Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

这种方法可以帮助回答生物物理学领域的关键问题，例如单个蛋白质在蛋白质相互作用中的强度。该技术的主要优点是可用于固定各种不同的生物分子。一般来说，刚接触这种方法的人可能会很困难，因为原子力显微镜悬臂探针的作和原子力显微镜本身的作可能具有挑战性。

首先，戴上耐酸手套、护目镜和实验室外套。在通风橱下，在无绒精密湿巾中使用异丙醇。清除多个载玻片上的任何粗尘和污染物。

将干净的玻片转移到装满盐酸的静置瓶中，用双蒸水稀释。用合适的盖子密封罐子，并将其置于室温下的超声波浴中 90 分钟。然后，将氮化硅 AFM 悬臂探针转移到干净的载玻片上，尖端朝上。

将玻片转移到紫外线不透光的腔室中，并用来自上方的紫外线照射玻片至少 90 分钟。在此之后，用双蒸水更换染色罐中的盐酸，确保不要让玻璃表面干燥。用盖子密封罐子，然后将其放回超声波浴中再放置 10 分钟。

同时，将乙氧基硅烷聚乙二醇酸溶解在乙醇和双蒸水的混合物中，最终浓度为 0.1 毫克/毫升。密封该溶液，以防止乙醇蒸发。准备好后，将硅烷溶液倒入两个单独的培养皿中。

将干净的载玻片放入一个培养皿中，将悬臂放入另一个培养皿中。使用封口膜，密封两个板以防止乙醇蒸发。在室温下孵育固定板 90 分钟。

在此之后，使用三个连续的含有纯乙醇的烧杯清洗悬臂和载玻片。将清洗过的悬臂放在干净的载玻片上。将功能化的载玻片转移到染色罐中。

将两者在 110 摄氏度的烤箱中固化 30 分钟。然后，将硅烷化玻璃样品和悬臂在真空干燥器中储存长达一周。当准备开始随机固定蛋白质时，按照文本方案中的说明，在标准磷酸盐缓冲盐水中制备含有 EDC 和 NHS 的溶液。

用该溶液覆盖硅烷涂层的载玻片。将硅烷化悬臂探针放入一滴 ECD/NHS 溶液中。在室温下孵育两者 10 分钟。

接下来，在三个连续的烧杯中冲洗悬臂和载玻片，以完全洗掉多余的 EDC/NHS。将活化的载玻片转移到装有湿纸巾的培养皿中。将一滴所需的蛋白质溶液加入载玻片的 EDC/NHS 激活区域，并使用封口膜密封培养皿并在室温下孵育探针。

将一滴所需的蛋白质溶液添加到装有湿纸巾的悬臂箱中。然后，用 PBS 彻底清洗悬臂探针。将探针放入盒子中的液滴中，然后关闭盒子。

在室温下孵育探针。在此之后，在载玻片背面标记蛋白质液滴的区域。使用三个连续装满 PBS 的烧杯彻底清洗载玻片和悬臂探针。

将洗涤后的探针放入装有 Tris 缓冲盐水的容器中，在室温下放置 20 分钟。然后，用 PBS 彻底清洗载玻片和悬臂探针。将它们储存在覆盖有 PBS 的单独培养皿中，直到准备使用。

将新鲜清洁的载玻片固定在 AFM 样品架上，并用 PBS 缓冲液覆盖。接下来，将准备好的悬臂探针固定在悬臂支架上并将其放入 AFM 头中。用一滴 PBS 缓冲液小心地润湿悬臂。

将悬臂缓慢移向校准表面，直到悬臂完全浸入 PBS 缓冲液中，但仍远离校准表面。使用 AFM 的顶视光学显微镜或倒置显微镜将激光器定位在悬臂的背面。将激光点放在悬臂末端附近，靠近尖端所在的位置，并调整 AFM 四象限探测器光电二极管的位置，使反射激光束位于光电二极管的中心。

接下来，在 AFM 软件中打开校准管理器。要开始校准悬臂灵敏度和弹簧常数，请小心地接近基板表面并记录力距离曲线。将一条直线拟合到吸头与衬底表面接触的回缩力曲线的最陡峭部分，以确定光学杆的灵敏度。

从样品表面缩回悬臂，用悬臂距离表面至少 100 微米记录几个热噪声谱，并将 AFM 软件提供的谐振子安装到热噪声谱中，以确定悬臂的弹簧常数。在此之后，慢慢缩回悬臂并将其从溶液中抽出。去除用于悬臂校准的玻璃表面，并将其替换为含有固定蛋白质的样品表面。

将湿悬臂缓慢移向样品表面，直到悬臂完全被 PBS 缓冲液覆盖，但仍远离底物表面。以 250 皮顿的接触力、1 秒的接触时间、2 微米的缩回长度和每秒 1 微米的缩回速度接近表面并记录样品表面不同位置的多个力距离曲线。在数据处理软件中，选择 Open batch of Force Scan（打开力扫描的批次）图标以打开测得的力曲线文件。

选择 Recalibrate the V Diflection by Adjusting Sensitivity in Spring Constant（通过调整弹簧常数中的灵敏度来重新校准 V Diflection）图标，将悬臂挠度转换为正比力。然后，选择 Baseline Subtraction（基线减去）图标，在远离表面的力曲线区域中减去缩回通道的基线，这也设置了零力水平。选择 Contact Point Determination（接触点测定）图标以定义针尖与样品接触的点。

选择 Tip Sample Separation（尖端样品分离）图标，将高度信号转换为尖端样品分离。除了减去接触点位置外，这还减去悬臂弯曲以计算衬底表面和 AFM 针尖之间的距离。选择 Fit a Polymer Chain Model"图标，然后选择 Extensible Worm-like Chain"模型，以筛选在断裂长度超过 70 纳米处出现的力峰值的力距离轨迹。

分拣出非特异互作用，并将可扩展的蠕虫状链模型应用于选定的峰。在这项研究中，蛋白质通过其可接近的伯胺以随机方向共价固定。硅烷化聚合物层的 AFM 图像仅显示高度约为 2 到 5 纳米的小表面波纹。

然而，用纤连蛋白功能化的表面被认为具有约 10 纳米高的纤连蛋白分子。仔细观察表明，可以识别分子的二聚体结构。这些分子似乎很紧凑，高度高于 PEG 表面涂层 4 到 5 纳米，长度约为 120 纳米。

然后研究 RRGA 与纤连蛋白的相互作用力。以每秒 1 微米的极化速度记录的代表性尖端样品分离曲线显示出低背景相互作用和形状良好的相互作用事件，然后使用可伸展的蠕虫状链模型对其进行拟合。绘制该拟合的结果表明，在克服拉伸 PEG 接头时的非特异性表面相互作用后，高达 19% 的力曲线具有破裂事件，RRGA 纤连蛋白相互作用的平均断裂力为 52 皮顿，尖端采样距离约为 100 纳米。

在尝试此过程时，重要的是要记住，根据接触时间或回缩速度等设置，单分子力谱数据包含多种信息，并且该协议只能是完成数据分析的第一步。虽然这种方法可以提供对单分子相互作用的见解，但它也可以用于研究单细胞水平的相互作用。在此程序之后，可以执行其他方法，如单细胞力谱，以回答其他问题，例如，整个细胞如何与蛋白质包被的表面相互作用。

不要忘记，在酸和紫外线下工作可能非常危险，并且在执行此程序时应始终采取预防措施，例如耐酸手套和紫外线防渗室。