透明质酸基水凝胶对3维患者源性胶质瘤细胞培养的研究

这种方法可以帮助回答有关胶质母细胞瘤肿瘤以及细胞外基质如何促进治疗耐药性的关键问题。该技术实现了适应性强的 3D 细胞培养平台的模块化构建，可用于在更接近天然大脑的环境中培养患者来源的胶质母细胞瘤细胞。首先，将干净干燥的硅橡胶模具放入未经组织培养处理的 12 孔板的每个孔中，并使用移液器吸头干净的钝端将模具粘附到板的底部。

检查模具和孔底之间的密封后，通过离心从胶质母细胞瘤细胞培养物中收集解离的胶质瘤球，并将沉淀重悬于一毫升细胞解离酶中。在室温下 5 分钟后，轻轻敲击搅动试管，并用 4 mL 完全培养基阻止酶促反应。再次离心细胞，将沉淀重悬于 1 毫升新鲜完全培养基中，然后通过 70 微米过滤器过滤细胞。

用另外 4 毫升完全培养基清洗过滤器，并将悬浮液分成两个等分试样，每个离心管的 8 乘以 10 至第四个细胞。通过离心收集细胞，并将一个沉淀重悬于 80 微升新鲜制备的聚乙二醇马来酰亚胺或 PEG-Mal-RGD 中，将一个沉淀重悬于 80 微升新鲜制备的 PEG-Mal-CYS 溶液中。使用 200 微升宽孔微量移液器吸头，在每个橡胶硅胶模具中加入 40 微升透明质酸溶液，然后加入 40 微升 PEG-Mal-CYS 或 PEG-Mal-RGD 细胞溶液。

每个模具上下快速移液不超过 10 次以混合。由于凝胶反应时间短，一旦两种水凝胶组分混合，使用宽口移液器吸头快速而彻底地混合溶液非常重要。此步骤需要练习。

然后，将凝胶封装的细胞放入 37 摄氏度、含 5% CO2 的细胞培养箱中 5 至 10 分钟。在孵育结束时，向每个凝胶中加入 2 至 2 mL.5 mL培养基，并使用无菌的 2 μL 移液器吸头和镊子轻轻地将凝胶与模具侧面分离。然后，使用消毒的镊子从板孔中取出模具，并将板放回细胞培养箱中。

对于单细胞提取，在适当的实验终点，从孔中取出上清液，并将每个孔中的凝胶培养物转移到单独的 1.5 mL 微量离心管中。将凝胶与 500 μL 细胞解离酶在 37 °C 下孵育 5 分钟，偶尔轻弹，然后将混合物转移到单独的 50 mL离心管中，每管含有 5 mL完全培养基，溶于冰上。接下来，使用配备有 20 号针头的 10 毫升注射器通过针尖轻轻吸出每个细胞悬液 8 次，并通过 70 微米细胞过滤器将混合物过滤到新的 50 毫升离心管中。

将细胞从水凝胶中解离时，确保缓慢按下注射器柱塞，以避免脱落，从而损害细胞膜的完整性。用 5 毫升新鲜培养基洗涤过滤器，并通过离心收集细胞。然后，将沉淀重悬于适当的流式细胞术缓冲液中，以便根据标准方案进行染色和分选。

为了冷冻保存水凝胶以进行切片，请从板孔中取出上清液，并将凝胶培养物与 2 毫升 4% 多聚甲醛在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天早上，用 2 毫升 5% 蔗糖的 PBS 溶液替换固定剂，在室温下孵育 1 小时。孵育结束时，用 2 毫升 20% 蔗糖的 PBS 溶液替换 5% 蔗糖，在室温下孵育两次，每次 30 分钟。

第二次 30 分钟孵育后，再次刷新 20% 蔗糖，在 4 摄氏度下孵育过夜。第二天早上，在最佳切割温度下用 20% 蔗糖或 OCT 培养基轻轻替换 PBS 溶液中的蔗糖，注意完全覆盖每块凝胶，并将板在 4 摄氏度下再放置 3 小时。在孵育结束时，使用大平刮刀小心地将每块凝胶转移到包埋模具的中心，并用纯 OCT 填充包埋模具，使其刚好低于模具的顶部边缘。

然后，将水凝胶样品冷冻在冷却的 2-甲基丁烷中，并根据标准方案在低温恒温器上将水凝胶样品切片。将 80 微升水凝胶放置到每个凝胶密度的 4 倍 10 到第四个细胞中，始终导致与胶质瘤球培养相当或更好的增殖速率。例如，包封后 4 天，含有水凝胶的 RGD 中的胶质母细胞瘤细胞表现出侵袭性表型，而使用 PEG-Mal-CYS 在水凝胶中培养的细胞表现出球形形态。

这些稳健的培养物可以评估可溶性环 RGD 等试剂的作用，这些试剂竞争性地破坏细胞与掺入水凝胶中的 RGD 的相互作用。使用生物发光成像，可以在水凝胶培养物中观察到活细胞的相对数量，例如，在 12 天的厄洛替尼治疗过程中。裂解的 poly ADP 聚合酶的 Western blot 分析表明，处理的 CD44 敲低细胞中的相对凋亡程度高于在 0.5% 透明质酸水凝胶中培养的野生型胶质母细胞瘤细胞中观察到的细胞凋亡程度。

此外，基于水凝胶的 3D 培养物的冷冻切片保留了培养细胞沉积的细胞外基质。例如，允许分析 erlotinib 治疗后 4 型胶原变化的沉积模式。尝试此程序时，评估每批透明质酸的硫醇化程度非常重要。

每次进行细胞包封实验时，制备新鲜的前体溶液也很重要。这项技术的发展为癌症研究人员评估新的和现有的治疗方法的疗效以及探索治疗耐药和脑癌进展的机制铺平了道路，所有这些都使用离体模型。