单细胞荧光显微镜定量 Efferocytosis 的研究
August 18th, 2018
Efferocytosis, 凋亡细胞的吞噬去除, 是需要保持动态平衡, 并由受体和信号通路, 以允许识别, 吞没和内化的凋亡细胞的促进。在此, 我们提出了一个荧光显微镜协议的量化 efferocytosis 和 efferocytic 信号通路的活动。
该方法可用于回答胞吐作用领域的关键问题，例如信号分子在介导凋亡细胞摄取中的作用。该技术的主要优点是它提供了凋亡细胞摄取的明确定量，包括部分或零碎的凋亡细胞摄取，这在其他方法中并不总是很明显。虽然这种方法可以深入了解免疫细胞的胞吐作用，但它也可以应用于其他细胞类型，例如上皮细胞或癌细胞。
通常，由于难以优化显微镜采集设置，刚接触这种方法的人会遇到困难。制备人巨噬细胞和凋亡的 Jurkat 细胞后，使用血细胞计数器对凋亡细胞进行计数。然后将足够量的凋亡细胞转移到 1.5 mL 微量离心管中。
以 500 x g 离心 5 分钟，使 Jurkat 细胞沉淀。然后将细胞重悬于 500 微升 PBS 中。当 Jurkat 细胞在离心机中时，将 10 μL DMSO 分装到新的微量离心管中。
接下来，将最少量的 NHS-生物素溶解在 DMSO 中。在此之后，将 500 微升凋亡细胞和 PBS 悬浮液转移到含有 DMSO 和 NHS-生物素的试管中。然后，根据制造商的说明稀释适当的细胞示踪染料。
将细胞悬液在室温下避光孵育 20 分钟。然后，加入等体积的含 10% FBS 的 RPMI 1640，并在室温下避光孵育悬浮液 5 分钟。之后，通过 500 x g 离心 5 分钟来沉淀细胞。
然后弃去上清液，将染色的细胞重悬于 100 微升含 10% FBS 的 RPMI 1640 中。向巨噬细胞的每个孔中逐滴加入 100 微升染色细胞悬液。然后以 200 次 g 离心板 1 分钟。
将板在 37 摄氏度和 5% CO2 中在组织培养箱中孵育。适当的孵育期后，从培养箱中取出细胞。然后用 1 毫升 PBS 洗涤细胞两次。
在此之后，向每个孔中加入稀释的 FITC 偶联的链霉亲和素。并将板在黑暗中孵育 20 分钟。用 1 毫升 PBS 洗涤细胞 3 次，每次冲洗后轻轻摇动样品 5 分钟。
然后在室温下用 4% 多聚甲醛的 PBS 溶液固定细胞 20 分钟。用 PBS 冲洗细胞一次，以去除任何多余的 PFA。将盖玻片安装在成像载玻片上，然后将载玻片转移到荧光显微镜上。
捕获足够数量的细胞的 Z 堆栈以进行定量。设置所述部分之间的距离以检测所有吞噬的凋亡物质至关重要。所述部分之间的最大距离不应大于物镜的焦深，通常为 0.5 到 1 微米。
使用 Import 功能将其中一个 Z 堆栈加载到软件中。然后选择 Integrated density 作为 Set Measurements 面板下的测量选项。如果链霉亲和素和细胞示踪染料通道都显示为叠加层，则分析最容易进行。
沿圆周任何位置具有链霉亲和素染色的任何对象都应被视为链霉亲和素阳性，因此不应量化为链霉亲和素阴性。加载图像后，使用链霉亲和素和 Freehand 或多边形选择工具，在 Z 堆栈的单个平面中圈出所有细胞示踪染料阳性链霉亲和素阴性材料。然后，测量该区域中细胞示踪染料的整合强度。
在同一个 Z 切片中，使用链霉亲和素染色，并使用手绘或多边形选择工具圈出所有细胞示踪染料阳性链霉亲和素阳性材料。最后，测量该区域的综合强度。使用该程序，超过 95% 的用星形孢菌素处理的 Jurkat 细胞发生细胞凋亡。
在大多数实验中，胞吐作用的凋亡细胞的分数以时间依赖性方式增加。当针对不同的泡泡细胞类型或不同的凋亡细胞靶标优化该方案时，测试凋亡细胞与泡泡细胞比率的范围非常重要。通常 10 比 1 或 30 比 1 的比率效果最好。
该程序可以很容易地修改，以通过在泡细胞中表达荧光报告基因来跟踪信号分子激活或细胞内运输，从而允许在泡血细胞增多过程中对这些过程进行成像。
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概述
本文介绍了一种用于定量测量效应细胞吞噬（吞噬细胞清除凋亡细胞的过程）的荧光显微镜协议。该方法可以评估效应细胞吞噬信号传导途径，并提供清晰的凋亡细胞摄取定量。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 效应细胞吞噬对维持细胞稳态至关重要。
- 它涉及吞噬细胞对凋亡细胞的识别和内化。
- 了解效应细胞吞噬的机制可以为各种疾病提供洞见。
- 该方法可应用于不同类型的细胞，包括免疫细胞和癌细胞。
研究目的
- 量化免疫细胞摄取凋亡细胞。
- 研究信号分子在效应细胞吞噬中的作用。
- 为研究各种细胞类型的效应细胞吞噬提供可靠的方法。
使用的方法
- 人类巨噬细胞和凋亡Jurkat细胞的制备。
- 使用血细胞计数板计算凋亡细胞数量。
- 用于可视化和定量的荧光显微镜。
- 优化显微镜采集设置以获得准确结果。
主要结果
- 该方法可以清晰地定量测量凋亡细胞的摄取。
- 可以评估部分或零散的凋亡细胞摄取。
- 通过这种方法可以获得对效应细胞吞噬机制的洞见。
- 该技术适用于免疫细胞以外的各种细胞类型。
结论
- 该荧光显微镜协议增强了对效应细胞吞噬的理解。
- 它为研究细胞死亡和清除的研究人员提供了宝贵的工具。
- 未来的应用可能扩展到涉及细胞相互作用的其他研究领域。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative efferocytosis assessment by single-cell fluorescence microscopy addresses a critical need for precise measurement of apoptotic cell uptake and signaling pathway interrogation in discovery-stage immunology and oncology research. This dual-labeling approach enables accurate discrimination between internalized and surface-bound apoptotic material, supporting mechanistic de-risking and target validation. The method enhances predictive confidence at key inflection points in early discovery and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous testing of therapeutic hypotheses involving efferocytosis pathways.
- Supports functional validation of targets regulating apoptotic cell clearance.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying partial and complete efferocytosis events.
- Improves predictive confidence for portfolio triage in immune and cancer cell contexts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated cellular systems for downstream screening of efferocytosis modulators.
- Delivers reproducible, quantitative outputs distinguishing internalized from non-internalized targets.
- Enables assay standardization and scalability for compound evaluation.
- Supports platform reuse across diverse efferocytic cell types and targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by enabling efferocytosis quantification in immune, epithelial, and cancer cells.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of efferocytosis-modulating agents.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by linking cellular readouts to translational endpoints.
- Offers predictive de-risking for therapeutic strategies targeting apoptotic cell clearance.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-label fluorescence microscopy method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting hypothesis testing, assay development, and translational research on efferocytosis.
- Discovery Biology: Quantifies efferocytic activity and signaling, clarifying pathway roles and biological mechanisms.
- Screening: Provides robust, quantitative readouts for assay readiness and reproducibility.
- Analytics: Enables measurement of bound versus internalized apoptotic material for comparative analysis.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by supporting studies in multiple cell types.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible, adaptable platform for efferocytosis quantification across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in efferocytosis research.
- Operational Value: Standardizes quantification, enhances reproducibility, and supports scalable workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing robust biological data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of efferocytosis-targeting assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and image analysis.
- Demands access to high-quality imaging instrumentation and analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of acquisition and quantification parameters.
- Adaptable to various efferocytic and apoptotic cell types with protocol optimization.
- Optimization of cell ratios and imaging settings is critical for reproducibility.
