药物的血清与一份十倍浓缩的加标溶液混合，以制备血清校准品 0–7 和质控品（QC）A–D。例如，在一个 10 mL 聚丙烯管中，向 4.5 mL 血清加入 0.5 mL 加标溶液，于冷藏条件下孵育 15 分钟 4 °C 在50 rpm的滚轴混合器上。</li>
	<li>使用重复移液器生成 100 µL 校准品和质控品的等分试样置于1.5 mL聚丙烯管中。</li>
	<li>将校准品、质控品和抗生素储备液保存在 -80 °C 长达六个月。</li>
	<li>针对每种抗生素，还需配制含有单一抗生素浓度为 1,000 mg/L 的纯净溶液。使用适当的稀释液对相应的储备液进行稀释（例如，对于环丙沙星，使用含20 mM乙酸的25%甲醇-水溶液。 
	注意：仅用于仪器调谐的纯净抗生素溶液。</li>
</ol>
2. 内标混合液的制备
注意：内标物是目标分析物的同位素标记对应物，在样品前处理过程中添加至样品中。由于内标物与其非标记对应物具有几乎相同的整体理化性质，因此可校正特定样品的基质效应。
<ol>
	<li>在10 mL的锥形瓶中加入5 mL纯甲醇，再用蒸馏水定容至10 mL，配制10 mL的50%甲醇水溶液。</li>
	<li>配制含20 mM乙酸的10 mL 50%甲醇水溶液：向10 mL容量瓶中加入1 mL 200 mM乙酸溶液，再加入5 mL纯甲醇，最后用蒸馏水定容至10 mL。</li>
	<li>直接在制造商提供的样品瓶中配制浓度为1,000 mg/L的内标物（IS）储备液。将硫酸头孢吡肟-13C12D3溶于蒸馏水中；美罗培南-D6、利奈唑胺-D3和哌拉西林-D5溶于50%甲醇水溶液中；环丙沙星-D8溶于含20 mM乙酸的50%甲醇水溶液中；盐酸莫西沙星-13C1D3溶于含20 mM乙酸的蒸馏水中。</li>
	<li>将上述内标储备液转移至1.5 mL聚丙烯管中，配制成五倍浓度的内标混合液。向965 µL 25%甲醇水溶液中加入10 µL头孢吡肟-13C12D3、10 µL美罗培南-D6、1 µL环丙沙星-D8、2 µL盐酸莫西沙星-13C1D3、2 µL利奈唑胺-D3和10 µL哌拉西林-D5。</li>
	<li>将内标储备液及五倍浓度的内标混合液于-80 °C条件下保存。</li>
</ol>
3. 患者样本储存
注意：应尽快获取血清，并保持冷冻样本的冷链完整。
<ol>
	<li>用血清采集管收集全血。</li>
	<li>将血液在室温下静置凝固 20–30 分钟。</li>
	<li>以 2,000 × g 离心 10 分钟，分离血清。</li>
	<li>将上清液转移至洁净的聚丙烯管中。</li>
	<li>将血清在 -80 °C 下保存，最长可保存六个月，直至进行检测。或者，样品可在 -20 °C 下保存最多 3 天。</li>
</ol>
4. 层析缓冲液的制备
<ol>
	<li>配制1 M甲酸铵水溶液：称取6.306 g甲酸铵，加入100 mL高效液相色谱级水中，使用100 mL锥形瓶振荡溶解。溶液可于4 °C保存最多1个月。</li>
	<li>配制流动相A [水中含10 mM甲酸铵-甲酸（99.9:0.1 v/v）]。取一1,000 mL容量瓶，预先加入约500 mL高效液相色谱级水，加入1 mL甲酸和10 mL 1 M甲酸铵溶液，再用高效液相色谱级水定容至1,000 mL。将流动相A转移至洁净玻璃瓶中，并连接至高效液相色谱系统。流动相A可在室温下保存最多2周。</li>
	<li>配制流动相B。将高效液相色谱级无水甲醇转移至洁净玻璃瓶中，并连接至高效液相色谱系统。</li>
	<li>以无水甲醇作为进样针清洗溶剂，将相应管路连接至盛有流动相B的玻璃瓶。</li>
	<li>配制密封圈冲洗溶剂（甲醇-水-甲酸，7:92.9:0.1, v/v/v）。取一1,000 mL容量瓶，预先加入约500 mL蒸馏水，加入70 mL无水甲醇和1 mL甲酸，再用蒸馏水定容至1,000 mL。将该溶剂转移至洁净玻璃瓶中，并连接至高效液相色谱系统。 
	注意：不同自动进样系统可能需要强洗和弱洗两种进样针清洗溶剂。若如此，请根据仪器制造商的建议配制清洗液。例如，强洗液可使用甲醇-水-异丙醇（70:20:10, v/v/v），弱洗液可使用水-甲醇（95:5, v/v）。</li>
</ol>
5. 仪器调谐
注意：此步骤用于在特定质谱仪上建立该方法的设置。
<ol>
	<li>根据检测器信号强度，用流动相 A 和 B 的混合液（50:50，v/v）将 1,000 mg/L 的纯分析物和内标溶液稀释 1:10 或 1:100。使用自动调谐功能对质谱仪进行调谐，或手动调整以下母离子-子离子跃迁14：头孢吡肟（481.0 &gt; 167.0/395.7）、13C12D3标记头孢吡肟（485.1 &gt; 167.1/400.0）、美罗培南（384.1 &gt; 114.0/141.0）、D6标记美罗培南（390.1 &gt; 114.0/147.2）、环丙沙星（332.0 &gt; 231.0/245.0）、D8标记环丙沙星（340.1 &gt; 235.1/249.3）、莫西沙星（402.0 &gt; 261.0/383.9）、13C1D3标记莫西沙星（406.1 &gt; 265.1/388.0）、利奈唑胺（338.0 &gt; 235.0/296.0）、D3标记利奈唑胺（341.1 &gt; 235.1/297.1）、哌拉西林（518.0 &gt; 143.0/358.9）以及 D5标记哌拉西林（523.1 &gt; 142.8/364.1）。</li>
	<li>对于具备自动调谐功能的仪器，使用自动调谐功能通过检测器自动调节质谱进样口的电压和设置。</li>
	<li>对于需手动调谐的仪器，调节各项参数（例如，碰撞电压和碰撞能量），直至每种母离子和子离子在检测器处获得最佳（通常为最大）信号强度。例如，连接混合三通接头，以 0.5 mL/min 的流速输送流动相 A 和 B（50:50，v/v），并以 0.1 mL/min 的流速持续注入纯抗生素或内标溶液。</li>
</ol>
6. HPLC-MS/MS 设置
注意：质谱仪、高效液相色谱系统（包括自动进样器）及其相应软件的功能取决于制造商。应根据制造商的建议调整质谱仪参数和清洗程序。
<ol>
	<li>将质谱仪参数保存在相应的“MS tune文件”中。对所有分析物均采用正离子模式电喷雾电离（ESI+）。根据所用仪器调整离子源设置（例如，毛细管电压1.5 kV，源温度120 °C，去溶剂化温度400 °C，去溶剂化气体流速600 L/h，射频透镜电压0.1 V，驻留时间80 ms）。</li>
	<li>在“MS文件”中设定分析物及内标物的调谐参数（例如，毛细管电压、碰撞能量）。</li>
	<li>在上述“inlet文件”中设置自动进样器条件如下：样品温度10 °C，允许偏差±5 °C；清洗程序为1次吹扫-清洗-吹扫，吹扫体积置换量为600 µL。</li>
	<li>在上述“inlet文件”中，设置流速为0.4或0.5 mL/min，运行时间为4 min，压力上限为345 bar，柱温为30 °C，允许偏差±5 °C。添加流动相A和B的溶剂名称，并分别设置为7% B/93% A。</li>
	<li>在“inlet文件”中按如下程序设置色谱梯度：0.00–0.10 min为7%流动相B/93% A，0.11–0.60 min为65%流动相B/35% A，0.61–2.10 min为95%流动相B/5% A，2.11–4.00 min为7%流动相B/93% A。 
	注：按照美国药典&lt;621&gt;色谱法指南16中所述方法，计算系统外体积、仪器平台的死体积以及分析物的保留因子。</li>
</ol>
7. 样品检测主文件
注意：使用“样本检测主文件”可指定患者样本，启动 HPLC-MS/MS 分析并进行数据评估。系统将生成两个独立的模板文件，每个文件包含一对低浓度和高浓度质控样本；其中一个模板包含质控样本对 A 和 C，另一个包含质控样本对 B 和 D。
<ol>
	<li>创建一个新的“样品测量主文件”。选择上述的“质谱调谐文件”、“质谱文件”和“进样口文件”（第6节），将它们插入到每个样品行中，并设定进样体积为15 µL。</li>
	<li>按升序添加校准品0–7以及质控对A/C或质控对B/D的“样品文本”。</li>
	<li>指定样品类型。将校准品的样品类型设为“标准品”，质控对的样品类型设为“QC”。</li>
	<li>指定每种抗生素物质在相应校准品和质控样品中的浓度（参见电子表格中浓度[µg/mL] Cal 7–Cal 0，QC A/C 或 B/D）。</li>
	<li>编写“数据评估方法”。使用在仪器调谐过程中已优化的离子跃迁参数（第5节）。将每种抗生素与其相应的同位素标记内标进行匹配（例如，美罗培南 - 美罗培南-D6）。</li>
</ol>
8. 样品纯化及高效液相色谱-串联质谱分析
注意：每个样本批次均需处理和分析一组配对的质量控制样本，包含低浓度和高浓度抗生素样本（QC A/C 或 QC B/D）。在不同批次之间，配对的质量控制样本采用交替顺序使用（例如，第1天，选择“样本测量主文件 包括质控样本对 A/C；第 2 天选择包含质控样本对 B/D 的样本。血清样本的处理流程如图所示 图1.
<ol>
	<li>配制沉淀剂：10% 甲基-叔丁基醚甲醇溶液（体积比 10:90）（例如，在 25 mL 容量瓶中预先加入 2.5 mL 甲基-叔丁基醚，再用无水甲醇定容至 25 mL）。</li>
	<li>将 C8 反相色谱柱装入色谱柱温箱中，并按照流动相流向将其连接至高效液相色谱仪（HPLC）和质谱仪。</li>
	<li>生成样品列表。打开相应的“样品检测主文件”模板，将待处理的患者样品添加至列表中。每组最多包含 20 个患者样品，并在其前后各加入一对相应的质控样品。</li>
	<li>使用“进样控制文件”软件对 HPLC 系统进行润洗预启动：将“润洗预启动”功能设置为流动相 A 和 B 各占 50%，以 1 mL/min 的流速润洗 2 分钟。</li>
	<li>清洗进样器。在控制软件中执行 6 次 600 µL 的活塞冲程操作。</li>
	<li>平衡 C8 反相色谱柱。通过软件启动“进样控制文件”中的流动相，以 0.5 mL/min 的流速用含 7% 流动相 B 和 93% 流动相 A 的溶液冲洗色谱柱至少 5 分钟，并确认柱温维持在 30 °C。</li>
	<li>解冻患者样品、一份校准品（0–7 号）以及一对质控样品（A/B 或 C/D）。</li>
	<li>使用多通道移液器，在 1.5 mL 聚丙烯管中向 100 µL 校准品、质控样品或患者血清中加入 25 µL 内标混合液，随后涡旋震荡数秒。</li>
	<li>将混合物置于台式振荡器上，在室温下孵育 5 分钟（例如，转速为 1,200 rpm）。</li>
	<li>使用多通道移液器，向样品与内标混合液中加入 150 µL 沉淀试剂。</li>
	<li>再次涡旋震荡数秒，并在室温下于台式振荡器上孵育 5 分钟（例如，转速为 1,200 rpm）。</li>
	<li>将悬浮液在台式离心机中以 20,000 × g 离心 10 分钟，温度设置为 4 °C。</li>
	<li>用 HPLC 级水将上清液按 1:3 比例稀释，转移至带微插管的玻璃小瓶中，并作为已处理样品加载至自动进样器。</li>
	<li>在“样品检测控制文件”中手动启动 HPLC-MS/MS 分析。 
	注意：若需长期保存，应根据制造商建议彻底冲洗分析柱（例如，以 0.5 mL/min 流速使用甲醇-水溶液（50:50, v/v）冲洗），以防止固定相塌陷。</li>
</ol>
<img alt="包含离心和涡旋处理的四步样品制备示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58148/58148fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：样品净化过程的示意图。 在高离心力下进行蛋白质沉淀可形成致密的沉淀物和澄清的上清液，表明蛋白质沉淀完全。整个处理过程约需30分钟，包括样品净化、色谱分离和串联质谱（MS/MS）分析。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58148/58148fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
9. 质量评估与定量
<ol>
	<li>处理样品时，打开相应的“样本测量控制文件，选择校准品、质控品和患者样本，并使用“抗生素定量方法 </li>
	<li>检查特定分析物的峰是否已正确积分。对每个校准品、质控品和患者样本的峰进行查看，必要时在基线处手动重新积分。</li>
	<li>研究标准曲线，并检查其是否满足以下质量标准：a）在整个校准范围内具有线性，b）校准系数 r2 &gt; 0.995，c）每个校准标准品的偏差应在标称值的±15%以内，定量下限（LLOQ）除外，其要求为±20%。</li>
	<li>拒绝不符合上述标准的校准品，并重新评估校准曲线，包括回归分析。</li>
	<li>研究质量控制，检查偏差是否在标称值的±15%范围内。</li>
	<li>如果患者样本的浓度超过最高校准品的浓度，用蒸馏水将样本稀释至多1:5例如, 100 µL 血清加 400 µL 在样品净化前加入适量蒸馏水。针对该特定样品重新执行步骤 8.8–8.14，并重新处理。</li>
</ol>

<ol><li>Fleischmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Global+Incidence+and+Mortality+of+Hospital-treated+Sepsis.+Current+Estimates+and+Limitations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 193 (3), 259-272 (2016).</li>
<li>Dellinger, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+Sepsis+Campaign%3A+international+guidelines+for+management+of+severe+sepsis+and+septic+shock%2C+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Intensive+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Surviving Sepsis Campaign: international guidelines for management of severe sepsis and septic shock, 2012.</a> Intensive Care Medicine. 39 (2), 165-228 (2013).</li>
<li>Lodise, T. P., Drusano, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+pharmacodynamics%3A+optimal+antimicrobial+therapy+in+the+intensive+care+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Care+Clinics%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and pharmacodynamics: optimal antimicrobial therapy in the intensive care unit.</a> Critical Care Clinics. 27 (1), 1-18 (2011).</li>
<li>Macedo, R. S., Onita, J. H., Wille, M. P., Furtado, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+antimicrobial+drugs+in+intensive+care+unit+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and pharmacodynamics of antimicrobial drugs in intensive care unit patients.</a> Shock. 39, Suppl 1. 24-28 (2013).</li>
<li>Petersson, J., Giske, C. G., Eliasson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+dosing+of+piperacillin+and+meropenem+fail+to+achieve+adequate+plasma+concentrations+in+ICU+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Anaesthesiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Standard dosing of piperacillin and meropenem fail to achieve adequate plasma concentrations in ICU patients.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 60 (10), 1425-1436 (2016).</li>
<li>Abdul-Aziz, M. H., Lipman, J., Mouton, J. W., Hope, W. W., Roberts, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+pharmacokinetic%2Fpharmacodynamic+principles+in+critically+ill+patients%3A+optimizing+efficacy+and+reducing+resistance+development%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Applying pharmacokinetic/pharmacodynamic principles in critically ill patients: optimizing efficacy and reducing resistance development.</a> Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 36 (1), 136-153 (2015).</li>
<li>Imani, S., Buscher, H., Marriott, D., Gentili, S., Sandaradura, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Too+much+of+a+good+thing%3A+a+retrospective+study+of+beta-lactam+concentration-toxicity+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Too much of a good thing: a retrospective study of beta-lactam concentration-toxicity relationships.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 72 (10), 2891-2897 (2017).</li>
<li>Ventola, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibiotic+resistance+crisis%3A+part+1%3A+causes+and+threats%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacy+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats.</a> Pharmacy & Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).</li>
<li>World Health Organization. Global Action Plan on Antimicrobial Resistance. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/antimicrobial-resistance/global-action-plan/en">http://www.who.int/antimicrobial-resistance/global-action-plan/en</a> (2015).</li>
<li>Pulcini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+stewardship%3A+update+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Antibiotic stewardship: update and perspectives.</a> Clinical Microbiology and Infection. 23 (11), 791-792 (2017).</li>
<li>Cairns, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+a+multidisciplinary+antimicrobial+stewardship+team+on+the+timeliness+of+antimicrobial+therapy+in+patients+with+positive+blood+cultures%3A+a+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">The impact of a multidisciplinary antimicrobial stewardship team on the timeliness of antimicrobial therapy in patients with positive blood cultures: a randomized controlled trial.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (11), 3276-3283 (2016).</li>
<li>Baur, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+antibiotic+stewardship+on+the+incidence+of+infection+and+colonisation+with+antibiotic-resistant+bacteria+and+Clostridium+difficile+infection%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of antibiotic stewardship on the incidence of infection and colonisation with antibiotic-resistant bacteria and Clostridium difficile infection: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet Infectious Diseases. 17 (9), 990-1001 (2017).</li>
<li>Roberts, J. A., Norris, R., Paterson, D. L., Martin, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+drug+monitoring+of+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Therapeutic drug monitoring of antimicrobials.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 73 (1), 27-36 (2012).</li>
<li>Paal, M., Zoller, M., Schuster, C., Vogeser, M., Schutze, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+quantification+of+cefepime%2C+meropenem%2C+ciprofloxacin%2C+moxifloxacin%2C+linezolid+and+piperacillin+in+human+serum+using+an+isotope-dilution+HPLC-MS%2FMS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Simultaneous quantification of cefepime, meropenem, ciprofloxacin, moxifloxacin, linezolid and piperacillin in human serum using an isotope-dilution HPLC-MS/MS method.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 152, 102-110 (2018).</li>
<li>Vogeser, M., Seger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+associated+with+the+use+of+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+in+the+clinical+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Pitfalls associated with the use of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in the clinical laboratory.</a> Clinical Chemistry. 56 (8), 1234-1244 (2010).</li>
<li>United States Pharmacopeia and National Formulary. Chapter <621>. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CHROMATOGRAPHY+%28USP+37-NF+32+S1%29%22">CHROMATOGRAPHY (USP 37-NF 32 S1)</a>. , United Book Press, Inc. Baltimore, MD. 6376-6385 (2014).</li>
<li>Wong, G., Sime, F. B., Lipman, J., Roberts, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+we+use+therapeutic+drug+monitoring+to+improve+outcomes+from+severe+infections+in+critically+ill+patients%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">How do we use therapeutic drug monitoring to improve outcomes from severe infections in critically ill patients?</a> BMC Infectious Diseases. 14, 288(2014).</li>
<li>EUCAST: European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Information on clinical breakpoint tables. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/">http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/</a> (2017).</li>
<li>Surveillance der Antibiotika-anwendung und der bakteriellen Resistenzen auf Intensivstationen. SARI information for antibiotic consumption 2016 of all intensive care units participating at SARI. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://sari.eu-burden.info/auswertung/down/AD-ZEIT.pdf">http://sari.eu-burden.info/auswertung/down/AD-ZEIT.pdf</a> (2016).</li>
<li>Cefepime hydrochloride: Highlights of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/050679s040lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/050679s040lbl.pdf</a> (2016).</li>
<li>Meropenem: Highlights of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2008/050706s022lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2008/050706s022lbl.pdf</a> (2006).</li>
<li>Ciprofloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/019537s086lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2016/019537s086lbl.pdf</a> (2016).</li>
<li>Moxifloxacin hydrochloride: Highlights of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2010/021277s038lbl.pdf</a> (2010).</li>
<li>Linezolid: Highlights of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2012/021130s028lbl.pdf</a> (2011).</li>
<li>Piperacillin and Tazobactam: Highlighs of prescribing information. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf">https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/Label/2017/050684s88s89s90_050750s37s38s39lbl.pdf</a> (2017).</li>
<li>Zander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+biobanking+conditions+on+six+antibiotic+substances+in+human+serum+assessed+by+a+novel+evaluation+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Effects of biobanking conditions on six antibiotic substances in human serum assessed by a novel evaluation protocol.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 54 (2), 265-274 (2016).</li>
<li>Zander, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+piperacillin%2C+tazobactam%2C+cefepime%2C+meropenem%2C+ciprofloxacin+and+linezolid+in+serum+using+an+isotope+dilution+UHPLC-MS%2FMS+method+with+semi-automated+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry+and+Laboratory%22%5BJournal%5D)">Quantification of piperacillin, tazobactam, cefepime, meropenem, ciprofloxacin and linezolid in serum using an isotope dilution UHPLC-MS/MS method with semi-automated sample preparation.</a> Clinical Chemistry and Laboratory. 53 (5), 781-791 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本论文中，我们报告了一种基于串联质谱的简单且稳健的方法，用于定量重症监护病房（ICU）中常用抗生素，即头孢吡肟、美罗培南、环丙沙星、莫西沙星、利奈唑胺和哌拉西林1914。随论文附有一张电子表格，用于制备抗生素储备液、校准品和质控品，其中已考虑了抗生素的纯度及其对应离子的分子量。由于这些抗生素的浓度相对较高，从分析角度来看，其定量不应构成特殊挑战。因此，我们确信该方案适用于多种质谱仪器平台。在方法转移时，建议使用者测定色谱系统的柱外体积和死体积，并相应调整梯度起始时间16。在方法建立过程中，还应评估系统是否存在残留（carry-over），必要时需在最高浓度校准品以及高抗生素浓度的患者样本之后进样一个空白样品。使用者还必须考虑检测器饱和的可能性，即当过多离子进入串联质谱仪时可能发生饱和。显著的检测器饱和可通过减小进样体积、在样品前处理过程中增加分析物稀释倍数和/或对目标分析物进行去调谐（例如，降低最优电压设置）来消除。
与...

尽管抗生素彻底改变了医学实践，但严重的细菌感染仍然是危重疾病中导致发病和死亡的主要原因1。在这方面，及时给予适当种类和足够剂量的抗感染药物对疾病控制至关重要2。
越来越多的证据表明，随着患者群体复杂性的增加，广谱抗生素的经验性治疗正变得日益棘手。这一问题在重症监护病房（ICU）尤为突出，其中关键药代动力学（PK）参数常表现出巨大的个体间差异3,4。因此，ICU患者面临亚治疗浓度的紧迫风险，可能导致治疗效果不足5,6。另一方面，患者也可能因暴露于过高的抗生素浓度而遭受不必要的伤害，这可能引发严重不良事件，却并无临床获益7。抗生素的滥用和剂量不足还加剧了耐药性的传播，对公共健康构成日益严重的威胁8。
为改善抗生素的使用并尽可能延长其有效性，世界卫生组织于2015年发布了《抗菌药物耐药性全球行动计划》9。抗生素管理项目是国家公共卫生战略中合理使用抗菌药物的基本支柱之一10，有助于临床医生提高患者诊疗质量11，同时显著降低抗生素耐药性12。通过治疗药物监测（TDM）对个体患者进行抗菌药物剂量调整，是实现这一目标的关键手段13。
迄今为止，市面上仅对糖肽类抗生素和氨基糖苷类抗生素提供商业化的治疗药物监测（TDM）检测。其他类别药物的定量通常需要自行开发或验证检测方法，过程较为繁琐。因此，本文详细介绍了基于质谱的稳健检测方案，可用于重症监护病房（ICU）中最重要抗生素在其临床相关浓度范围内的定量分析14。该方法已在我们的质谱检测平台建立，并自建立以来一直用于ICU的常规TDM检测。该流程采用简单直接的分析设置，并使用统一的样品前处理步骤，使得具备质谱检测能力的众多机构能够快速实施抗生素TDM检测。
本方案经过优化，用于采用同位素稀释液相色谱法（LC）结合串联质谱法（MS/MS）对人血清中的头孢吡肟、美罗培南、环丙沙星、莫西沙星、利奈唑胺和哌拉西林进行定量分析。在同位素稀释LC-MS/MS方法中，将稳定同位素标记的化合物添加至具有特定基质（例如，血清）的目标样品中。由于天然分子与其碎片产物（称为母离子-子离子跃迁）的分子量不同，同位素标记的标准品可与其未标记的对应物（即目标分析物）区分开来。由于同位素标记化合物的整体理化性质与未标记对应物几乎完全相同，因此它们是MS/MS分析的理想内标，能够实现几乎不受基质影响的高准确度分析物定量15。如今，许多可用于小分子定量（包括抗菌药物治疗药物监测，TDM）的稳定同位素标记内标已可商业化获得。
在所述方案中，抗生素分析物的色谱分离采用一根分析级C8反相色谱柱（100 mm × 2.1 mm，3 µm粒径）进行。在方法开发过程中，所有分析物的内标归一化基质因子介于94.6%至105.4%之间，变异系数≤8.3%14。

<table><tbody><tr><td>盐酸头孢吡肟</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1097636</td><td>USP 参考标准</td></tr><tr><td>美罗培南三水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0001252</td><td>EP 参考标准</td></tr><tr><td>环丙沙星</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>盐酸莫西沙星</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML1581</td><td></td></tr><tr><td>利奈唑胺</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>L466500</td><td></td></tr><tr><td>哌拉西林钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93129</td><td></td></tr><tr><td>cefepime-13C12D3 硫酸盐</td><td>Alsachim</td><td>C1297</td><td>头孢吡肟的同位素标记内标</td></tr><tr><td>meropenem-D6</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>M225617</td><td>美罗培南的同位素标记内标</td></tr><tr><td>ciprofloxacin-D8</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>C482501</td><td>环丙沙星的同位素标记内标</td></tr><tr><td>moxifloxacin-13C1D3 盐酸盐</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>M745003</td><td>莫西沙星的同位素标记内标</td></tr><tr><td>linezolid-D3</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>L466502</td><td>利奈唑胺的同位素标记内标</td></tr><tr><td>piperacillin-D5</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>P479952</td><td>哌拉西林的同位素标记内标</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>JT Baker</td><td>8402</td><td></td></tr><tr><td>HPLC 级水</td><td>JT Baker</td><td>4218</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Biosolve</td><td>6914132</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Biosolve</td><td>1070501</td><td></td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70221-25G-F</td><td></td></tr><tr><td>叔丁基甲基醚</td><td>Merck</td><td>101845</td><td></td></tr><tr><td>Fortis 3 &amp;mu;m C8 100 * 2.1 mm</td><td>Fortis</td><td>F08-020503</td><td></td></tr><tr><td>Ti-PEEK 封装预过滤器 (2 &amp;mu;m)</td><td>Chromsystems</td><td>15011</td><td></td></tr><tr><td>2795 Alliance HPLC 系统</td><td>Waters</td><td>176000491</td><td></td></tr><tr><td>Quattro micro API 串联四极杆系统</td><td>Waters</td><td>720000338</td><td></td></tr><tr><td>QuanLynx 4.1 软件</td><td>Waters</td><td>/</td><td>质谱仪制造商提供的数据处理软件</td></tr><tr><td>补充文件</td><td></td><td></td><td>储备溶液</td></tr></tbody></table>

重症疾病中抗生素的同位素稀释高效液相色谱-串联质谱法多重治疗药物监测

Multiplex Therapeutic Drug Monitoring by Isotope-dilution HPLC-MS/MS of Antibiotics in Critical Illnesses

许多临床机构对抗生素治疗药物监测的需求日益增长，特别是在实施医院抗生素管理项目方面。
本研究中，我们提出了一种多重高效液相色谱-串联质谱法（HPCL-MS/MS）检测方案，用于定量测定重症监护病房中常用的抗生素——头孢吡肟、美罗培南、环丙沙星、莫西沙星、利奈唑胺和哌拉西林。该方法已根据欧洲药品管理局的指南进行了全面验证。
经过快速的样品净化后，分析物在C8反相高效液相色谱柱上于4分钟内完成分离，并通过电喷雾离子化（ESI+）质谱在多反应时间监测（MRM）模式下，利用相应的稳定同位素标记内标进行定量。本方法采用简单的仪器设置和统一的色谱条件，适用于临床实验室中日常且稳定的抗生素治疗药物监测。校准曲线覆盖药代动力学浓度范围，包括接近敏感菌最小抑菌浓度（MIC）的抗生素含量以及通过推注给药方案所达到的峰浓度（Cmax）。由于样品净化前无需血清稀释，因此可通过多次测量获得给药抗生素的曲线下面积。

根据所述方案，典型的色谱图如图2所示。依据美国药典（USP）色谱指南16，本系统中色谱柱死体积约为 0.22 mL，柱外体积（包括进样器、管路和接头）约为 0.08 mL，总保留体积约为 0.30 mL。所有分析物的计算保留因子为 2.8（头孢吡肟）至 4.2（哌拉西林）。
<img alt="色谱结果，彩色编码图中的五个峰；显示随时间变化的化合物分离情况。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58148/58148fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：具有归一化信号强度的典型分析色谱图。 抗生素的洗脱顺序如下：头孢吡肟（绿色）、美罗培南（棕色）、环丙沙星（红色）、莫西沙星...

本文介绍了一种基于串联质谱的检测方法，用于定量重症监护病房中常用抗生素，包括头孢吡肟、美罗培南、环丙沙星、莫西沙星、利奈唑胺和哌拉西林。

目前，许多临床机构对进行抗生素治疗药物监测的需求日益增长，尤其是针对……

抗生素的治疗药物监测正日益被视为实施国家和地方抗菌药物管理计划的重要组成部分。为满足医疗机构对抗生素治疗药物监测日益增长的需求，本文提供了一种用于定量循环中抗生素浓度的方案，旨在根据病原体的敏感性调整给药剂量。本方案基于质谱技术，已针对重症监护病房中最常用的抗生素——头孢吡肟、美罗培南、环丙沙星、莫西沙星、利奈唑胺和哌拉西林的定量进行了优化。由于校准范围较宽，该方法还可用于计算给药抗生素的药代动力学曲线下面积。本方案总周转时间约为30分钟，适用于临床实验室日常的抗生素治疗药物监测。首先，将九份体积的无药物血清与一份体积预先配制的10倍浓缩加标溶液混合，以获得血清校准品0至7以及质控品A至D。例如，在10毫升聚丙烯管中加入0.5毫升加标溶液和4.5毫升血清，在4摄氏度下以50 rpm的转速于滚轴混合器上孵育15分钟。使用重复移液器在1.5毫升聚丙烯管中制备100微升的校准品和质控品分装液。将校准品、质控品以及先前配制的抗生素储备液在-80摄氏度下保存，最长可保存六个月。配制六种内标储备液后，将其混合至一个1.5毫升聚丙烯管中，得到五倍浓度的内标混合液。将所需的内标物加入965微升25%甲醇水溶液中。将内标储备液及五倍浓缩的内标混合液于-80摄氏度保存。配制流动相A时，将约500毫升HPLC级水加入1,000毫升容量瓶中。加入1毫升甲酸、10毫升1摩尔的甲酸铵，并用HPLC级水定容至1,000毫升。然后将流动相溶液转移至洁净的玻璃瓶中。配制流动相B时，将HPLC级无水甲醇加入洁净的玻璃瓶中。配制清洗溶剂时，向一个1,000毫升的容量瓶中加入约500毫升蒸馏水。加入70毫升色谱纯甲醇、1毫升甲酸，再用蒸馏水定容至1,000毫升。将溶剂转移至一个洁净的玻璃瓶中。将装有流动相 A 和流动相 B 的瓶子以及清洗溶剂连接至高效液相色谱（HPLC）系统。确保针头清洗溶剂管路连接至盛有流动相 B 的瓶子。制备沉淀剂时，取 2.5 毫升甲基叔丁基醚加入 25 毫升容量瓶中，再用无水甲醇定容至 25 毫升。将 C8 反相色谱柱放入色谱柱温箱中，然后按照流动方向将色谱柱连接至高效液相色谱仪和质谱仪。为生成样本列表，打开相应的样本检测主文件模板，并将待处理的患者样本添加至其中。将患者样本按每组最多20个进行分组，并在每组两侧分别添加相应的质控样本对。使用进样器文件控制软件，将湿启动（Wet Prime）功能设置为50%流动相A和50%流动相B，在每分钟1毫升流速下湿启动运行两分钟。接下来，在控制软件中执行六次600微升的冲程以冲洗注射器。为平衡C8反相色谱柱，打开进样文件中的流路，使用0.4或0.5毫升/分钟的流速，以7%流动相B和93%流动相A冲洗色谱柱，时间不少于5分钟。目视确认色谱柱温度为30摄氏度。使用多通道移液器，向已解冻的校准品、质控样本或患者血清中加入25微升内标混合液

multiplex-therapeutic-drug-monitoring-isotope-dilution-hplc-msms

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

同位素稀释-高效液相色谱-抗生素在危重症患者中的多重治疗药物监测

非靶向代谢组学可提供代谢谱的假设生成式快照。本方案将演示从细胞、血清或组织中提取和分析代谢物的方法。通过液-液相萃取、微流速超高效液相色谱/高分辨质谱法（UPLC-HRMS）结合差异分析软件，对多种代谢物进行检测。...

使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

本文介绍了一种高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）检测方法，用于定量干燥血斑中的免疫抑制剂他克莫司，该方法采用简单的手工蛋白质沉淀步骤及在线柱提取技术。...

使用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）定量检测干血斑中的免疫抑制剂他克莫司

本文介绍了一种色谱分析方法，该方法结合了肽段前体的离子淌度分离，随后对肽段碎片进行高分辨率（约30,000）质谱检测，用于定量单克隆抗体酶解产物中添加的肽段标准品。...

一种基于液相色谱离子淌度QTOF质谱的HS-MRM方法用于蛋白质类生物制药中宿主细胞蛋白的定量分析

前体同位素标记与等重标记联合技术（cPILOT）是一种定量蛋白质组学策略，可增强等重标签的样本多重检测能力。本方案描述了cPILOT在阿尔茨海默病小鼠模型及野生型对照组织样本中的应用。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）增强组织样本的多重检测能力

本方案描述了一种高效且便捷的分析流程，用于从经纳米颗粒制剂协同药物组合治疗的临床前乳腺肿瘤模型的生物样本中提取样品，并同时测定多种药物，包括阿霉素（DOX）、丝裂霉素C（MMC）以及一种具有心脏毒性的阿霉素代谢物——阿霉素醇（DOXol）。...

荷瘤小鼠中纳米颗粒递送药物组合后阿霉素与丝裂霉素C的样品提取及同步色谱定量分析

我们介绍一种结合液相色谱与高分辨质谱技术，利用同重标记、深度分级分离、生物信息学工具以及质量控制步骤，精确量化蛋白质的实验方案。...

通过同重标记、深度液相色谱、质谱分析及软件辅助定量进行深度蛋白质组分析

本文介绍了一种结合激光捕获显微切割与液相色谱-质谱分析的技术方案，用于在肺结核肉芽肿内对药物分布进行空间定量。该方法具有广泛适用性，可实现对组织内药物浓度的高空间分辨率定量。...

利用激光显微切割液相色谱质谱法（LCM-LC/MS）对肺结核病灶中药物的空间分布进行定量分析

本文介绍一种高通量的全面药物监测方法，该方法可提高对多种滥用药物及其代谢物的分辨率和检测能力，并基于多段进样-毛细管电泳-质谱技术进行质量控制。...

高通量、全面性药物监测的多段注入-毛细管电泳-质谱联用技术

前体同位素标记与等重标记联用技术（cPILOT）是一种增强的样本多重分析策略，能够利用现有的等重标签显著增加可同时分析的样本数量。结合机器人平台的应用，极大地提高了实验通量、重复性以及定量准确性。...

利用前体同位素标记与等重标签联用技术（cPILOT）实现自动化样本多重分析

核磁共振（NMR）波谱法用于识别多种疾病患者中代谢物的异常调节。该技术可对异常代谢物进行定量分析，揭示其病理生理学机制。本文详细描述了基于核磁共振的患者代谢特征分析的逐步操作流程。...

基于核磁共振的代谢组学在危重患者中异常代谢物的鉴定与定量

学习使用高效液相色谱-串联质谱法对重症患者进行抗生素治疗药物监测的方法。该方案可定量检测头孢吡肟、美罗培南、环丙沙星、莫西沙星、利奈唑胺和哌拉西林，支持临床剂量调整。

重症疾病中抗生素的同位素稀释高效液相色谱-串联质谱法多重治疗药物监测

探索更多视频