通过单细胞荧光显微镜定量测定胞葬作用

该方法可用于解答凋亡细胞清除（efferocytosis）领域中的关键问题，例如信号分子在介导凋亡细胞摄取过程中的作用。该技术的主要优势在于能够清晰地定量分析凋亡细胞的摄取情况，包括部分或碎片化的摄取过程，而这些细节在其他方法中并不总是能够被明显观察到。尽管该方法可用于研究免疫细胞的凋亡细胞清除作用，也可应用于其他细胞类型，例如上皮细胞或癌细胞。

通常，初学者会因难以优化显微镜采集参数而遇到困难。在制备人巨噬细胞和凋亡的Jurkat细胞后，使用血细胞计数板对凋亡细胞进行计数，然后将足量的凋亡细胞转移至1.5毫升微量离心管中。

通过在500 × g下离心5分钟收集Jurkat细胞。然后将细胞重悬于500 µL PBS中。在Jurkat细胞离心的同时，取10 µL DMSO加入新的微量离心管中。

接下来，将少量 NHS-生物素溶解于 DMSO 中。然后，取 500 微升凋亡细胞的 PBS 悬液，转移至含有 DMSO 和 NHS-生物素的离心管中。随后，根据制造商说明书稀释适量的细胞示踪染料。

将细胞悬液在室温下避光孵育20分钟。然后加入等体积含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基，再将悬液在室温下避光孵育额外5分钟。之后，在500 × g离心5分钟，沉淀细胞。

然后弃去上清液，将染色的细胞重悬于 100 µL 含 10% FBS 的 RPMI 1640 培养基中。将 100 µL 染色细胞悬液逐滴加入每孔巨噬细胞中。随后以 200 × g 离心 1 分钟。

在37摄氏度、5% CO2条件下，将培养板置于组织培养箱中孵育。经过适当的孵育时间后，从培养箱中取出细胞，随后用一毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。

此后，向每孔加入稀释的FITC标记的链霉亲和素。在避光条件下孵育20分钟。用一毫升PBS洗涤细胞三次，每次冲洗后轻轻振荡样品五分钟。

然后在室温下用含4%多聚甲醛的PBS固定细胞20分钟。用PBS洗涤细胞一次，以去除多余的多聚甲醛。将盖玻片封片于成像载玻片上，并将载玻片转移至荧光显微镜下观察。

捕获足够数量细胞的Z轴层扫图像以进行定量分析。设定各层之间的距离至关重要，需确保检测到所有被吞噬的凋亡物质。各层之间的最大距离不应超过物镜的焦深，通常为0.5至1微米。

使用导入功能将其中一个Z轴堆栈载入软件中。然后在“设置测量”面板下选择“积分密度”作为测量选项。为便于分析，建议将链霉亲和素通道和细胞示踪染料通道以叠加方式同时显示。

任何在圆周上存在链霉亲和素染色的物体均应视为链霉亲和素阳性，因此不应被定量为链霉亲和素阴性。图像加载后，使用链霉亲和素通道以及自由手或 多边形选择工具，在Z堆栈的单个平面上圈出所有细胞示踪染料阳性而链霉亲和素阴性的区域。然后，测量该区域内细胞示踪染料的积分强度。

在同一Z层面，利用链霉亲和素染色以及自由手绘或多种选择工具，圈出所有细胞示踪染料阳性且链霉亲和素阳性的物质。最后，测量该区域的总荧光强度。通过该实验流程，经星形孢菌素处理的Jurkat细胞中超过95%发生了凋亡。

在大多数实验中，被清除的凋亡细胞比例随时间呈依赖性增加。在针对不同类型的吞噬细胞或不同凋亡细胞靶标优化该方案时，重要的是要测试凋亡细胞与吞噬细胞之间不同比例的范围。通常，10:1 或 30:1 的比例效果最佳。

通过在胞葬细胞中表达荧光报告基因，该实验步骤可轻松改造用于追踪信号分子的活化或细胞内转运过程，从而实现对这些过程在胞葬作用期间的成像观察。