Name: 高通量钙流量测定对甘氨酸/d-丝氨酸和谷氨酸敏感的 NMDA 受体的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 48 s
Description: 了解高通量钙流量测定法研究NMDA受体活性，使用HEK 293细胞表达NR1/NR2A亚基，评估小分子调节剂对谷氨酸和甘氨酸结合位点的影响，为神经疾病药物开发提供药理学依据。

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作者感谢Post Baccalaureate Scholars计划办公室以及诺华生物医学研究中心整体对本研究的资助。

1. 细胞的制备
注意：本实验方案（包括数据生成）使用经编码 NR1 和 NR2A 的杆状病毒感染的 HEK293 细胞。
<ol>
	<li>接种适当数量的HEK293细胞，并加入适当终浓度的NR1和/或NR2A病毒（每种各1.00 µL）。对于384孔板，每孔接种10,000个细胞，终体积为30 µL。</li>
	<li>或者，直接接种适当数量和体积的HEK293-NR1-NR2A细胞（对于384孔板，每孔接种10,000个细胞，终体积为30 µL）。加入终浓度为2 µg/mL的四环素以诱导NR2A表达，并加入保护性化合物（100 µM MDL105,519 或 5 µM CGP07066724）。</li>
	<li>注意：编码NR1和NR2的杆状病毒滴度应约为每毫升5 × 109 至 10 × 109 个感染单位24。</li>
</ol>
2. NMDA受体活性的测定
<ol>
	<li>在存在保护性化合物的情况下，准备一个384孔板，其中含有转导了NR1/NR2或HEK293-NR1-NR2A细胞的HEK293细胞。使用透明底、黑色边框、聚-D-赖氨酸包被的培养板。 
	注意：使用100 µM MDL105,519可赋予细胞对甘氨酸的敏感性，而使用5 µM CGP070667可赋予细胞对谷氨酸的敏感性。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育16小时（过夜）。</li>
	<li>从孵育箱中取出培养板，将板缓慢翻转至合适的生物废弃物容器上方，轻柔地弃去细胞培养基。将板轻轻在纸巾上轻拍，以清除板边缘残留的培养基并排干剩余液体。</li>
	<li>通过将一管钙6染料（适用于1块板）溶于10 mL孵育缓冲液（HBSS，pH 7.5，20 mM HEPES，1 mM MgCl2，1 mM丙磺舒）来配制钙6染料。将培养板在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。</li>
	<li>从孵育箱中取出培养板，让细胞在室温下适应10分钟。</li>
	<li>按照步骤2.3所述方法轻柔倒出钙6染料，并向每孔加入30 µL检测缓冲液（HBSS，pH 7.5，20 mM HEPES，1.8 mM CaCl2，1 mM丙磺舒）。</li>
	<li>重复步骤2.6两次，共洗涤3次。最后一次洗涤后，每孔保留30 µL检测缓冲液。</li>
	<li>让细胞在室温下静置5分钟。</li>
	<li>通过配制400 µM甘氨酸和400 µM谷氨酸的4倍浓缩液（终浓度为100 µM；配体的最佳浓度应根据下文所述方法确定），制备配体板。将至少25 µL配体储备液转移至V型底384孔板中。</li>
	<li>将配体板和细胞板装入FDSS（功能性药物筛选系统）中。</li>
	<li>记录细胞板30秒的基础荧光值（Fo）。使用FDSS的加样功能，将10 µL配体储备液加入细胞板中，并通过连续记录钙6染料荧光信号5分钟来检测钙离子流变化。</li>
	<li>通过将检测到的最大荧光值除以基础荧光值，计算最大荧光比值（Fmax/Fo）。</li>
</ol>
3. NMDAR 表达水平的优化
<ol>
	<li>为确定使用杆状病毒的最佳用量，对NR1和NR2A病毒分别进行滴定。准备一块384孔板，每孔接种HEK293细胞（建议每孔10,000个细胞，培养基30 µL），并按步骤2.1所述加入保护性化合物。</li>
	<li>在板的不同行中加入不同量的NR1病毒（例如：在A至E行分别加入0 µL、2 µL、1 µL、0.5 µL、0.25 µL）。设置重复孔以提高数据准确性。</li>
	<li>在板的不同列中加入不同量的NR2A病毒（例如：在A至E列分别加入0 µL、2 µL、1 µL、0.5 µL、0.25 µL）。设置重复孔以提高数据准确性。</li>
	<li>将板置于37 °C、5% CO2条件下孵育16小时（过夜）。</li>
	<li>通过FDSS进行钙流检测（见上文），确定NR1与NR2A病毒的最佳比例和用量。</li>
</ol>
4. 配体滴定
<ol>
	<li>按照步骤 2.3 所述方法准备细胞。</li>
	<li>在另一种配体达到饱和浓度（100 µM）的条件下，将每种配体配制成 4 倍浓度的储备液进行稀释。例如：若甘氨酸的终浓度为 10 µM，则需制备含有 400 µM 谷氨酸的 40 µM 甘氨酸储备液。</li>
	<li>按照步骤 2.11 所述方法进行 FDSS 检测。</li>
</ol>
5. 化合物测试
<ol>
	<li>按照步骤1所述准备细胞。</li>
	<li>用测定缓冲液配制配体板，其中配体的储备浓度为最终浓度的5倍。</li>
	<li>用测定缓冲液配制化合物板，其中化合物的储备浓度为所需最终浓度的4倍。若在测定缓冲液中化合物的最终浓度为10 µM，则应配制40 µM的储备溶液。
	<ol>
		<li>在将化合物进一步稀释至测定缓冲液前，先用二甲基亚砜（DMSO）对化合物进行预稀释，以确保所有样品中DMSO的浓度保持一致。</li>
		<li>若最终测定中化合物的剂量反应范围为3至30 µM，则应先用DMSO将化合物预稀释至1至10 mM的范围，再将这些预稀释液用测定缓冲液稀释至4倍储备浓度。DMSO的最终浓度不得超过0.5%。 
		注意：建议每个样品设置三个重复孔进行检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将配体板、化合物板和细胞板装入FDSS仪器中。</li>
	<li>测量30秒的基础荧光信号。</li>
	<li>加入10 µL化合物储备液，随后连续测量5分钟的荧光信号。</li>
	<li>加入10 µL配体储备液，随后连续测量5分钟的荧光信号。</li>
	<li>通过计算测量最后5分钟内荧光比值曲线下的面积，确定荧光比值的积分值。 
	注意：也可采用加入配体后达到的最大荧光比值进行分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者无利益冲突，无可披露内容。

该实验的成功在很大程度上取决于所用HEK细胞的健康状态。应使用处于指数生长期且传代次数较低的细胞。本实验涉及多次溶液转移和添加操作，因此谨慎操作可确保结果的更高准确性。化合物及其他所有试剂的浓度也应仔细核对，以尽量减少误差。在钙流实验中用检测缓冲液替换细胞培养基时，应轻轻倾斜培养板，以防止细胞脱落。最后，本方案中使用聚-D-赖氨酸包被的培养板可增强细胞在板上的贴附性。
在转导时，根据HEK293细胞的传代次数和细胞状态，NMDAR的表达水平以及亚基表达所需的病毒量可能存在差异。此外，杆状病毒的保质期较短，通常为六个月至一年。因此，病毒的质量是本实验的重要参数。在进行后续实验之前，可采用标准免疫荧光实验来检测并确认NMDAR亚基的表达水平和定位情况24。本方案也可用于其他细胞系研究NMDA受体。然而，在使用杆状病毒表达NMDAR之前，必须先验证细胞系对该系统的耐受性及表达能力；否则，可能会出现意外结果。此外，已有报道指出，某些化合物（如拓扑异构酶II抑制剂）可提高杆状病毒表达系统的效率29...

随着医学的不断进步，人类预期寿命显著延长；然而，与年龄相关疾病的患病率也随之上升。中枢神经系统（CNS）疾病，如精神分裂症、肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默病和帕金森病等，也不例外，预计在未来十年内将呈现增长趋势1,2,3。离子型谷氨酸受体（即N-甲基-D-天冬氨酸受体，NMDAR）功能障碍已被证实与阿尔茨海默病、精神分裂症、创伤性脑损伤、中风、糖尿病和青光眼等多种疾病相关，这凸显了深入研究其生物学特性以开发有效的、可改变疾病进程的治疗方法的必要性4,5,6,7。
NMDAR 由四个单体或亚基组成4,8,9。NMDAR 的结构组成在大脑中具有发育阶段和区域分布的差异性7,10。NMDAR 参与突触可塑性、认知功能以及呼吸和运动节律的产生11,12,13。作为一种电压门控通道，它在静息膜电位（-70 mV）下基本不导通，并被镁离子阻断以防止其他离子进一步通透。该通道通过两种配体——谷氨酸和甘氨酸/D-丝氨酸——的结合，并在突触膜上由 AMPA 受体（另一类离子型谷氨酸受体）介导的同步去极化作用下被激活。去极化可解除镁离子对 NMDAR 的阻断，从而允许阳离子（尤其是钙离子）内流14,15,16。尽管 NMDAR 的激活对细胞存活至关重要，但其过度激活可通过兴奋性毒性导致细胞死亡17,18,19。此外，由于该受体结构复杂，这使得开展有效治疗策略所需的研究变得极具挑战性。
已开发出多种方法用于研究NMDAR。然而，每种方法均存在相应的局限性。例如，一种广泛使用的技术是基于荧光的检测方法，该方法通过四环素诱导型启动子（Tet-On）调控的稳定细胞系，检测NMDAR介导的细胞内钙离子变化20。然而，在该系统中，需要使用超最大浓度的配体，且在检测过程中必须存在NMDAR抑制剂，这使得几乎无法检测到竞争性拮抗剂的活性。在其他类似系统中，功能性受体的表达会引起细胞毒性，因此需要使用氯胺酮等通道阻滞剂21,22以维持细胞培养。这些通道阻滞剂结合于受体核心部位，难以彻底洗脱，尤其是在基于孔板的实验体系中，因而会干扰受体的功能性研究。最后，在膜片钳等电生理学检测中，通量有限，大规模研究成本极高23。此外，上述系统对甘氨酸刺激均不敏感，因此研究NMDAR的甘氨酸依赖性活性成为一项挑战。
在此，我们介绍一种研究NMDAR的新方法，可克服上述局限性。该技术利用杆状病毒表达系统，在短短16小时内即可实现受体的功能性表达，并确保亚基间的理想比例。此外，杆状病毒的使用提供了一种简便且可组合的方法，能够对不同类型的重组NMDAR亚型进行广泛表征。与其他检测方法不同，本方案无需使用通道阻滞剂，因其采用了弱拮抗剂。该方法的最大优势在于，在洗脱弱拮抗剂后，受体不仅可对单个甘氨酸和谷氨酸结合位点进行调控，还可同时对甘氨酸/D-丝氨酸和谷氨酸配体结合位点进行双重调控。该检测方法重现了NMDAR受体已知的药理学特性及其已知的正向与负向调节剂的作用效果。最后，该方法的建立为 体外 细胞实验克服了过量钙离子内流引起的细胞毒性，能够以高通量方式对受体进行功能研究，从而加速发现疾病状态下NMDAR调节剂。

<table><tbody><tr><td>HEK-293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>人NMDA（NR1/NR2A）受体细胞系</td><td>ChanTest Corporation</td><td>CT6120</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac Dual表达载体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10712-024</td><td></td></tr><tr><td>Corning 384孔透明平底微孔板</td><td>Corning Life Sciences</td><td>3844</td><td></td></tr><tr><td>FLIPR Calcium 6-QF检测试剂盒</td><td>Molecular Devices</td><td>R8192</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>D-丝氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4250</td><td></td></tr><tr><td>L701,324</td><td>Tocris</td><td>907</td><td></td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>Boston Bio Product</td><td>BB-103</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63069</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>VWR</td><td>E506</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>丙磺舒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36400</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX培养基</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>MDL105,519</td><td>NIBR</td><td>Synthesized in house</td><td></td></tr><tr><td>NVP-AAM077</td><td>NIBR</td><td>Synthesized in house</td><td></td></tr><tr><td>CGP070667</td><td>NIBR</td><td>Synthesized in house</td><td></td></tr></tbody></table>

一种高通量钙流检测法，用于研究对甘氨酸/d-丝氨酸和谷氨酸敏感的nmda受体

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体（NMDAR）属于离子型谷氨酸受体，在学习和记忆过程中发挥关键作用。NMDAR功能异常，无论是由于突变、表达改变、转运或定位异常所导致的过度或不足活性，均可能引发多种疾病，尤其是在中枢神经系统中。因此，深入了解该受体的生物学特性，并推动化合物和小分子的发现，对于当前防治神经系统疾病的努力至关重要。目前研究该受体的方法存在诸多局限性，包括通量低、成本高，以及由于必须使用通道阻滞剂以防止NMDAR介导的兴奋性毒性，而无法研究其功能特性。此外，现有的检测系统仅对谷氨酸刺激敏感，缺乏对甘氨酸（NMDAR的另一共配体）刺激的敏感性。本文中，我们首次报道了一种基于微孔板的高通量检测方法，可用于研究对两种共配体（谷氨酸和D-丝氨酸/甘氨酸）均敏感的NMDA受体。该方法能够研究不同NMDAR亚基组成，并可在甘氨酸和/或谷氨酸敏感模式下进行受体的功能研究。此外，该方法在检测过程中无需使用抑制剂。本检测体系可检测正向和负向变构调节剂的作用，且我们系统中已成功重现了NMDAR已知的药理学特性。该技术克服了现有方法的局限性，且具有成本效益。我们相信，这一新技术将加速针对NMDAR介导病理的治疗手段的发现。

在测试小分子的作用之前，必须确定NMDARs的最佳表达水平以及最佳配体浓度。如所述，将HEK293细胞以每孔10,000个细胞的密度接种于384孔板中，并加入5 µM CGP060667，随后用不同量的NR1和NR2A病毒进行转导。过夜孵育后，检测配体诱导的钙流变化（图1）。这些实验结果揭示了每个亚基所应使用的病毒最佳数量和比例（图1，黄色框）。
在确定了NR1和NR2A转导的最佳数量和比例后，进行配体滴定实验以确定激活NMDAR的最佳配体浓度。为此，在固定且饱和的另一种共配体浓度下，将其中一种共配体以不同浓度添加（图2A-2B）。对于其他NMDAR亚基组合（如NR1/NR2B和NR1/NR2D）也获得了类似结果（<strong class=...

本实验方案的目标是促进对NMDA受体（NMDAR）的大规模研究，并允许检测小分子的调节作用及其治疗应用。

一种高通量钙流检测法，用于研究对甘氨酸/D-丝氨酸和谷氨酸敏感的NMDA受体

N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体（NMDAR）属于离子型谷氨酸受体，在学习和记忆过程中发挥关键作用。NMDAR……

该方法有助于发现可用于治疗神经系统疾病的NMDA受体调节剂。该技术的主要优势在于，能够针对化合物中配体的不同浓度或组合，深入研究NMDA受体的活性变化。因此，该方法可为NMDA受体的整体功能特性提供重要见解。它还可用于研究生物学中特定的亚型以及NMDA受体对配体或化合物的敏感性。为检测NMDA受体的活性，准备一个384孔板，其中含有转导了NR1、NR2或HEK 293、NR1、NR2A细胞的HEK 293细胞，并加入保护性化合物。随后，将该板在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育16小时。第二天，从培养箱中取出培养板，将培养板缓慢翻转至合适的生物废弃物容器上方，轻轻弃去细胞培养基。将培养板轻拍于纸巾上，以清除培养板边缘的培养基，并沥干残留液体。随后，将一管钙6染料溶于10毫升孵育缓冲液中，配制钙6染料溶液。向384孔板中的细胞加入30微升染料。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2小时。2小时后，从培养箱中取出培养板，让细胞在室温下适应10分钟。接下来，轻轻倒出钙离子6染料，加入30 µL的检测缓冲液。重复洗涤共三次，最后一次洗涤后在细胞上保留30 µL检测缓冲液。然后，将细胞在室温下静置五分钟。为制备配体板，配制浓度为 400 微摩尔的甘氨酸和 400 微摩尔的谷氨酸四倍储备液。将至少 25 微升配体储备液转移至 V 型底 384 孔板中。随后将配体板和细胞板放入 FDSS 仪器中。随后，测量细胞板的基线荧光强度，持续 30 秒。使用 FDSS 加样功能，将 10 微升配体储备液加入细胞板中，并记录钙 6 染料荧光信号，持续 5 分钟以检测钙流变化。之后，通过将获得的最大荧光强度除以基线荧光强度，计算最大荧光比值。为了测试化合物，需准备细胞、配体和化合物板。将配体、化合物和细胞板放入FDSS仪器中。随后，测量30秒的基线荧光信号。加入10 µL化合物储备液，测量5分钟荧光信号。随后，加入10 µL配体储备液，继续测量5分钟荧光信号。之后，通过计算测量最后5分钟内荧光比值曲线下的面积，确定荧光比值的积分。利用预先确定的最佳配体和亚基表达条件，通过钙流测定法表征了谷氨酸结合位点拮抗剂NVP-AAM077和甘氨酸结合位点拮抗剂L701,324在指定浓度下对NR1和NR2A的作用。在加入NVP-AAM077和L701,324后，分别使用在另一种配体饱和浓度存在下的甘氨酸或谷氨酸的eZ80浓度进行实验。在执行该操作时，需注意利用本实验优化适用于该特定细胞系的各种试剂用量。应使用健康且未汇合的细胞。在化合物和配体的稀释过程中需格外注意。完成此步骤后，可进一步开展其他方法，如电生理学实验，以探究特定作用机制或其化合物相关的其他问题。

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量化原代小鼠中脑神经元中自发性 Ca2+ 流及其下游效应

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肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

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