Name: 可伸缩、双通道、微流控芯片制造 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: 学习使用3D打印模具和软硅橡胶制造可伸缩双通道器官芯片微流控装置。该方法通过机械拉伸和灌注系统模拟器官级功能，为药物测试和疾病建模提供可靠平台。

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感谢 M. Rousseau 和 S. Kroll 在摄影与摄像方面的协助，感谢 M. Ingram、J. Nguyen、D. Shea 和 N. Wen 对初始制造方案开发的贡献。本研究由哈佛大学威斯生物启发工程研究所、美国国防高级研究计划局（合作协定编号 #W911NF-12-2-0036 和 #W911NF-16-C-0050）、美国食品药品监督管理局（FDA 资助编号 #HHSF223201310079C）、美国国立卫生研究院（NIH 资助编号 #R01-EB020004 和 #UG3-HL141797-01）以及比尔及梅琳达·盖茨基金会（资助编号 #OPP1163237 和 #OPP1173198）资助。本文所表达的观点和结论仅代表作者立场，不应被视为代表美国国防高级研究计划局、食品药品监督管理局、国立卫生研究院或美国政府的官方政策，无论明示或暗示。

1. 常规准备
<ol>
	<li>为避免碎屑污染，使用封箱胶带清洁工作区域，并用洁净室擦拭布和异丙醇擦拭表面。</li>
	<li>所有涉及聚二甲基硅氧烷（PDMS）的操作步骤中，按10:1的比例混合PDMS（10 g交联剂，100 g弹性体基质）。可手动混合或使用商用混合器。此处使用行星式离心混合器：在2000 rpm条件下混合2分钟，随后在2200 rpm条件下脱气2分钟。</li>
	<li>使用前，用气枪吹净所有模具以去除碎屑。 
	注意：切勿使用金属镊子清除碎屑，以免损坏模具表面。</li>
</ol>
2. 上层通道制备
<ol>
	<li>用乙醇和无尘布擦拭每块聚氨酯的光面。确保聚氨酯表面残留的乙醇完全干燥。</li>
	<li>将聚氨酯的光面覆盖在MiP模具的开口端，以密封模具的开口侧，仅在模具顶部留出一个类似孔洞的开口用于倒入PDMS。 
	注意：请检查每个模具是否均被聚氨酯片牢固覆盖，否则在倒入PDMS时会发生泄漏。</li>
	<li>将模具与聚氨酯组件放入MiP夹具中，使模具的纹理面紧贴夹具末端。重复此操作，直至所有模具均放入夹具。</li>
	<li>使用扳手旋转手柄，拧紧MiP夹具，直至夹具间距为25 mm宽。</li>
	<li>用铝箔围绕MiP夹具制作一个“船形”围挡，防止多余的PDMS溢出到台面上。</li>
	<li>将PDMS倒入每个模具的孔洞中，直至充满。 
	注意：每个芯片顶部组件约需3 mL PDMS。</li>
	<li>当整个夹具填充完毕后，将其放入真空干燥器中。在-80 kPa条件下抽真空1小时，以去除PDMS中的气泡。</li>
	<li>1小时后，将MiP夹具从干燥器中取出，并置于60 °C烘箱中至少固化4小时。</li>
	<li>使用扳手拆卸MiP夹具，逆时针旋转手柄以松开夹具。当模具解除压缩后，将模具从夹具中取出。</li>
	<li>从每个模具上取下聚氨酯条并丢弃。</li>
	<li>小心地将PDMS部件从模具中脱模，并将有结构的一面朝上放置。</li>
	<li>将瓷砖刮刀的刀刃对准末端标签的缺口处，切去两端，以分离出单个顶部组件。</li>
	<li>检查部件是否存在以下任何失效情况，如有则丢弃不合格部件：主通道划痕、通道区域上方存在大块异物、大气泡、真空通道变形。</li>
	<li>将完成的部件存放于方形培养皿中，并置于室温下的正压柜内保存。</li>
</ol>
3. 下通道制备
<ol>
	<li>将约10.5 g PDMS倒入模具中，直至PDMS填满型腔顶部。
	<ol>
		<li>检查底部通道模具，观察是否有聚二甲基硅氧烷（PDMS）固化在模具底部。</li>
		<li>如果模具底部有污物，需刮除残留的PDMS，因为模具底部表面不平整会导致最终部件厚度不均。 
		注意：对于小规模 &#60;2 cm2 对于未覆盖的区域，可非常轻柔地使用气枪推动PDMS覆盖该空间。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将模具放入真空干燥器中放置1小时。</li>
	<li>孵育1小时后，将模具转移至水平的60 °C烘箱中 &#62;4 h</li>
	<li>将模具置于超净工作台内的桌面上。从模具的一侧边缘松开PDMS。</li>
	<li>抓住一个角落，轻轻将PDMS从模具表面剥离。</li>
	<li>完全取出后，将其平放在工作台面上，使通道结构朝上。</li>
	<li>使用瓷砖切割器沿外部边缘切割部件，将瓷砖切割器的刀片置于步骤2.12中所示的带缺口PDMS处。</li>
	<li>将部件有特征的一面朝上放置在胶带上，以清除任何碎屑。</li>
	<li>从胶带上取下部件。将部件的松端在载玻片上拖动，松端会与玻璃粘合。 
	注意：在放置部件时，必须避免对其拉伸。. 若部件与玻璃之间有气泡，用镊子轻轻抬起部件并重新放置。</li>
	<li>对部件进行质量控制检查。检查部件是否存在任何失效模式，丢弃所有不合格的部件，包括主通道有划痕、存在大颗粒碎屑、大气泡或真空通道变形的部件。</li>
	<li>用胶带覆盖表面。</li>
	<li>将部件存放在室温下的正压柜中。</li>
</ol>
4. PDMS 膜的制备
<ol>
	<li>检查晶圆背面是否无聚二甲基硅氧烷残留。</li>
	<li>将每张膜片放入 AMF 托盘的指定槽位中。</li>
	<li>使用1 mL注射器将0.09 mL PDMS置于每个膜片微柱阵列的中心。静置PDMS至少5分钟，使其充分扩散至膜片微柱的各个区域。 
	注意：必须等到至少75%的柱后区域被PDMS覆盖后，方可进行下一步操作。PDMS在柱区毛细渗透的时间越长，膜的质量越好，因此建议延长此步骤的等待时间。</li>
	<li>以20 W功率对聚碳酸酯条进行等离子处理45秒，O2 在等离子体机器中，使用0.80 mbar的气体。</li>
	<li>从等离子体处理仪中取出聚碳酸酯片，并用剪刀将聚碳酸酯片裁剪成 45 mm × 45 mm 的正方形。 
	注意：尽量减少与等离子处理表面的接触，以防止灰尘附着在聚碳酸酯上。</li>
	<li>轻轻地将聚碳酸酯方片经等离子体处理的一面置于膜晶圆中心的液态PDMS上，确保聚碳酸酯与PDMS充分接触。 
	注意：避免聚碳酸酯与PDMS之间产生气泡。</li>
	<li>将预先切割好的PDMS垫片置于聚碳酸酯方片的中央。</li>
	<li>将预先切割好的带纹理聚碳酸酯片放置在PDMS块上，以防止组装件与压缩板粘连。</li>
	<li>将托盘插入，使3号托盘位于后方，2号托盘位于中间，1号托盘位于前方。1号托盘带有用于对齐的凹槽。</li>
	<li>打开输出压力阀，然后非常缓慢地打开输入压力阀。随后关闭输出压力阀。 
	注意：这是为了使输出的4 kg力逐渐施加到每片膜片上，而不是瞬间施加，以免损坏膜片。</li>
	<li>将 AMF 开关拨至 ON 以开始固化循环。在 4 kg（16 kPa）压力及下述梯度升温循环条件下固化晶圆 表1.</li>
</ol>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:323px;" width="322">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:91px;">步骤</td>
			<td style="width:131px;">温度 (°C)</td>
			<td style="width:101px;">持续时间 (min)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="right" height="20" style="height:20px;">1</td>
			<td align="right">20</td>
			<td align="right">20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="right" height="20" style="height:20px;">2</td>
			<td align="right">35</td>
			<td align="right">10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="right" height="20" style="height:20px;">3</td>
			<td align="right">45</td>
			<td align="right">10</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="right" height="20" style="height:20px;">4</td>
			<td align="right">50</td>
			<td align="right">60</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="right" height="20" style="height:20px;">5</td>
			<td align="right">60</td>
			<td align="right">120</td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td align="right" height="18" style="height:19px;">6</td>
			<td align="right">20</td>
			<td>Hold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1 - 膜固化条件
<ol start="12">
	<li>关闭进气压力阀，并打开出气压力阀，以释放气缸内的压力。</li>
	<li>取出托盘并将其转移至超净工作台。</li>
	<li>小心剥离带纹理的聚碳酸酯膜，并小心移除PDMS间隔层。 
	注意：观察PDMS间隔层，确保其未同时将聚碳酸酯载体膜一并剥离；若发生此情况，请从另一角落重新开始剥离。
	<ol>
		<li>透过聚碳酸酯载体膜检查PDMS膜，观察是否存在通孔区域，并使用记号笔描出通孔区域的轮廓，标记膜上的任何孔洞或缺陷。</li>
		<li>使用晶圆夹持镊子将晶圆从托盘上松动。</li>
		<li>将每张膜从晶圆上取下，并放入培养皿中。 
		注意：PDMS膜将从膜晶圆上脱模，并粘附在聚碳酸酯背衬上。若PDMS开始从聚碳酸酯载体膜上脱落，请从其他区域进行剥离。</li>
		<li>将膜和晶圆存放于培养皿中，并置于室温下的正压柜内保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 上部组件组装与准备
<ol>
	<li>使用哑光胶带清洁PDMS膜以及培养皿内部，以去除碎屑。</li>
	<li>彻底用胶带粘贴每个上部组件的特征面，以去除碎屑。</li>
	<li>将上通道部件（&#34;top&#34;）特征面向上放置于含有PDMS膜的培养皿中。 
	注意：根据可用区域的大小，某些膜可能用于一个或两个上部部件。每个上部部件的主通道应位于膜上的标记区域内。</li>
	<li>将培养皿装入等离子体处理仪中。</li>
	<li>在20 W功率下对膜和上部部件进行等离子体处理45秒，氧气（O2）气压为0.80 mbar。</li>
	<li>待键合循环完成后，取出培养皿，将活化后的部件特征面向下放置在膜上，并确保部件与膜完全贴合，无气泡产生。</li>
	<li>将部件放入60 °C烘箱中至少2小时，以进行退火处理。</li>
	<li>使用手术刀沿键合后的上部部件边缘划线，将上部-膜组件从聚碳酸酯载体上分离。 
	注意：不要切割载体。</li>
	<li>划线完成后，将组件从聚碳酸酯上剥离。与上部部件键合的PDMS膜应随之从载体上剥离。</li>
	<li>使用尖头镊子移除覆盖在通向底部通道端口处的膜，并在体视显微镜下用镊子清除任何碎屑或灰尘。 
	注意：不得有任何膜残留覆盖在通路端口上。</li>
</ol>
6. 芯片组装
<ol>
	<li>将组件正面朝上，使用第5.5步中的条件对带有底部组件的部分进行等离子处理。</li>
	<li>在倒置显微镜下，将顶部组件与载玻片与底部半部分对齐。</li>
	<li>置于60 °C烘箱中至少2小时。</li>
	<li>芯片质量控制检查 
	注意：请仔细检查芯片的主要端口和通道。通过肉眼以及显微镜下观察，检查是否存在失效模式。
	<ol>
		<li>为确认芯片已完全键合，轻轻拉扯芯片的每个角落，检查是否存在分层部分。</li>
		<li>观察芯片通道，检查是否存在起皱或下垂的膜，此类情况在通道中会呈现为波浪状图案或光线偏折。</li>
		<li>进行显微镜检查，观察主通道内是否有残留物。 
		注意：非关键区域（如真空通道）内的残留物可以接受。</li>
		<li>芯片仍置于倒置显微镜下时，检查主通道和真空通道是否存在分层现象。 
		注意：非关键区域（e.g., 芯片边缘）的分层可以接受。</li>
		<li>检查主通道的对准误差是否在50-60 µm（1-2个膜孔）范围内。 
		注意：必须确保主通道与真空通道之间无重叠。</li>
		<li>检查主通道与进样及出样通道之间的膜是否完整，无任何可见孔洞。 
		注意：膜上的任何孔洞都可能导致芯片泄漏或细胞在通道外生长。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将芯片存放于培养皿中，并置于室温下的正压柜内保存。</li>
</ol>

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</ol>

D.E.I. 是 Emulate 公司的创始人并持有该公司股权，同时担任其科学顾问委员会主席。J.P. 目前是 Emulate 公司的员工。R.N.、Y.C.、J.P. 和 D.E.I. 均为已授权给 Emulate 公司的知识产权的发明人。

该制造工艺依赖高分辨率3D打印模具，用于成型PDMS上层和下层器官芯片主体部件，并结合微模压多孔PDMS膜。选择这一关键技术方案，是因为其原型制作简便，且可快速过渡到规模化生产并实现工装的更换。上层部件的模具设计可在浇铸过程中，在精确位置形成具有特定垂直轮廓的接口端口。这不仅避免了手动打孔接入端口所需的劳动，还减少了工作场所的碎屑，实现了端口与流体分配装置或仪器接口的可重复对准，并使插入的导管或插针在流体和气动连接中的配合与密封具有可控性。模具通过弹性聚氨酯片分隔后逐层堆叠于压缩夹具中，以实现端口的通孔浇铸。通过在单个夹具中堆叠多个部件，单个操作者即可在一步操作中批量浇铸出带端口的大量组件。模具的材料选择与制造方法至关重要，需提供必要的特征分辨率、低表面粗糙度以及高平整度，以满足器件组装及后续成像应用的要求。立体光刻（Stereolithography）能够满足这些要求，但需选用具有高挠曲温度（> 80 °C）且与PDMS固化兼容的材料，这限制了可用聚合物的范围。目前市场上多种可选树脂（包括含玻璃填料的树脂）均能满足这些标准。
弹性多孔PDMS膜可以说是器官芯片中最独特且最关键的组...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58151/scalable-fabrication-stretchable-dual-channel-microfluidic-organ">Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips</a>.  The Representative Results, Discussion, and References sections have been updated.
In the Representative Results section, the legend for Figure 5 has been updated from:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µL/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. Error bars indicate standard error of the mean.
to:
Figure 5: Permeability of inert tracer Cascade Blue through the microporous PDMS membrane. Cascade Blue hydrazide dye in medium was loaded into the top channel of the Organ Chip and perfused at 60 µl/h to measure the flux of the dye across the membrane into the bottom channel containing medium. Empty chips were compared to Gut Chips with Caco2-BBe1 cells in the apical channel and human vascular endothelial cells (HUVEC) in the basal channel cultured for 6 days. The apparent permeability (Papp, cm/s) of the microporous PDMS membrane was determined using the dye concentration in the outlet channels. The gut chip cell layers provide a significantly increased barrier to permeability. Error bars indicate standard error of the mean.
In the Discussion section, the fourth paragraph has been updated from:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 4). The following equation can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel and is derived from equations used primarily for Transwell studies19,20 and corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by comparing the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
<img alt="Papp formula for permeation rate analysis in a scientific study, featuring equation variables." src="/files/ftp_upload/58151/58151eq1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1">
to:
Troubleshooting the resulting Organ Chips takes place at two levels: during the fabrication process and during Organ Chip culture. We have developed a visual method for quality assurance (QA) of through-hole formation in the cast membranes that greatly accelerates the production process while improving the quality and reliability of assembled Organ Chips. This QA method allows for process troubleshooting, and we recommend keeping a record of process conditions to enable tracking fabrication problems that may occur during cell culture. During Organ Chip culture, inert tracer dyes are the simplest method of measuring barrier function to troubleshoot the fabrication process and cell culture steps. Lucifer Yellow has been used historically due to its small molecular mass and innate fluorescence, but Cascade Blue offers similar properties with a narrower emission spectrum that is less likely to interfere with downstream assays. Larger molecules, such as poly-ethyleneglycol (PEG)- or dextran-conjugated fluorophores are larger and consequently result in lower permeability overall and lower sensitivity. The apparent permeability (Papp, cm/s) of tracer dyes can be used to determine barrier function properties of organs or tissues (Figure 5). The following equation derived by Tran, et al.19 can be used to calculate Papp between the dosing channel and receiving channel, which partially corrects for tracer dye loss caused by absorption into PDMS by averaging the two output flows and not relying on mass balance assumptions at the outflow.
<img alt="Permeability coefficient equation, Papp, showing variables for diffusion analysis." src="/files/ftp_upload/58151/58151eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Equation 1">
The References section has been updated from:
<ol start="19">
	<li>Blaser, D.W. Determination of drug absorption parameters in Caco-2 cell monolayers with a mathematical model encompassing passive diffusion, carrier-mediated efflux, non-specific binding and phase II metabolism. at &lt;http://edoc.unibas.ch/655/1/DissB_7998.pdf&gt; (2007).</li>
	<li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E.G.E., Artursson, P. Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers. Nature Protocols. 2 (9), 2111-2119 (2007).</li>
	<li>Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li>
	<li>Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).</li>
	<li>Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).</li>
</ol>
to:
<ol start="19">
	<li>Tran, T.T. et al. Exact kinetic analysis of passive transport across a polarized confluent MDCK cell monolayer modeled as a single barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 93 (8), 2108–2123 (2004).</li>
	<li>Henry, O.Y.F. et al. Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function. Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li>
	<li>Maoz, B.M. et al. Organs-on-Chips with combined multi-electrode array and transepithelial electrical resistance measurement capabilities. Lab on a Chip. 17 (13), 2294-2302 (2017).</li>
	<li>Benam, K.H. et al. Matched-Comparative Modeling of Normal and Diseased Human Airway Responses Using a Microengineered Breathing Lung Chip. Cell Systems. 3 (5), 456-466.e4 (2016).</li>
</ol>

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58151/scalable-fabrication-stretchable-dual-channel-microfluidic-organ">Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips</a>.&#160; The Representative Results, Discussion, and References sections have been updated.

Erratum: Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

在此，我们介绍一种可规模化制备双通道、血管化器官芯片微流体培养装置的方法。该方案适用于无法使用洁净室和传统软光刻工具的研究团队。这些装置旨在重现人体器官水平的功能，以研究正常与疾病生理学以及药物反应。 体外1,2. 实现这一功能的关键在于由半透膜分隔的两个灌注微流控通道（图1这种设计能够重建至少两种组织之间的组织-组织界面，通常在多孔膜的一侧培养器官实质细胞，另一侧培养血管内皮层，同时可使这些细胞暴露于流体流动环境中。此外，由于采用弹性聚合物聚二甲基硅氧烷（PDMS）制造器官芯片的主体和膜组件，因而可对整个工程化的组织-组织界面施加周期性机械应变。 通过 弹性膜以模拟活体器官的天然物理微环境，例如肺部的呼吸运动和肠道的蠕动。
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58151/58151fig1.jpg" /> 
图1：器官芯片横截面。 器官芯片由两个通道组成，中间由多孔弹性膜隔开，膜的两侧均可接种细胞。上通道横截面为1 mm宽 × 1 mm高，下通道横截面为1 mm宽 × 0.2 mm高，上下两部分的真空通道均为0.3 mm宽、0.5 mm高，且距离流体通道0.3 mm。&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58151/58151fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
这些可拉伸的双通道器官芯片已被用于研究呼吸运动对肺部纳米颗粒吸收的影响以及药物诱导的肺水肿3,4; 蠕动运动对分化的影响5 肠道细菌过度生长5,6,7以及心脏搏动引起的周期性形变对肾脏肾小球足细胞分化与成熟的影响8此外，这类双腔室装置包含一个由细胞外基质（ECM）包被的膜将血管腔与另一可独立灌注腔室中的实质细胞分隔开，血管腔内衬有内皮细胞，非常适合用于药物药代动力学（PK）参数的表征以及新靶点的发现，而这些应用在单灌注通道系统中受到限制。此外，多个器官芯片可相互连接 通过 其血管通道可有效构建人体芯片系统，有望提供一种颇具吸引力的人体 体外 治疗开发平台9,10. 与大多数微生理系统（MPS）不同11,12,13，器官芯片包含由多孔膜分隔的两个微流体通道，该膜可促进血管-实质相互作用，以模拟 体内 器官功能。这不仅通过在血管通道中灌注共同的培养基来简化不同器官之间的连接，而且组织与体液的区室化也模拟了 体内 功能并支持药代动力学实验与建模，以及 体外-体内 外推法9,10 这在单通道MPS中难以实现或根本无法实现14,15,16聚二甲基硅氧烷在微流控装置中的广泛应用促使了相关工具的开发，以克服该材料固有的吸附小分子能力10,17然而，在需要使用微生物试剂和PDMS吸附性化合物的生物学研究中，由于所需芯片数量庞大且难以重复利用，即便是小型研究团队也需要可扩展的制造工艺。本文所述方案提供了一种适用于学术实验室的芯片制备方法，即使缺乏洁净室和软光刻设备的实验室亦可采用。该方案旨在使更广泛的研究人员能够获取器官芯片，用于研究基础生物学过程以及转化治疗开发中的可拉伸双通道芯片装置。
结合微制造领域的最佳实践与面向制造的设计理念，我们开发出一种稳健的方法，可大批量、高重复性和高得率地制备器官芯片装置。本文所述的制备方案为器官芯片的规模化生产提供了一种可扩展的方法。我们介绍了可选的原位模具夹具（Mold-in-Place Jig，MiP；设计细节见补充材料）与聚氨酯密封条联用的方法，以实现PDMS组件的批量浇铸。聚氨酯条的光面可产生光学上光滑的PDMS部件，而其纹理面则有利于脱模。我们还描述了可选的自动膜制备仪（Automated Membrane Fabricator, AMF）的使用，该装置在固化过程中对膜晶圆模具施加均匀压力，每批次可制备多达24片膜。该设计广泛适用于由承受机械应变和灌注的组织构成的器官研究，且这些芯片可实现较低的芯片间变异度，并能满足从小型到大型研究团队不同规模的需求。该工作流程可采用批处理或流水线模式，易于与质量评估协议整合，用于生产过程控制、人员培训及响应式故障排查。我们希望本方案能够进一步扩大基础研究和转化研究对双通道、可拉伸器官芯片技术能力的获取与应用。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;个人防护装备&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>发网</td><td>VWR</td><td>89107-770</td><td></td></tr><tr><td>杜邦特卫强实验服</td><td>VWR</td><td>13450-506</td><td></td></tr><tr><td>加长袖口手套</td><td>VWR</td><td>89521-898</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;仪器设备&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>切割垫</td><td>VWR</td><td>102096-430</td><td></td></tr><tr><td>瓷砖切割机</td><td>McMaster-Carr</td><td>26765A31</td><td></td></tr><tr><td>原位成型（MIP）上模</td><td>Protolabs, Inc.</td><td>定制</td><td>使用 Prototherm 12120 打印</td></tr><tr><td>原位成型（MIP）底模</td><td>Protolabs, Inc.</td><td>定制</td><td>使用 Prototherm 12121 打印</td></tr><tr><td>鸭嘴形弯头镊子</td><td>VWR</td><td>63041-864</td><td></td></tr><tr><td>尖头镊子</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72700-D</td><td></td></tr><tr><td>金属刮勺</td><td>VWR</td><td>&amp;nbsp;82027-528</td><td></td></tr><tr><td>深反应离子刻蚀（DRIE）&amp;nbsp; 柱阵列晶圆</td><td>Sensera, Inc.</td><td>定制</td><td>每片晶圆包含四个 50 × 50 mm 的柱状阵列；柱体宽 7 μm，高 50 μm，呈六边形排列，间距 40 μm</td></tr><tr><td>带纹理的聚碳酸酯 .01&amp;rdquo; 厚</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K33</td><td>切成45毫米见方</td></tr><tr><td>PDMS 块（40 × 40 × 5 mm）</td><td>n/a</td><td>定制</td><td></td></tr><tr><td>层流罩</td><td>无菌</td><td>BVBI</td><td>自行制备</td></tr><tr><td>气枪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>60&amp;deg;C级烘箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>质量平衡</td><td></td><td></td><td>精确至0.1 g</td></tr><tr><td>等离子体机器</td><td>迪纳</td><td>纳米</td><td>氧气等离子体功能至关重要</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;材料与试剂&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 聚二甲基硅氧烷（PDMS）基础剂/固化剂套装</td><td>埃尔斯沃思粘合剂&amp;nbsp;</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>混合杯</td><td></td><td></td><td>处理预聚物时应确保充分通风，因其含有微量乙苯</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>VWR</td><td>10099-395</td><td></td></tr><tr><td>洁净室擦拭布</td><td>VWR</td><td>TWTX1080</td><td></td></tr><tr><td>25 x 75 mm 玻璃载玻片</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>封口胶带</td><td>VWR</td><td>500043-724</td><td></td></tr><tr><td>透明胶带</td><td>VWR</td><td>500026-873</td><td></td></tr><tr><td>模切聚氨酯（PU）条</td><td>大西洋垫圈公司</td><td>custom: AGWI2X3</td><td>&amp;nbsp;1/8&amp;rdquo; 厚型；60 邵氏硬度黑色聚氨酯；2&amp;rdquo; x 3&amp;rdquo;</td></tr><tr><td>聚碳酸酯膜，0.005&amp;rdquo; 厚</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K102</td><td></td></tr><tr><td>100 x 100 x 15 mm 方格培养皿</td><td>VWR</td><td>60872-480</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;可选设备&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thinky PDMS 混合器</td><td>Thinky</td><td>ARE-310</td><td></td></tr><tr><td>原位成型（MIP）夹具</td><td>内部</td><td></td><td>螺钉夹紧压缩夹具</td></tr><tr><td>自动膜制备仪（AMF）</td><td>自主研发</td><td></td><td>可编程加热器气动压缩活塞阵列</td></tr></tbody></table>

可扩展的可拉伸双通道微流控器官芯片的制备

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

大量先导化合物在药物研发管线中失败，原因是动物研究通常无法准确预测人类患者的临床反应。人体器官芯片（Organ Chip）微流控细胞培养装置提供了一种实验方法 体外 用于评估人体内的疗效、毒性和药代动力学（PK）特征的平台，可能比动物实验更能准确预测临床治疗效果与安全性。这些装置可模拟几乎所有器官类型的功能，并可通过共用的内皮细胞衬覆微通道进行流体连接，以实现 体外 无需在人体上进行实验即可开展人体器官层面及整体生理学研究。这些器官芯片由两条灌注式微流控通道组成，通道之间由可渗透的弹性膜隔开，膜的一侧接种有器官特异性的实质细胞，另一侧为微血管内皮细胞，该膜可周期性拉伸以提供器官特异性的机械刺激例如， 肺部呼吸运动）。本方案详细介绍了利用3D打印模具通过铸造法制造柔性双通道器官芯片的方法，可实现多种铸造及后续加工步骤的整合。采用在压力作用下使用硅柱阵列的方法，可铸造出具有微米级通孔的多孔聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜。器官芯片的制备与组装所涉及的设备和步骤均可在传统洁净室之外实施。本方案使研究人员能够便捷地获取器官芯片技术，用于 体外 药物发现、安全性和有效性测试，以及基本生物过程的机制研究中的器官和整体水平研究。

本文所述方案介绍了一种可扩展的PDMS器官芯片的制备方法。该装置可在弹性多孔膜上实现两种不同灌注组织类型的培养（图1）。PDMS 通道使用 3D 打印模具进行浇铸，可加快新设计的原型制作（图&#160;2A 以及 2B）。上层通道在模具中通过压缩柔性聚氨酯垫圈铸造，以制备带有模压接口的部件（图 2C）而底部通道组件则在托盘中浇铸，并以显微镜载玻片作为基底进行操作（图 2D）。这种制备方法将各部件的多尺度图案化整合到一步完成，节省了时间，提高了可重复性和可追溯性，并减少了因打孔和多次切割产生的碎屑。多孔膜对于器官芯片的功能至关重要，而采用在图案化硅片上浇铸成型的制备方法可获得厚度一致、表面光洁度良好的膜结构。图3）。操作 通过 ...

本文介绍一种用于重现器官水平功能的可拉伸双通道器官芯片微流控细胞培养装置的制备方案 体外.

许多先导化合物在药物研发管线中失败，原因是动物研究通常无法预测人体的临床反应。

本方案的总体目标是描述用于在体外模拟器官功能的器官芯片微流控装置的制备方法。该方案介绍了一种在体外重现器官水平功能的器官芯片装置的制备途径。这类装置实际上是利用软质硅橡胶通过3D打印模具制成的。这种橡胶材料使我们能够真正赋予这些装置以机械信号，从而可以像在肺部或肠道中那样对组织进行拉伸。我们还加入了灌注系统，以模拟血液及其他体液在器官系统中的流动。现在，综合来看，这些装置使我们能够真实地重建并尝试理解体内发生的复杂生理过程。但这是在体外进行的。因此，我们本质上是在人体上进行实验，但并非直接在活人身上进行。这是一种非常有效的方法，能够弥合动物研究与人体研究之间的鸿沟。动物研究通常在治疗手段的临床前开发阶段进行，而人体研究则被称为临床试验，后者对人体安全带来的风险要大得多。因此，这些设备有助于弥合差距，使我们能够开发新的治疗方法，并深入了解在人体等复杂系统中实际发生的基本生物学过程。上通道制备：用乙醇和洁净室擦拭纸擦拭每块聚氨酯部件的光面。将聚氨酯的光面覆盖在模具的开口侧并放好。将模具和聚氨酯组件放入夹具中，使纹理面紧贴夹具的一端。重复此操作，直至所有模具均放置于夹具内。使用扳手旋转夹具的手柄将其拧紧，直至夹具间距宽度为 25 毫米。用铝箔制作一个小船状结构，围绕并固定在模具夹具周围。将 PDMS 倒入每个模具的孔中，直至注满。当整个夹具充满后，将其放入真空干燥器中。一小时后，从干燥器中取出，并置于60 °C的烘箱中至少四小时。使用扳手拆卸夹具。从每个模具上取下聚氨酯条，并丢弃。小心地将PDMS部件从模具中脱模，并将其有结构的一面朝上放置。将刮刀的刀片对准端部标签的缺口处，切割掉两端，以分离顶部组件。将制备好的部件存放于方形培养皿中，并在室温下置于正压柜中保存。底部通道制备。将10.5克PDMS倒入模具中。可非常轻柔地使用气枪将PDMS均匀铺展至整个空间。将模具放入真空干燥器中。一小时后，将模具转移至水平放置的60摄氏度烘箱中。在超净工作台内的桌面上放置模具。从模具边缘松动PDMS。抓住一个角落，轻轻将PDMS从模具表面剥离。完全取下后，翻转并平放在工作台面上，使通道结构朝上。使用瓷砖切割器沿外边缘进行切割。使用扁平桨状镊子将部件的功能面朝上放置在胶带上，以去除任何碎屑。从封箱胶带上取下部件。将部件的松动端在载玻片上拖动。 松散的一端将与玻璃粘合。用透明胶带覆盖表面特征。将部件存放在室温下的正压柜中。PDMS 膜制备。检查晶圆背面是否无 PDMS。将每片膜晶圆放入指定的槽位中。使用1 mL注射器将0.9 mL PDMS置于每个膜片微柱阵列的中心。静置PDMS至少五分钟，使其充分扩散至膜片微柱的各个部位。在PDMS覆盖至少75%的微柱阵列之前，请勿进入下一步。使用本方案中所述条件对聚碳酸酯条带进行等离子体处理。将聚碳酸酯片从等离子体处理仪中取出，并使用剪刀将其裁剪

scalable-fabrication-stretchable-dual-channel-microfluidic-organ

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

可伸缩、双通道、微流控芯片制造

我们展示了制造和自动化弹性聚二甲基硅氧烷（PDMS）微阀阵列的方案，该阵列无需额外能量即可关闭，并具有光刻定义的精确体积。同时介绍了并行亚纳升级体积混合器和集成式微流控灌注系统。...

由弹性微阀阵列控制的微流控芯片

我们介绍了两种用于三维细胞培养的多孔聚合物芯片微加工工艺。第一种是热压印与溶剂蒸气焊接工艺相结合的方法。第二种则采用 recently developed...

芯片级三维细胞培养支架的微加工

我们介绍一种简单的方法，用于制备微流控装置，可在无需洁净室或软光刻技术的情况下，对多种不同菌株施加类似的动态条件。...

一种用于研究多种不同菌株的微流控装置

一种微通道芯片平台通过结合光刻可重铸光刻胶技术、软光刻技术和微流控技术而开发。该内皮化微通道平台可模拟三维（3D）几何结构 体内...

多深度圆形截面血管内皮化微通道芯片的制备方法

本文介绍了一种在微流控多器官芯片中对原代细胞、组织模型和打孔活检样本进行共培养的实验方案，培养时间可长达28天。人皮肤微血管内皮细胞、肝细胞聚集体和皮肤活检组织已成功在共同培养基循环系统中实现联合培养。...

多器官芯片——一种用于长期多组织共培养的微流控平台

本文介绍了一种集成电极的器官芯片装置的制备方法，用于直接定量跨内皮细胞电阻（TEER）。为验证该方法，利用该微流控装置模拟了血脑屏障，并对其屏障功能进行了监测。所提出的电极集成与直接TEER定量方法具有广泛的适用性。...

集成电极以直接量化跨内皮电阻的器官芯片系统的构建与验证

目前已有多种方法可用于在聚二甲基硅氧烷微流控器件中制备具有非矩形截面的通道。大多数方法涉及多步制造过程和复杂的对准操作。本文报道了一种通过聚二甲基硅氧烷顺序湿法刻蚀实现不同几何横截面微流控通道制备的单步方法。...

通过连续湿法刻蚀工艺一步法制备不同几何截面的聚二甲基硅氧烷微流控通道

血脑屏障（BBB）是一种多细胞构成的神经血管功能单元，可严格调控大脑内环境的稳态。通过结合人诱导多能干细胞（iPSCs）与器官芯片技术，我们构建了一种可用于疾病建模及中枢神经系统药物穿透能力预测的个体化血脑屏障芯片。本文详细描述了该血脑屏障芯片的制备与操作流程。...

人源iPSC衍生的血脑屏障芯片的制备

我们介绍一种用于复杂生命机制高通量研究的微流控系统，该系统包含1500个培养单元、一组增强型蠕动泵以及一个现场混合模块。该微流控芯片可实现对体内高度复杂且动态变化的微环境条件进行分析。...

利用高通量微流控装置产生动态环境条件

本方案描述了开放式顶盖器官芯片（Open-Top Organ-Chip）的功能及其建立和成熟原代组织（皮肤、肺泡、气道和肠道）全层器官芯片培养所需的关键培养模式，为研究人类上皮/间充质与血管微环境界面的多种功能特性提供了机会。 体外.

在开放式器官芯片上重建人类上皮组织的细胞结构与功能

学习使用3D打印模具和软硅橡胶制造可伸缩双通道器官芯片微流控装置。该方法通过机械拉伸和灌注系统模拟器官级功能，为药物测试和疾病建模提供可靠平台。

可扩展的可拉伸双通道微流控器官芯片的制备

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