以此 T7 噬菌体的定量 PCR 研究

这种方法可以帮助回答病毒学和微生物学领域与从复杂样品和基于噬菌体的诊断和治疗中列举噬菌体相关领域的关键问题。该技术的主要优点是，它能够对噬菌体显示生物平移实验中的大量样品进行时间高效、准确的定量，这与传统测定相比是行不通的。演示这个程序将是拉什米莫汉蒂和贾斯米姆莱尔，研究生从我的实验室。

在设计底剂并创建库存浓度后，以每微升0.1微克的浓度获取参考T7噬菌体DNA。使用超纯水，连续稀释该DNA十倍，从每微升一百万倍图到每微升一个女性图，在0.2毫升PCR管中。准备每个浓度的20微升，确保改变移液器尖端和涡流管之间的稀释阶段。

然后将T7噬菌体参考DNA浓度从微升的femttogram转换为每微升的基因组拷贝。首先，移液器200微升样品T7噬菌群克隆成1.5毫升的微型离心管，用于10个所需样品。在每个管中添加两个DNase的微升。

在加热干燥浴中，在37摄氏度下将管子盖住并孵育10分钟。然后在100摄氏度下在加热干燥浴中孵育15分钟。将含有热处理噬菌体的管在18，534次g下离心10秒。

将离心管放在触摸激活模式下的涡流混合器上 10 秒钟，以混合噬菌体。在 18，534 次 g 下再次旋转，10 秒。在此之后，将样品留在实验室长椅上约一小时，以冷却至室温。

为10个浓度不详的生物活化噬菌板样品和7个三酸钠标准浓度样品准备qPCR预混料。为 51 个样品提供预混，包含 255 微升 qPCR 主混合、51 微升底料和 102 微升水。将8微升的已准备好的PCR混合成96孔qPCR板的51孔。

接下来，在每口井中加入两个经过热处理的T7噬菌口样品微升，将其分配到 qPCR 预混料的表面之下。使用胶膜密封板。将板包裹在铝箔中，以尽量减少荧光光漂白，然后在 qPCR 设备上运行板。

设置循环条件和融化曲线设置，如文本协议中概述的。运行 qPCR 后，从原始数据中分析放大图、熔体曲线图和多分点图。放大图指示每个样品的 PCR 放大是否成功。

多组分图表示荧光信号在整个放大周期中的放大和衰减。虽然熔体曲线图用于验证底像的特异性，因为每个 PCR 产品都有一个独特的熔化温度。然后从参考DNA生成标准曲线。

在这里，扩增效率计算为92.4%的代表性数据从qPCR研究然后比较相同的噬菌群，由双层斑块测定量化在测试范围内1000万至1000万基因组拷贝每微升。如这里所见，qPCR定量中的噬菌体数量高于斑块测定。qPCR方法以方差系数表示的可重复性在尝试此程序时，其值为2.85至27.2%，重要的是要记住，在开发和使用qPCR时有许多因素可以准确量化噬菌体，包括仔细处理和制备样品以及校准相关设备。

按照这种方法，可以执行其他技术，以枚举在维他生物平移、噬菌体库DNA制备以及复杂环境样品中下一代测序和噬菌体检测的各种应用中的噬菌体颗粒。不要忘记，噬菌体在实验室中被视为生物危害，在执行手术时应始终佩戴个人防护设备（包括手套和实验室外套）等预防措施。