Name: 单分子力谱中蛋白质共价固定化的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学习利用异双功能硅烷偶联剂在二氧化硅表面共价固定化蛋白质的方法，用于原子力显微镜单分子力谱研究。该技术以肺炎链球菌RrgA与纤连蛋白的相互作用为例，为生物物理学和分子生物学中的蛋白质相互作用研究提供了可靠方案。

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TB 和 HG 承认欧洲研究委员会 &#34;Cellufuel，高级资助编号 294438&#34; 提供的经费支持。HCS 承认德国联邦教育与研究部通过技术创新联盟“功能技术蛋白”（TeFuProt）提供的经费支持，SS 承认巴伐利亚州科学与教育部门通过研究重点项目 &#34;三维组织的制备与生物物理表征——CANTER&#34; 提供的经费支持。我们感谢 Conny Hasselberg-Christoph 和 Martina Hörig 提供的技术支持

1. 蛋白质的固定化 通过 功能性硅烷偶联剂
注：图1 概述了本实验方案中所应用的表面化学。
警告：在以下实验方案中，将使用多种具有腐蚀性和皮肤刺激性的化学试剂。配制溶液时，应在通风橱内操作，并佩戴合适的（耐酸）手套、护目镜和实验服，以避免吸入蒸气。
<ol>
	<li>玻璃表面和氮化硅悬臂梁的硅烷偶联剂功能化
	<ol>
		<li>使用异丙醇和无绒精密擦拭纸清除载玻片上的粗大灰尘和污染物，并根据需要将载玻片裁剪至适当尺寸（可选）。 
		注意：除了玻璃之外，固体表面还可以是二氧化硅、石英，以及铝、铜、锡、钛、铁、铬、锆、镍和锌的氧化物。 
		警告：切割载玻片可能产生锋利边缘。</li>
		<li>将玻璃载玻片放入盛有盐酸（33% HCl）与双蒸水（ddH₂O）混合液的染色缸中2将体积分数调整至3%-5%，盖上合适的盖子，于室温下放入超声波清洗仪中处理90分钟。 
		注意：所使用的烧杯直径为6 cm，容积约为65–70 mL。适用于该烧杯的稀释盐酸体积为50 mL，其中包含5 mL 33% HCl和45 mL ddH₂O。2O. HCl 能有效去除非结合的金属离子，尤其是钠、钾和钙，并降低硅含量，从而产生羟基饱和的玻璃表面。 
		警告：盐酸具有腐蚀性并会刺激皮肤。配制溶液时，应佩戴足够的耐酸手套、安全护目镜和实验服，并在通风橱内操作，以避免吸入蒸气。</li>
		<li>将氮化硅原子力显微镜悬臂探针放置于洁净的玻璃载片上，使针尖朝上，并从上方用紫外线照射至少90分钟。 
		注意：对于单分子力谱实验，应选用标称弹簧常数为 0.01 至 0.1 N m 的悬臂梁。-1 适用于此目的。用紫外光照射悬臂梁表面可去除有机污染物（主要是脂肪类物质），并使其一侧具有亲水性。如果另一侧污染严重——通常不应如此，或使用的是刚从供应商包装中取出的悬臂探针——则可能影响单分子力谱（SMFS）测量结果。可采用piranha溶液对整个悬臂芯片进行彻底清洗，该方法已在多项研究中使用34，可能会有帮助。 
		警告：紫外线对眼睛有害，因此悬臂探针的照射必须在防紫外线透过的密闭腔室中进行。Piranha溶液具有高度反应性，可能灼伤皮肤、纸张及其他有机物。请勿使用塑料容器。即使器皿或广口瓶内仅有少量有机物表面污染，例如，由先前使用所致），可能会迅速发生反应。</li>
		<li>将染色缸中的盐酸替换为ddH₂O2O，同时防止玻璃表面变干，将烧杯重新放入超声波清洗机中继续处理10分钟。更换清水两次，每次10分钟，以充分洗去盐酸。</li>
		<li>同时，将乙氧基（或甲氧基）硅烷聚乙二醇酸（Si(OC2H5)3-PEG-COOH）溶于乙醇与ddH₂O的混合液中2O（体积比95%/5%，用乙酸调节pH至4.6）至终浓度为0.1 mg/mL-1将溶液密封保存，以避免乙醇挥发。 
		注意：硅烷偶联剂对水分和温度敏感。因此，应将其在惰性气体（N₂）保护下，于 4 °C 密封保存。2），在低温（-20 °C）及干燥条件下保存。在打开瓶盖前，务必确保硅烷试剂已恢复至室温，以最大限度减少水分吸收，从而避免活性基团的水合与失活。异双功能聚乙二醇（PEG）交联剂可提供多种不同的功能基团及不同长度的间隔臂。用于蛋白质的随机固定化 通过 其游离的氨基（NH2），如本方案所述，除乙氧基/甲氧基硅烷外，必须含有NHS酯官能团。除直接购买带有NHS酯的硅烷试剂外，一种简便的获得NHS酯的方法是使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和NHS活化羧基（-COOH）（见1.2.1和1.2.2）。 
		警告：乙醇易燃且对皮肤有刺激性。乙酸易燃且具有腐蚀性。避免反应性硅烷接触皮肤或进入眼睛。操作时应佩戴适当的防护手套、安全护目镜和实验服，并在通风橱内进行实验，以避免吸入蒸气。</li>
		<li>将硅烷溶液倒入两个独立的培养皿中，分别将制备好的悬臂探针和玻璃片放入其中一个培养皿中，密封（例如， 用封口膜密封以防止乙醇蒸发，并在室温下静置孵育90分钟。 
		注意：培养皿的最佳尺寸取决于悬臂探针的数量以及需要功能化的玻璃载片的尺寸。为便于操作并减少试剂用量，直径宜选择50–60 mm。为避免悬臂在穿过气-水界面时发生非预期弯曲，应使悬臂与气-水界面保持90°角。玻璃载片（但不包括悬臂探针）的孵育可选择在旋转摇床中进行。</li>
		<li>用三个盛有纯乙醇的烧杯依次冲洗悬臂和玻璃载片，以彻底洗去未结合的硅烷化合物。 
		注意：为避免悬臂在穿透空气-水界面时发生不期望的弯曲，应将悬臂保持在90°角。</li>
		<li>将功能化玻璃载玻片放入染色缸中，将悬臂置于干净的玻璃载玻片上，在110 °C下固化30分钟。 
		注意：加热固化会诱导共价硅氧烷键的形成并去除水分。由于玻片仅在一侧进行了功能化处理，务必正确标记已涂覆的一侧。</li>
		<li>将硅烷化处理的玻璃样品和悬臂探针储存于真空干燥器中，最多可保存一周。 
		注意：此处可暂停本实验方案。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>随机固定蛋白质于硅烷化玻璃和氮化硅悬臂梁上 
	注意：为避免悬臂梁发生不期望的弯曲，在穿过任何气-水界面时，应将悬臂梁探针保持在90°角。
	<ol>
		<li>配制含有42 mg/mL的溶液-1 EDC 的 20 mg/mL-1 NHS 在标准磷酸盐缓冲生理盐水（PBS；137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，1.8 mM KH2PO4，pH 7.4）。 
		警告：EDC 具有腐蚀性，可刺激皮肤，并可能导致严重眼损伤。请佩戴适当的手套、安全护目镜和实验服。</li>
		<li>将溶液覆盖于硅烷涂层玻片上，并将硅烷化悬臂探针放入 EDC/NHS 溶液液滴中，室温孵育 10 分钟。 
		注意：孵育悬臂探针时，可使用原始的悬臂盒。用于偶联蛋白质 通过 使用广泛采用的 EDC/NHS 化学方法，将异双功能硅烷-PEG 试剂的羧基（-COOH）活化，EDC 将 NHS 与羧酸偶联，形成“稳定”的 NHS 活化酯，从而在下一步中能够在生理 pH 条件下高效地与游离氨基发生偶联反应。</li>
		<li>用 PBS 在三个连续的烧杯中彻底冲洗悬臂和玻片，以完全去除多余的 EDC/NHS。 
		注意：此洗涤步骤至关重要，因为残留的 EDC/NHS 可能交联蛋白质，从而改变其功能。</li>
		<li>在湿盒中，于室温下将活化的玻片和悬臂探针与所需蛋白溶液的液滴共同孵育。蛋白浓度和孵育时间应根据实验要求进行调整。通常，蛋白浓度建议在 0.5 至 1 mg/mL 之间。-1 孵育时间在30分钟至2小时之间适用于大多数蛋白质。对于玻璃载片上的纤连蛋白以及悬臂上的菌毛-1尖端蛋白RrgA，分别使用1.5 µM和3 µM的摩尔浓度，并孵育2小时即可满足要求。</li>
		<li>用 PBS 在三个连续的烧杯中彻底清洗载玻片和悬臂探针，以去除未结合的蛋白质。</li>
		<li>将探针置于三(羟甲基)氨基甲烷缓冲盐水（TBS；50 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.6）中，室温孵育20分钟，以三(羟甲基)氨基甲烷封闭剩余的NHS酯。 
		注意：此步骤可减少蛋白质在原子力显微镜（AFM）探针功能化表面与玻璃之间的非特异性共价偶联，因为Tris的氨基可与悬臂及基底表面残留的活化COOH基团结合。</li>
		<li>用 PBS 彻底清洗载玻片和悬臂探针，并将其分别存放于盛有 PBS 的培养皿中，直至使用。 
		注意：样品应新鲜制备，并于同一天内使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 基于原子力显微镜的单分子力谱技术
注意：本研究中使用了JPK Instruments公司的原子力显微镜，并通过Force RampDesigner软件设定获得力-距离曲线的实验参数。
<ol>
	<li>使用热噪声法对悬臂梁进行校准35 
	注意：对于悬臂梁校准，请遵循制造商手册中的步骤。大多数悬臂梁供应商提供的弹簧常数仅为估算值，通常基于悬臂梁的标称尺寸（长度、宽度、厚度）计算得出，因此可靠性较低。由于准确的弹簧常数至关重要，建议将下述悬臂梁校准步骤重复三次，并采用光杠杆灵敏度和弹簧常数的平均值。在实验过程中以伏特（V）记录悬臂梁偏转信号，并在实验后利用光杠杆灵敏度和弹簧常数的平均值将其转换为力（pN），可能更为方便。只要激光在悬臂梁上的照射位置未发生改变（可在光电二极管上重新调整反射激光的位置），弹簧常数和光杠杆灵敏度可在实验前和/或实验后测定。
	<ol>
		<li>将一块洁净的新载玻片固定在原子力显微镜样品台上，并用PBS缓冲液覆盖。 
		注意：校准应在硬质表面上进行（例如、玻璃）以及与实际实验相同的缓冲液中进行。</li>
		<li>将制备好的悬臂探针固定在悬臂夹持器上，放入原子力显微镜（AFM）探头中，并用一滴磷酸盐缓冲液（PBS）小心润湿悬臂。 
		注意：悬臂梁的润湿可降低其在PBS缓冲液中穿透校准玻璃载片时产生的表面张力，从而避免悬臂梁发生不期望的弯曲。</li>
		<li>缓慢移动悬臂，使其逐渐靠近校准表面，直至悬臂完全浸入PBS缓冲液中，但仍与校准表面保持一定距离。</li>
		<li>使用原子力显微镜（AFM）的顶部光学显微镜，或（如有）AFM下方的倒置显微镜，将AFM的激光束对准悬臂的背面。将激光光斑置于悬臂末端附近，靠近针尖所在位置。 
		注意：激光光斑应位于悬臂末端附近，但必须完全落在悬臂上。若无光学显微镜，可使用一张白纸（适用于可见光激光二极管）或激光检测卡（适用于红外激光二极管），将其置于原子力显微镜（AFM）探头下方，并移动激光光斑靠近悬臂芯片边缘（即悬臂所在位置），直至在纸张或检测卡上观察到光斑。随后将光斑沿悬臂边缘平行移动。当光斑从纸张或检测卡上消失时，即已落在悬臂臂上。对于线性悬臂，将光斑向杠杆臂末端移动，直至其再次出现在纸张/检测卡上，然后将其往回移动，直至光斑重新回到杠杆臂上（即从纸张/卡片上消失）。对于三角形悬臂，将光斑置于两臂之间的中点位置，并向悬臂末端移动，直至其从纸张/卡片上消失。通过将光斑沿垂直于悬臂长轴方向移动，检查光斑是否位于悬臂中央。</li>
		<li>调节原子力显微镜四象限探测器光电二极管的位置，使反射的激光束位于光电二极管的中心。 
		注意：按以下步骤操作：使用探测器光电二极管附近的千分尺螺丝，调节二极管在水平和垂直方向上的位置，直至四个象限的总信号达到最大。然后在垂直方向上移动二极管，使垂直偏转信号为零；再在水平方向上移动二极管，使横向偏转信号为零。氮化硅悬臂梁通常具有金涂层，因此形成具有两种不同热膨胀系数的双金属结构。这会导致热漂移（在垂直偏转信号中可见），尤其是在溶液中更为明显。为减少测量过程中的漂移，在开始校准前，让整个系统平衡数分钟。</li>
		<li>在AFM软件中打开校准管理器，使用热噪声法按如下步骤校准悬臂梁的灵敏度和弹簧常数。</li>
		<li>小心接近基底表面并记录力-距离曲线。</li>
		<li>通过将直线拟合到撤回力曲线中最陡的部分（此时探针与基底表面接触），确定光杠杆灵敏度，单位为 nm/V。该灵敏度可用于将悬臂梁弹簧常数转换为 pN/nm。 
		注意：回缩曲线的斜率即为压电陶瓷的移动距离 与光电二极管电压的变化（单位：nm/V）。</li>
		<li>在悬臂梁距离表面约100 µm或更远的位置记录多个悬臂梁的热噪声谱，以排除任何表面阻尼的影响。</li>
		<li>通过将原子力显微镜（AFM）软件提供的谐振子模型拟合到热噪声谱，确定悬臂梁的弹簧常数，单位为 pN/V。</li>
		<li>缓慢回撤悬臂，并将其从溶液中取出。</li>
		<li>将用于悬臂梁校准的玻璃表面替换为含有固定化蛋白质的样品表面。更换玻片时，确保悬臂梁和样品表面（以及蛋白质）保持湿润，避免干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单个蛋白质水平上的相互作用力实验
	<ol>
		<li>缓慢移动湿润的悬臂，使其逐渐接近样品表面，直至悬臂完全浸没于PBS缓冲液中，但仍与基底表面保持一定距离。 
		注意：为减少实验过程中的热漂移，请在开始力谱测量前让整个系统稳定数分钟。</li>
		<li>接近表面，在样品表面的不同位置记录多个力-距离曲线（≥ 500 条），接触力为 250 pN，接触时间为 1 s， retract 长度为 2 µm，retract 速度为 1 µm/s-1. 
		注意：进行常规力谱学调整时，请遵循制造商手册。变异参数：回缩速度可在 0.1 至 5 µm/s 范围内调整。-1 根据不断增加的力载荷来计算动力学数据。可通过改变相互作用时间来分析时间依赖性的键增强效应。也可不保持 retract 速度恒定，而是保持力恒定（力钳模式）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析 
	注意：数据分析使用数据处理软件进行。根据固定的蛋白质、接触时间或回缩速度、是否包含足迹以及其他可变参数的不同，力-距离曲线包含多种不同的信息。不同SMFS实验之间的数据分析与解释可能存在显著差异，因此无法在此详细描述。针对RrgA与Fn的相互作用，以下方案可作为SMFS数据初步分析的第一步。
	<ol>
		<li>通过选择打开测量的力曲线文件 力扫描开放批次 图标并按如下步骤处理力-距离曲线：</li>
		<li>将悬臂梁偏转（V）通过选择与之成正比的力（F）进行转换 通过调节灵敏度和弹簧常数重新校准V型偏转 图标。 
		注意：如果在实验前已完成悬臂梁校准，则校准值将保存在力扫描文件中，并在校准V偏转时自动使用。如果校准是在实验后进行的，软件将使用默认值，但可将其更改为实测值。</li>
		<li>通过选择图标，在远离表面的力曲线区域中减去回缩通道的基线，以设定零力水平 基线扣除. 
		注意：在某些情况下，回缩过程可能不具备相同的恒定力值，曲线可能呈现线性倾斜，可通过选择予以消除 偏移 + 倾斜.</li>
		<li>通过选择探针尖端与样品接触的点来确定接触位置 接触点测定 图标。</li>
		<li>通过选择将高度信号转换为针尖-样品间距 针尖-样品分离 此外，除了减去接触点位置外，该程序还通过减去悬臂梁弯曲来计算基底表面与原子力显微镜针尖之间的距离。 
		注意：在拟合聚合物弹性模型（如可延展的蠕虫状链模型）以及确定相互作用长度时，需要使用对悬臂梁弯曲进行校正后的针尖-样品间距。为了通过力曲线的斜率和z轴压电驱动器速度来确定力加载速率，应使用未经校正的力曲线。</li>
		<li>筛选断裂长度超过 70 nm（拉伸后的 PEG 间隔序列长度）时出现力峰的力-距离曲线36 以筛选非特异性相互作用，并通过选择对选定的峰应用可扩展的蠕虫状链模型 拟合聚合物链模型 图标并选择 可延展蠕虫状链模型对回缩力曲线中的峰值进行模型拟合，可获得断裂力和断裂长度，以及聚合物的弹性参数。</li>
		<li>以直方图形式展示数据，显示解结合力和长度的分布情况。直方图中应至少包含100个解结合事件。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

自从基于原子力显微镜的单分子力谱技术（AFM-based SMFS）问世以来，该技术已发展成为一种广泛应用的方法，可直接探测单个蛋白质、核酸及其他生物大分子的分子内和分子间作用力。3,4,5对于成功的单分子力谱实验，合适的表面偶联策略是先决条件。为了研究天然和合成聚合物中的分子内作用力，可将聚合物直接偶联到基底表面和原子力显微镜探针上36,38,39,40,41对于分子间相互作用（如分子键）的研究，建议使用柔性连接分子（如异双功能PEG连接剂或多肽链）将相互作用的分子分别连接至原子力显微镜（AFM）探针和基底表面，以确保结合伙伴的正确取向，克服短程表面力，并防止蛋白质发生变性和展开。21,22,23,24,25,26,27,42因此，我们描述了一种简单直接的蛋白质共价固定化方案 通过 使用异双功能PEG间隔臂修饰其可及的伯胺基团。
我们通过研究肺炎链球菌（S. pneumoniae）的黏附素RrgA与细胞外基质蛋白Fn之间的相互作用力，验证了该方法的适用性，相关实验细节最近已在其他文献中详细描述13。
表面化学性质已得到充分确立和分析，类似的方法已在多项单分子力谱实验中成功应用19,42,43,44,45用于将硅烷聚合物与表面偶联的硅醚易发生水解。水解程度取决于生成的硅氧烷键数量，而硅氧烷键的数量可在硅烷化过程中加以控制。若在SMFS测量中预期存在较高的相互作用力（≥ 1000 pN），则应进行硅烷化处理 通过 气相沉积30 从而形成连续的硅氧烷层。对于许多实验（例如，许多蛋白质-蛋白质相互作用的结合力在数百皮牛（pN）范围内，因此采用本方案已足够：通过水相沉积形成硅氧烷，并用乙醇仔细洗去未结合的有机硅烷（步骤1.1.7），随后加热固化（步骤1.1.8）。
另一个关键步骤是将表面残留的 EDC 和 NHS 分子充分洗涤去除（步骤 1.2.3），因为残留物会导致蛋白质上的羧基发生活化。这可能导致同一表面上的蛋白质发生交联，从而改变其功能，或使活化的蛋白质共价结合到相对表面上的其他蛋白质。这可能会导致蛋白质被夹在表面与原子力显微镜（AFM）探针之间，从而产生较高的断裂力，并可能伴随结构域的展开（参见图3b，迹线1、4和5，Fn结构域的展开）46。如果 PEG 间隔臂上的活性 NHS 酯未被充分淬灭，也会出现同样的问题。因此，建议使用 Tris 缓冲盐水进行孵育（步骤 1.2.6），因为 Tris 中的伯胺可淬灭残留的氨基反应性基团。
按照该方案逐步操作，可使纤连蛋白（Fn）在硅烷化玻璃表面形成均匀分布（见图2），并保持蛋白的二聚体形式。这种结构与Fn在溶液中的构象相似，并且与先前在其他样品表面上获得的原子力显微镜（AFM）数据一致37。此外，AFM探针尖端上的RrgA蛋白浓度适中，可在单分子力谱（SMFS）测量中产生约20%的清晰可辨的相互作用事件（图3和图4）。除了调节蛋白浓度和/或孵育时间外，另一种精确控制样品基底和悬臂探针尖端偶联分子数量的方法是使用具有不同二级官能团的硅烷试剂组合。通过调节从PEG聚合物延伸出的蛋白反应性基团的比例，可实现对固定化蛋白数量的调控15,16,17,18。
此处所述方案也可用于固定其他含有-NH₂基团的分子2 含有分子，或可进行调整，以将蛋白质偶联到玻璃和氮化硅之外的其他氧化硅表面。根据蛋白质的设计，胺反应性羧基可被替换为巯基反应性基团（例如，马来酰亚胺或邻位吡啶二硫化物）以偶联该蛋白质 通过 其游离的-SH基团。对于Fn，这会导致预定义的方向性13,17,20.
总之，该方案可根据不同需求进行调整，不仅适用于单分子力谱实验，还可用于其他生物物理应用。

除了光镊和磁镊之外，原子力显微镜（AFM）1,2 已成为分析和操控分子并研究其性质与功能（包括分子对外力响应）的有力工具3,4与酶联免疫吸附测定（ELISA）、表面等离子体共振（SPR）或石英晶体微天平（QCM）等方法相比，原子力显微镜（AFM）能够实现单分子水平的相互作用测量（SMFS）5 单细胞水平（SCFS）6这些技术为结合机制提供了有价值的见解，例如在相互作用中发现的捕获键 E. coli 甘露糖与菌毛蛋白 FimH7，或由纤连蛋白结合蛋白形成的串联β-拉链重复结构 S. aureus 与Fn结合后8我们最近能够证明，1型菌毛黏附素RrgA9,10 来自革兰氏阳性细菌 肺炎链球菌 (S. pneumoniae)11 能够与纤维连接蛋白结合12 其&#160;两个末端结构域。这揭示了一种新的双结构域结合机制，不同于串联β-拉链结构，可能使带菌毛的肺炎链球菌与含纤连蛋白的宿主表面形成并维持短暂接触13.
单分子力谱（SMFS）实验的成功在很大程度上取决于生物分子在固体表面和原子力显微镜（AFM）探针上的功能性和天然状态的固定。由于在SMFS测量过程中可能会产生较大的作用力，蛋白质最好以共价方式与表面连接。文献中已报道了大量用于将蛋白质及其他生物分子，乃至完整细胞，固定在（无机）固体表面、纳米颗粒和其他装置上的不同连接方法14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27。这些方案通常使用有害物质，操作困难，和/或需要特殊设备（e.g.，等离子清洗仪）。一种将分子连接到玻璃表面的简便方法是使用一侧具有硅烷反应基团、另一侧具有氨基反应基团的异双功能交联剂，形成较厚的聚合物层。根据具体应用，偶联剂可包含长度可变的柔性碳氢链，e.g.，聚乙二醇（PEG）。这类材料可抑制修饰表面的非特异性相互作用（e.g.，疏水作用、静电作用和范德华力），并可能为所连接的分子提供旋转自由度。
在此，我们介绍一种通用方案，用于将含有一个或多个游离氨基（-NH₂）的蛋白质通过共价偶联进行连接。2) 到玻璃表面和氮化硅原子力显微镜探针 通过 一种异双功能乙氧基硅烷-聚乙二醇-羧基（-COOH）。该方案可用于单分子力谱（SMFS）实验，本文以RrgA与细胞外基质蛋白Fn的相互作用为例进行说明（参见 图1 （以了解概览）。
第一步是表面的硅烷化28,29,30,31。该过程涉及偶联剂的乙氧基发生水解，从而形成高反应活性的SiOH基团。这些基团可与基底表面的SiOH基团发生反应。在初级缩合步骤中，这些硅醇通过氢键结合并在基底表面铺展。在次级缩合反应中（通常需要加热或真空以除去水），形成硅氧烷键。最终生成共价连接的有机硅烷层。
第二步是将蛋白质与从聚合物延伸出的功能性（-COOH）基团进行偶联32。首先，羧酸通过经典的NHS/EDC（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺）化学方法转化为具有反应活性的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯中间体33，该中间体进一步发生亲核取代反应，最终与蛋白质上的伯胺形成酰胺键。
通过这种方法，将RrgA偶联到氮化硅原子力显微镜探针尖端，将人纤维连接蛋白（Fn）固定在玻璃基底上，且二者均为随机取向，随后在单分子水平上分析了它们之间的相互作用力。实验结果表明，所描述的表面化学修饰方法可使Fn在玻璃表面均匀分布，并使探针尖端上的RrgA达到适当浓度，这在单分子力谱（SMFS）测量中表现为最高可达20%的相互作用事件比例。该化学修饰方法可显著降低非特异性背景相互作用，在数据采集过程中变化极小，因此非常适用于精确的单分子力谱实验。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>Carl Roth</td><td>6752</td><td></td></tr><tr><td>1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>03450</td><td>EDC</td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Carl Roth</td><td>3738</td><td>100 %；分析纯</td></tr><tr><td>双蒸水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Carl Roth</td><td>9065</td><td>&amp;ge; 99.8 %；分析纯</td></tr><tr><td>乙氧基硅烷聚乙二醇酸</td><td>Nanocs</td><td>PG2-CASL-5k</td><td>5 kDa；COOH-PEG-Si(OC&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H5)&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Carl Roth</td><td>X896</td><td>32 %</td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺</td><td>Merck</td><td>804518</td><td>NHS；用于合成</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 - 达尔伯克氏液</td><td>Biochrom</td><td>L1825</td><td>PBS</td></tr><tr><td>探针分子 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; 纤连蛋白，人血浆</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1056</td><td></td></tr><tr><td>探针分子 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; RrgA</td><td></td><td></td><td>实验室制备</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Carl Roth</td><td>9265</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷</td><td>Carl Roth</td><td>AE15</td><td>&amp;ge; 99.3 %；TRIS；缓冲级</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>烧杯</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃切割器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Carl Roth</td><td>0656</td><td></td></tr><tr><td>惰性气体干燥器</td><td>Sicco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒置显微镜 - Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 1</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard SPM 和 DP 软件</td><td>JPK Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室烘箱</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>IKA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型刮刀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微量离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Brand</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td>Knick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Starlab</td><td></td><td>10–100 &amp;micro;l, 50–200 &amp;micro;l, 100–1000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td></tr><tr><td>精密天平</td><td>Acculab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氮化硅悬臂梁 - MLCT</td><td>Bruker AXS S.A.S</td><td></td><td>弹性系数 &amp;le; 100 pN/nm</td></tr><tr><td>超声波清洗槽</td><td>Bandelin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>染色缸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜 - Zeiss Stemi</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>搅拌子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimtech 科学级擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV PenRay</td><td>UVP, LLC</td><td>90-0012-01</td><td>汞光谱，主峰能量位于 254&amp;nbsp;nm</td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>称量纸</td><td>Carl Roth</td><td>TP64</td><td></td></tr></tbody></table>

用于单分子力谱的蛋白质共价固定

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

近年来，基于原子力显微镜（AFM）的单分子力谱技术（SMFS）拓展了我们对分子性质与功能的理解，使我们能够探究多种生物物理机制。 例如，更详细地研究细菌粘附素如何与宿主表面受体结合。除其他因素外，单分子力谱（SMFS）实验的成功取决于目标生物分子在固体表面和原子力显微镜（AFM）探针上的功能性及天然状态的固定。本文中，我们描述了一种简便的方案，利用硅烷-聚乙二醇-羧基（silane-PEG-carboxyls）以及成熟的N-羟基琥珀酰亚胺/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC/NHS）化学方法，将蛋白质共价偶联至硅基表面，以研究革兰氏阳性菌菌毛-1粘附素RrgA的相互作用 肺炎链球菌 (S. pneumoniae) 与细胞外基质蛋白纤连蛋白（Fn）之间的相互作用。我们的结果表明，表面功能化可实现Fn在玻璃表面的均匀分布，并使原子力显微镜（AFM）探针尖端上的RrgA达到适当浓度，这在单分子力谱（SMFS）测量中表现为最高达20%的相互作用事件比例；同时发现RrgA与Fn的平均结合力为52 pN。该方案可调整用于偶联 通过 位点特异性的游离巯基。这能够实现蛋白质或分子的预定义取向，除单分子力谱（SMFS）外，也适用于其他生物物理应用。

本方案可实现蛋白质的共价固定 通过 其可及的伯胺基团呈随机取向（图1). 图2 显示了在氮气流下脱水后，固定有（左）和未固定（右）Fn 的硅烷化玻璃表面的原子力显微镜（AFM）图像。硅烷聚合物层仅显示出微小的表面起伏，高度约为 2–5 nm图2，右侧），而在Fn功能化的表面上，可明显观察到约10 nm高的Fn分子（图2，左侧）。在放大图中，可以观察到Fn的二聚体结构。Fn分子呈紧凑状，高度为4 - 5 nm（高于PEG表面涂层），长度约为120 nm（见插图）。
为了研究RrgA与Fn之间的相互作用力（该相互作用最近由我们课题组详细描述13），将RrgA偶联至氮化硅原子力显微镜（AFM）探针尖端，同时将人源Fn固定于玻璃基底（图3a）。图3展示了在1 µm s-1拉伸速度下记录的RrgA与Fn相互作用的代表性探针-样品分离曲线。所采用的表面化学修饰方法使背景相互作用较低，并获得了形态良好的单个（或双个）相互作用事件（图3a），这些事件通过可延伸的蠕虫状链（eWLC）模型进行拟合（红色曲线）。对拟合结果（断裂力和断裂长度，见图4）进行作图显示，在克服了AFM探针尖端与基底之间的非特异性表面相互作用并拉伸PEG连接臂（> 70 nm）之后，约有~19%的力-距离曲线显示出断裂事件，在探针-样品间距约为100 nm时，RrgA与Fn相互作用的平均断裂力约为52 pN。相比之下，若采用不合适的表面化学修饰方法（例如，未使用Tris缓冲盐溶液进行淬灭，见图3b），则会因非特异性相互作用、多个蛋白结合（曲线2和3）和/或样品表面与AFM悬臂探针尖端之间发生蛋白的共价偶联，导致无法清晰识别单个相互作用事件。这将产生较高的断裂力（曲线1），并可能伴随蛋白（Fn）结构域的展开（曲线4和5）。
<img alt="硅烷水解、缩合过程示意图，乙氧基硅烷 PEG 羧基，胺反应性酯。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：表面化学反应概述。 乙氧基硅烷-PEG-羧基发生水解后，在水合玻璃表面发生缩合反应，形成硅氧烷交联结构。EDC 与羧基反应生成具有高反应活性的 o-酰基异脲中间体，该中间体在水溶液中半衰期极短（易发生水解）。通过形成 NHS 酯可稳定该中间体，随后发生亲核取代反应，最终与蛋白质上的伯胺形成酰胺键。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="原子力显微镜（AFM）示意图，显示表面形貌分析及高度轮廓图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：纤连蛋白在玻璃基底上的固定 通过 异双功能乙氧基硅烷 PEG 羧基偶联剂 AFM图像显示经功能化的玻璃表面有（左）和无（右）Fn修饰的情况。数字标示出单个Fn分子，这些分子在基底表面均匀分布（插图）。分子呈现二聚体且紧凑的结构，高出PEG涂层4-5 nm，长度为 &gt;100 nm。这与溶液中Fn的结构相似，并且与之前在其他表面上获得的原子力显微镜（AFM）数据一致。 例如， 云母（插图比例尺 = 500 nm）37AFM图像下方是沿AFM图像中所示线条的高度轮廓。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="AFM力谱图，含PEG连接子、RrgA蛋白与纤连蛋白相互作用曲线" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：单分子力谱实验示意图及RrgA与Fn相互作用的典型力-距离曲线。 (a) RrgA 和 Fn 通过共价键连接 通过 将异双功能乙氧基硅烷PEG羧基偶联剂分别连接至氮化硅原子力显微镜悬臂探针尖端和玻璃表面。在回缩速率为 1 µm s-1 RrgA 和 Fn 固定化后的结果如图所示。红色曲线代表应用可伸展的蠕虫链模型拟合结果，用于获得断裂力和断裂长度。该图改编自 Becke。 等，ACSnano 201813(b) 在未使用Tris缓冲盐水淬灭的情况下，获得的RrgA与Fn相互作用的代表性单分子力谱力-距离曲线。在此情况下，由于Tris的伯胺基团缺失，实验中残留的活性NHS酯未被饱和，导致多蛋白结合（曲线2和3），以及蛋白质在表面与AFM针尖之间发生夹持，从而产生较高的断裂力，并伴随（Fn-）结构域的展开（曲线1、4和5；注意不同的标度）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="绘制分子分析中断裂力（pN）和断裂长度（nm）频率的直方图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58167/58167fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：单个RrgA-Fn相互作用的力与长度分布。 RrgA与Fn的SMFS相互作用测量在1400次实验中获得的断裂力及相应断裂长度的直方图，回缩速度为 1 µm s-1直方图显示了最可能的断裂力 fMP 51.6 pN（高斯拟合，黑色线条）以及断裂长度在约100 nm处的集中分布。该图已根据Becke的原始内容修改。 等，ACSnano，201813. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58167/58167fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

本方案描述了使用异双功能硅烷偶联剂将蛋白质共价固定在二氧化硅表面的方法，该表面专为基于原子力显微镜的单分子力谱技术而设计，并以肺炎链球菌（S. pneumoniae）菌毛-1尖端黏附素RrgA与纤连蛋白的相互作用为例进行了演示。

近年来，基于原子力显微镜（AFM）的单分子力谱技术（SMFS）拓展了我们对分子性质的理解以及……

该方法有助于回答生物物理学领域的一些关键问题，例如蛋白质相互作用中单个蛋白质的结合强度。该技术的主要优势在于能够固定多种不同的生物分子。通常，初次接触该方法的研究人员可能会遇到困难，因为原子力显微镜悬臂探针的操作以及原子力显微镜本身的使用具有一定挑战性。首先，戴上耐酸手套、安全护目镜和实验服。在通风橱内，使用无尘精密擦拭布蘸取异丙醇，清除多张载玻片上的粗大灰尘和污染物。将洁净的载玻片转移至一个装有经双蒸水稀释的盐酸的直立玻璃罐中。用合适的盖子密封该罐，并将其置于超声波清洗仪中，在室温下处理90分钟。随后，将氮化硅原子力显微镜（AFM）探针转移至一块洁净的玻璃载片上，使探针尖端朝上。将载玻片转移至避光的紫外光不透射室中，从上方用紫外光照射至少90分钟。此后，将染色缸中的盐酸更换为双蒸水，注意勿使玻璃表面干燥。用盖子密封染色缸，并将其重新放入超声波水浴中处理10分钟。同时，将乙氧基硅烷聚乙二醇酸溶解于乙醇和双蒸水的混合液中，最终浓度为0.1毫克/毫升。密封该溶液以防止乙醇挥发。准备就绪后，将硅烷溶液分别倒入两个独立的培养皿中。将洁净的玻璃载玻片放入一个培养皿中，将悬臂放入另一个培养皿中。使用帕拉膜将两个培养皿完全密封，防止乙醇挥发。将培养皿在室温下静置孵育90分钟。此后，使用三个盛有纯乙醇的烧杯连续清洗悬臂梁和玻璃片。将清洗后的悬臂梁放置在干净的玻璃片上。将功能化的玻璃片转移至染色缸中。将样品在 110 摄氏度的烘箱中固化 30 分钟。然后，将硅烷化处理的玻璃样品和悬臂梁置于真空干燥器中，保存时间最长可达一周。当准备开始随机固定蛋白质时，按照文本方案中的说明，配制含有 EDC 和 NHS 的标准磷酸盐缓冲液溶液。用该溶液覆盖硅烷化处理的玻片。将硅烷化修饰的悬臂探针放入ECD/NHS溶液液滴中。室温下孵育10分钟。接下来，将悬臂和载玻片依次在三个烧杯中冲洗，以彻底洗去多余的 EDC/NHS。将活化的玻璃载玻片转移至配有湿润纸巾的培养皿中。在玻璃载玻片的 EDC/NHS 活化区域加入一滴所需蛋白溶液，用封口膜密封培养皿，并在室温下孵育探针。将所需的蛋白质溶液滴加一滴至装有湿润组织的悬臂梁盒中。然后，用 PBS 充分清洗悬臂梁探针。将探针放入盒中的液滴内，并盖上盒盖。将探针在室温下孵育。随后，在玻璃载玻片背面标记蛋白质液滴的区域。使用三个盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的烧杯，依次彻底清洗玻璃载玻片和悬臂探针。将清洗后的探针放入含有Tris缓冲盐水的容器中，在室温下放置20分钟。然后，用PBS彻底清洗载玻片和悬臂探针。将其分别置于盛有PBS的培养皿中保存，待使用时取出。将一块新清洁的玻璃载玻片固定在原子力显微镜（AFM）样品台上，并用 PBS 缓冲液覆盖。接着，将制备好的悬臂探针固定在悬臂夹持器上，并将其放入 AFM 探头中。小心地用一滴 PBS 缓冲液润湿悬臂。缓慢移动悬臂，使其朝向校准表面靠近，直至悬臂完全浸入PBS缓冲液中，但仍远离校准表面。使用AFM的俯视光学显微镜或倒置显微镜，将激光对准悬臂背面。将激光光斑置于靠近悬臂末端（即探针所在位置）附近，并调节AFM四象限检测器光电二极管上的位置，使反射的激光束位于光电二极管的中心。接下来，在原子力显微镜（AFM）软件中打开校准管理器。为开始校准悬臂梁的灵敏度和弹簧常数，需谨慎接近基底表面，并记录一条力-距离曲线。在针尖与基底表面接触的撤回力曲线最陡部分拟合一条直线，以确定光杠杆灵敏度。将悬臂从样品表面缩回，并记录悬臂距离表面至少100微米时的多个热噪声谱，然后使用原子力显微镜（AFM）软件提供的谐振子模型对热噪声谱进行拟合，以确定悬臂的弹簧常数。随后，缓慢缩回悬臂并将其从溶液中取出。移除用于悬臂校准的玻璃表面，替换为含有固定化蛋白质的样品表面。缓慢移动湿润的悬臂，使其接近样品表面，直至悬臂完全被 PBS 缓冲液覆盖，但仍远离基底表面。接近表面后，在样品表面的不同位置记录多条力-距离曲线，接触力为 250 皮牛，接触时间为 1 秒， retract 长度为 2 微米， retract 速度为 1 微米每秒。在数据处理软件中，选择“打开力扫描批次”图标，以打开已测量的力曲线文件。选择“通过调整弹簧常数重新校准V偏转”图标，将悬臂偏转转换为与力成正比的信号。然后选择“基线扣除”图标，从远离表面的力曲线区域中扣除回撤通道的基线，同时设定零力水平。选择“接触点确定”图标，以定义针尖与样品接触的位置。选择“针尖-样品分离”图标，将高度信号转换为针尖-样品分离距离。此操作除了减去接触点位置外，还会扣除悬臂梁弯曲量，以计算基底表面与原子力显微镜针尖之间的距离。选择“拟合聚合物链模型”图标，并选择“可延展蠕虫状链”模型，以筛选断裂长度超过70纳米的力-距离曲线中的力峰。排除非特异性相互作用，并对选定的峰应用可扩展的蠕虫状链模型。本研究中，蛋白质通过其可及的伯胺基团以随机取向共价固定。硅烷化聚合物层的原子力显微镜图像仅显示高度在约2至5纳米之间的微小表面起伏。然而，经纤连蛋白功能化的表面显示出纤连蛋白分子高度约为10纳米。进一步观察发现，可识别出这些分子的二聚体结构。这些分子呈现紧凑形态，高出PEG表面涂层4至5纳米，长度约为120纳米。随后研究了RRGA与纤连蛋白之间的相互作用力。在探针移动速度为每秒一微米的条件下记录的典型探针-样品分离曲线显示出较低的背景相互作用以及形态良好的相互作用事件，这些事件随后采用可延伸的蠕虫状链模型进行拟合。对拟合结果作图显示，在克服PEG连接子拉伸过程中的非特异性表面相互作用后，最多有19%的力曲线出现断裂事件，RRGA与纤连蛋白相互作用的平均断裂力为52皮牛，探针与样品间距约为100纳米。在进行该实验操作时，需要牢记的是，单分子力谱数据包含多种信息，其结果会受到接触时间或回撤速度等参数设置的影响，因此本方案仅是完整数据分析的第一步。尽管该方法可提供有关单分子相互作用的信息，也可用于研究单细胞水平上的相互作用。在完成本实验步骤后，可进一步采用其他方法，如单细胞力谱技术，以回答更多问题，例如：完整细胞如何与蛋白包被的表面发生相互作用。请务必注意，使用酸和紫外光可能具有极高的危险性，在进行本实验操作时，应始终采取相应的预防措施，例如佩戴耐酸手套，并使用防紫外光透过的防护罩。

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