Name: 透明质酸基水凝胶对3维患者源性胶质瘤细胞培养的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学习使用透明质酸基水凝胶构建三维患者源性胶质母细胞瘤细胞培养系统。该方法模拟脑基质微环境，有助于研究肿瘤行为和治疗耐药机制，为神经肿瘤学研究提供可靠平台。

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本工作获得了美国国立卫生研究院（NIH，项目编号：R21NS093199）和加州大学洛杉矶分校（UCLA）ARC 3R's 奖项的资助。我们诚挚感谢Harley Kornblum博士实验室提供了HK301和HK157细胞系。同时感谢加州大学洛杉矶分校组织病理学核心实验室（TPCL）提供的冷冻切片服务，感谢加州大学洛杉矶分校加州纳米系统研究所（CNSI）先进光学显微镜/光谱学核心设施（ALMS）提供共聚焦显微镜的使用，感谢加州大学洛杉矶分校Crump分子成像研究所提供IVIS成像系统的使用，感谢加州大学洛杉矶分校分子仪器中心（MIC）提供磁共振波谱分析支持，以及感谢加州大学洛杉矶分校Jonsson综合癌症中心（JCCC）流式细胞术核心实验室提供流式细胞术相关仪器设备。

所有人体组织采集步骤均在经机构批准的方案下进行。
1. 透明质酸的硫醇化
注意：摩尔比是相对于羧酸根基团的总数而言，除非另有说明。
<ol>
	<li>在已高压灭菌的 250 mL 锥形瓶中，将 500 mg 透明质酸钠（HA，500–750 kDa）以 10 mg/mL 的浓度溶于去离子蒸馏水（DiH2O）中。室温下搅拌溶液（约 200 rpm）2 小时，使 HA 完全溶解。在巯基化过程中，使用搅拌子和磁力搅拌器持续搅拌反应液。</li>
	<li>用 0.1 M 盐酸（HCl）将 HA 溶液的 pH 调至 5.5。称取 69.6 mg（0.25× 摩尔比）1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）。 
	注：尽管未溶解的 EDC 可直接加入 HA 溶液中，但通常更便于先将其溶于 1 mL DiH2O 中，然后迅速将 EDC 溶液加入 HA 溶液。在步骤 1.3 和 1.4 中加入反应前，N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）和盐酸胱胺也可预先溶于 1 mL DiH2O 中。</li>
	<li>向反应体系中加入 17.9 mg（0.125× 摩尔比）NHS。用 0.1 M HCl 将反应液 pH 调至 5.5，并在室温下孵育 45 分钟。</li>
	<li>向反应液中加入 70.0 mg（0.25× 摩尔比）盐酸胱胺。用 0.1 M 氢氧化钠（NaOH）将 pH 调至 6.25。室温下持续搅拌，过夜孵育反应液。</li>
	<li>次日，用 1 M NaOH 将反应液 pH 调至约 8。向反应体系中加入 192 mg（4× 摩尔比）二硫苏糖醇（DTT）。加入 DTT 后再次将 pH 调至 8，并在室温下继续搅拌 1–2 小时。</li>
	<li>用 1 M HCl 将 pH 调至 4。将整个反应混合物转移至预先浸泡的透析膜（截留分子量约 13 kDa）中，并在 pH 4 的 DiH2O 中进行透析。 
	注：透析所用 DiH2O 的体积应至少为反应后 HA 溶液体积的 40 倍（例如，50 mL 样品使用 2 L、pH 4 的 DiH2O）。</li>
	<li>在室温下，每天更换两次透析液（DiH2O，pH 4），持续 3 天。</li>
	<li>将透析后的溶液通过 0.22 µm 的真空驱动膜滤器过滤。用液氮快速冷冻巯基化 HA 溶液。使用冷冻干燥机冻干样品，持续 2 天。干燥状态的巯基化 HA 可在 -20 °C 的真空密封干燥器中保存至少 6 个月。</li>
	<li>为测定巯基化程度，可采用 Ellman 法检测和/或质子核磁共振波谱法30,31。</li>
</ol>
2. 交联材料的制备
<ol>
	<li>将巯基化透明质酸（thiolated HA）以所需浓度（本示例中为13.3 mg/mL）溶解于HEPES缓冲盐水（含20 mM HEPES的Hank's平衡盐溶液（HBSS）缓冲液，调节pH至8–9范围内）中，置于棕色瓶内以尽量减少暴露于环境光。保持溶液持续搅拌。 
	注意：若pH高于8、溶液浓度过高，或在凝胶形成前搅拌时间过长，可能导致连接在透明质酸上的巯基之间形成二硫键。为避免此问题，建议使用低于15 mg/mL的巯基化透明质酸，并在制备水凝胶前2小时内完成溶解。</li>
	<li>将四臂聚乙二醇-马来酰亚胺（4-arm-PEG-maleimide，PEG-Mal，20 kDa）和四臂聚乙二醇-巯基（4-arm-PEG-thiol，PEG-thiol，20 kDa）溶解于磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）中，配制50 mg/mL的PEG-Mal和PEG-thiol储备液。 
	注意：PEG试剂完全溶解至少需要1小时。</li>
	<li>若需添加细胞外基质（ECM）来源的肽段，将含半胱氨酸的肽段溶解于PBS中，配制储备液。 
	注意：储备液浓度建议为2–4 mM。</li>
	<li>将硅橡胶模具浸泡于乙醇中至少20分钟以清洁，随后进行高压灭菌以实现消毒。</li>
</ol>
3. 水凝胶交联与细胞包封
注意：此处以封装四个独立的、体积为 80 µL、含 0.5% (w/v) 透明质酸（HA）且压缩模量为 1 kPa 的水凝胶为例进行说明3。有关制备具有不同特性的水凝胶的示例配方，请参见表 1：其中两种水凝胶含有整合素结合肽 RGD，另外两种水凝胶则含有半胱氨酸封端作为肽活性的阴性对照。患者来源的胶质母细胞瘤（GBM）细胞的接种浓度为 500,000 个细胞/mL。
<ol>
	<li>将PEG-Mal储备液（50 mg/mL，来自步骤2.2）用PBS稀释至12.5 mg/mL，方法是将40 µL储备液加入120 µL PBS中。将稀释后的溶液分装至两个1.5 mL微量离心管中，每管80 µL。</li>
	<li>向其中一管加入16 µL RGD储备液（2.8 mM，来自步骤2.3），向另一管加入16 µL半胱氨酸储备液（2.8 mM，来自步骤2.3）。涡旋混匀。将PEG-Mal-RGD或PEG-Mal-CYS溶液置于冰上，待步骤3.9使用。 
	注意：此处所述操作可获得含约140 µM肽的水凝胶。相当于每8个可反应的PEG支臂中约有1个被肽占据。可通过调整末端为半胱氨酸的肽与马来酰亚胺基团的摩尔比来改变此比例。通常，在仍保留足够数量马来酰亚胺基团用于水凝胶交联的前提下，肽的最大浓度可达280 µM。</li>
	<li>将PEG-硫醇储备液（50 mg/mL，来自步骤2.2）用PBS稀释至5 mg/mL，方法是将4 µL 50 mg/mL储备液与36 µL PBS混合。向该混合液中加入120 µL步骤2.1中溶解的硫醇化HA。 
	注意：高分子量HA（HMW HA）溶液黏度很高。因此，建议使用宽口移液枪头转移溶液。移液时应缓慢操作，避免溶液黏附在枪头内壁，以提高测量准确性。</li>
	<li>将洁净干燥的模具（步骤2.4制备）放入非组织培养处理的12孔板的每个孔中。使用洁净的移液枪头钝端轻压模具，确认模具与孔板底部之间密封良好。 
	注意：在包封前应再次检查密封情况，以防泄漏。</li>
	<li>传代培养的GBM细胞，解离为单细胞并按前述方法测定细胞浓度3。 
	注意：某些GBM细胞系无法完全解离为单细胞。在此情况下，可直接包封整个胶质瘤球体。但为提高实验可重复性，建议在精确计数后使用解离的单细胞。不同实验室的胶质瘤球体传代方法各异，其中许多方法均可与水凝胶包封兼容。
	<ol>
		<li>（推荐）将胶质瘤球体在500 × g下离心5分钟。弃上清，向细胞沉淀中加入1 mL细胞解离酶，孵育5分钟，并轻轻敲击管壁以混匀。</li>
		<li>向细胞中加入4 mL完全培养基（含50 ng/mL EGF、20 ng/mL FGF-2、25 µg/mL肝素、G21添加剂及1%青霉素/链霉素的DMEM/F12培养基）。</li>
		<li>再次在500 × g下离心5分钟，弃上清。最后将细胞沉淀重悬于1 mL完全培养基中，并通过70 µm细胞筛过滤。（推荐）用额外4 mL完全培养基冲洗滤网，以最大限度回收细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用血细胞计数板估算细胞悬液的浓度。将细胞悬液分装至&#160;2个离心管中，每管约含80,000个细胞。在500 × g下离心5分钟；通常，80,000个细胞可用于制备2个80 µL的水凝胶。</li>
	<li>弃上清，将一份细胞沉淀重悬于80 µL PEG-MAL-RGD溶液中，另一份重悬于80 µL PEG-MAL-CYS溶液中（步骤3.1制备）。</li>
	<li>使用200 µL宽口移液枪头，向每个橡胶硅胶模具（步骤3.4制备）中加入40 µL HA溶液（来自上述步骤3.3）。</li>
	<li>使用200 µL宽口移液枪头，将40 µL PEG-MAL-CYS或PEG-MAL-RGD细胞悬液与模具中的HA溶液混合。快速吹打不超过10次。对每个待制备的凝胶培养物重复此操作。 
	注意：此步骤需要练习，因为初始凝胶化反应迅速（30秒内）。吹打时应移动枪头至模具不同位置，确保混合均匀。始终保持枪头位于液面以下，避免产生气泡。吹打次数不宜过多，以防凝胶在移液枪头内形成。可通过不同比例混合PEG-MAL-CYS和PEG-MAL-RGD，以获得所需的RGD肽浓度。</li>
	<li>将含有包封细胞的孔板置于37 °C细胞培养箱中孵育5–10分钟，以确保反应完全。</li>
	<li>向每个含有凝胶的孔中加入2–2.5 mL培养基。使用无菌的2 µL移液枪头或微型刮铲，轻轻分离模具与凝胶。用预先灭菌的镊子将模具从孔板中取出。将孔板放回细胞培养箱（37 °C，5% CO2）进行培养和后续实验。 
	注意：应垂直向上提起模具，避免损伤凝胶培养物。通常，凝胶培养物中的培养基应每3–4天更换一次。更换培养基时注意不要吸走水凝胶。若存在此问题，建议使用塑料移液管。若计划通过生物发光成像追踪细胞数量，则需在包封前按前述方法3用编码组成型表达荧光素酶的慢病毒转导GBM细胞。进行生物发光成像前1小时，向培养基中加入1 mM D-荧光素。</li>
</ol>
4. 蛋白质印迹法用裂解液的制备
<ol>
	<li>将1.5 mL微量离心管置于冰上预冷（每份凝胶样品1个）。将离心机冷却至4 °C。</li>
	<li>从培养板孔中移除培养基。将凝胶转移至预冷的微量离心管中。</li>
	<li>加入含有1×蛋白酶/磷酸酶抑制剂的100 µL RIPA裂解缓冲液。</li>
	<li>使用带20 G针头的1 mL注射器，将整个混合物反复通过针头至少20次，以破碎凝胶。</li>
	<li>用台式微量离心机瞬时离心样品，然后将样品放回冰上。</li>
	<li>每5分钟涡旋震荡样品一次，每次短暂涡旋，共进行20分钟。</li>
	<li>在4 °C条件下，以14000 × g离心15分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的预冷微量离心管中，于-20 °C（短期）或-80 °C（长期）保存。按照先前所述标准操作进行凝胶电泳3。</li>
</ol>
5. 从水凝胶培养物中提取单细胞用于流式细胞术
<ol>
	<li>吸除培养基，将凝胶培养物（来自步骤 3.11）转移至 1.5 mL 微离心管中。</li>
	<li>将凝胶与500 µL细胞解离酶共同孵育（例如， 在37 °C下孵育5分钟（使用TrypLE Express），期间偶尔轻弹管壁以混匀。</li>
	<li>将混合物转移至含有5 mL完全培养基的50 mL离心管中，将试管置于冰上。</li>
	<li>将20G针头连接至10 mL注射器上。轻柔地将细胞悬液通过针头反复抽吸8次。</li>
	<li>将混合物通过70 µm细胞滤筛流入一个新的50 mL离心管中。再向滤筛中加入5 mL完全培养基，以收集残留的细胞。</li>
	<li>以 400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于用于流式细胞术的所需缓冲液中（采用标准操作流程）。3).</li>
</ol>
6. 用于切片的水凝胶低温保存
<ol>
	<li>从凝胶培养物中移除培养基（来自步骤 3.11）。</li>
	<li>将凝胶培养物与 2 mL 的 4% 多聚甲醛（PFA）在 4 °C 下孵育过夜。 
	注意：PFA 具有毒性，必须小心操作。</li>
	<li>次日，移除 PFA。向凝胶中加入 2 mL 含 5% 蔗糖的 PBS 溶液，在室温下孵育 1 小时。</li>
	<li>将 5% 蔗糖溶液替换为 2 mL 含 20% 蔗糖的 PBS 溶液，孵育 30 分钟。</li>
	<li>再次将蔗糖溶液替换为 2 mL 新鲜的含 20% 蔗糖的 PBS 溶液，继续孵育 30 分钟。</li>
	<li>第三次将蔗糖溶液替换为 2 mL 新鲜的含 20% 蔗糖的 PBS 溶液，在 4 °C 下孵育过夜。</li>
	<li>制备含 20% 蔗糖的包埋剂（Optimal Cutting Temperature, OCT）化合物。 
	注意：由于 OCT 黏度较高，蔗糖溶解可能需要较长时间（最长可达过夜）。建议在溶解过程中将混合物置于摇床上持续振荡以促进溶解。</li>
	<li>次日，移除 20% 蔗糖溶液，缓慢将含 20% 蔗糖的 OCT 溶液倾倒至凝胶表面，确保完全覆盖凝胶。在 4 °C 下孵育 3 小时。</li>
	<li>使用较大的扁平刮铲将凝胶小心转移至包埋模具中央，操作时需避免损伤凝胶。</li>
	<li>在冷冻切片机腔室内，用过量干冰冷却 2-甲基丁烷。</li>
	<li>用纯 OCT（不含蔗糖）填充包埋模具，液面略低于模具上缘即可。</li>
	<li>将水凝胶样品浸入冷却的 2-甲基丁烷中进行速冻，随后进行切片。</li>
	<li>使用冷冻切片机对样品进行切片，推荐切片厚度为 10–18 µm，切片温度约为 -26 °C。</li>
	<li>对标本化的凝胶培养物进行标准免疫染色操作，方法如前所述3。 
	注意：PFA 为已知刺激物及致癌物，请依据当地适用的标准与法规进行操作和废弃物处理。</li>
</ol>
7. 从水凝胶中的样品中提取总RNA
注意：本文描述了一种使用商业试剂盒（参见材料表）从水凝胶培养细胞中提取总RNA的实验方案。所有缓冲液和材料均来自所用试剂盒。
<ol>
	<li>移除培养基。使用带宽口吸头的P1000移液器将水凝胶培养物转移至1.5 mL微量离心管中。</li>
	<li>向水凝胶培养物中加入350 µL RLT缓冲液。</li>
	<li>将连接在1 mL注射器上的20 G针头用于剪切凝胶，将整个混合物至少推过针头20次。</li>
	<li>将全部混合物转移至置于2 mL收集管中的匀浆柱中。在13,000 × g下离心2分钟。</li>
	<li>将上清液转移至干净的1.5 mL微量离心管中。注意不要扰动底部的凝胶沉淀。</li>
	<li>将裂解样品与350 µL 100%乙醇混合。将全部样品转移至离心柱（来自试剂盒）并放入2 mL收集管中。在13,000 × g下离心1分钟。</li>
	<li>后续用于PCR的RNA纯化步骤，请遵循试剂盒制造商提供的通用操作流程。 
	注意：RNA提取完成后，可采用标准的PCR操作流程。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

使用该三维培养系统生成可重复数据需要：1）透明质酸（HA）批次间巯基化的一致性；2）熟练掌握水凝胶前体的有效混合以及水凝胶培养物的操作技巧，以避免损伤；3）针对所用的每种细胞系优化接种密度。
当希望在水凝胶中达到特定的透明质酸（HA）质量百分比时，HA的巯基化程度决定了交联密度。我们建议每次巯基化反应使用相同量的HA，以尽量减少批次间的差异。建议每次巯基化反应至少使用300 mg的HA，以便同一批次的巯基化HA可用于多次实验重复。四臂PEG上巯基与马来酰亚胺基团的摩尔比应始终为1.1:1，以确保最大的交联效率。因此，如果巯基化程度发生变化，则必须相应调整加入的PEG-Mal的量。当肽段在凝胶形成前与马来酰亚胺偶联时，在计算中必须从可用马来酰亚胺总数中减去估计的带有连接肽段的PEG臂数量。此外，我们建议将HA的巯基化程度控制在10–15%以下，以避免形成二硫键，从而防止材料无法溶解或凝胶过程不一致。
巯基与马来酰亚胺基团之间的迈克尔加成反应可确保凝胶化在不到一分钟内完成。尽管这种快速凝胶化可最大限度地减少悬浮在水凝胶前体中的细胞...

三维（3D）培养系统在模拟细胞与其天然组织中周围细胞外基质（ECM）之间的相互作用方面，优于二维（2D）培养系统1,2。组织工程领域的进展已催生出复杂的3D培养平台，可实现对以下两方面进行可控研究：1）基质微环境中化学和物理组分如何影响细胞行为；2）针对多种疾病（包括癌症）的新治疗策略的有效性2。尽管体外（in vitro）模型无法涵盖内分泌和免疫信号等全身性因素，因而不能完全替代体内（in vivo）模型，但其具有诸多优势，包括可重复性高、实验可控性强、成本低且速度快。本文中，我们描述了脑仿生水凝胶的应用，其中源自患者的脑肿瘤细胞的3D培养可再现肿瘤生理的多个方面，特别是获得治疗耐药性的动态过程3。与其他体外（in vitro）方法相比，这些培养模型能更真实地反映体内（in vivo）肿瘤模型和临床观察结果3。
胶质母细胞瘤（GBM）是起源于大脑的最常见且致死率最高的癌症，其中位生存期仅为1-2年4,5。近年来，许多研究聚焦于肿瘤基质微环境对GBM的影响6,7,8。已有报道指出，大脑独特的细胞外基质（ECM）可影响GBM细胞的迁移、增殖及治疗耐药性6,7,8,9,10,11,12。透明质酸（HA）是大脑中含量丰富的糖胺聚糖（GAG），可与其他GAG及蛋白聚糖相互作用，形成类似水凝胶的网状结构13。大量研究表明，GBM肿瘤中HA呈过表达状态，并进一步影响癌症的进展过程8,9,13,14,15,16,17。其他ECM组分也参与调控GBM肿瘤的生长与侵袭6,7,15,18。例如，纤维连接蛋白（fibronectin）和玻璃体结合蛋白（vitronectin）在GBM中通常呈过表达状态，它们通过与细胞表面整合素受体上的&#34;RGD&#34;序列结合，诱导整合素受体发生异源二聚化，进而启动复杂的信号级联反应，促进肿瘤存活19,20,21。除生化因素外，组织基质的物理特性也影响GBM的进展22,23。
持续获得对治疗的耐药性是导致胶质母细胞瘤致命性的主要驱动因素之一4在二维或胶质瘤球模型中显示出良好效果的药物，在后续的动物研究和临床病例中均告失败3，表明微环境因素的影响对胶质母细胞瘤（GBM）的肿瘤反应具有显著贡献1尽管动物模型能够为异种移植的患者细胞提供三维且符合生理条件的微环境，并产生具有临床相关性的结果24,25，脑微环境的复杂性 体内 这使得确定哪些特征（包括细胞-基质相互作用）对特定生物学结果起关键作用变得具有挑战性。通过使用生化和生物物理特性明确的简化培养平台，将有助于发现新的治疗靶点。
与先前报道的胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤微环境生物材料模型26,27不同，这些模型未能实现对细胞外基质（ECM）各个生化和物理特性的真正正交调控，本文报道的生物材料平台能够解耦多种独立特性对GBM细胞表型的贡献。本文介绍了一种基于透明质酸（HA）、可正交调控的水凝胶系统，用于患者来源的GBM细胞的三维培养。该水凝胶由两种聚合物组分构成：1）具有生物活性的透明质酸（HA）和2）生物学惰性的聚乙二醇（PEG）。PEG是一种广泛使用的生物相容性高、亲水性强的材料，具有低蛋白吸附性和极低免疫原性28。在此，HA链上约5%的葡萄糖醛酸基团被修饰上巯基，以通过迈克尔加成反应与市售的四臂马来酰亚胺封端PEG交联。在体内最常见的形式中，HA以高分子量（HMW）链存在。本研究中，对高分子量HA（500–750 kDa）进行低度修饰，有助于保留HA与其细胞受体（包括CD4429）之间的天然相互作用。通过在保持总巯基与马来酰亚胺摩尔比恒定的前提下，用PEG-巯基替代HA-巯基，可将HA浓度与水凝胶的力学性能解耦。此外，通过化学计量控制，可将半胱氨酸封端的肽段共价连接至每个四臂PEG上确定数量的马来酰亚胺封端臂。引入来源于ECM的黏附性肽段，可介导培养细胞表面整合素的相互作用，从而传导生化和化学信号1。在生理条件下，马来酰亚胺与巯基的加成反应非常迅速，可最大限度缩短细胞包封所需时间，并提高患者来源细胞的存活率。此外，水凝胶培养物可像常规组织样本一样处理，并兼容多种标准表征技术，包括蛋白质印迹（Western blotting）、流式细胞术和免疫荧光染色。以下实验方案详细描述了水凝胶制备、建立患者来源GBM细胞三维培养体系以及生化分析技术的操作步骤。

<table><tbody><tr><td>pH计</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>任何具有pH 2-10检测灵敏度的pH计</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>常规实验室设备</td></tr><tr><td>锥形瓶（125mL）</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB-501-125</td><td></td></tr><tr><td>透析管</td><td>Thermo Fisher</td><td>21-152-14</td><td></td></tr><tr><td>2L聚丙烯烧杯</td><td>Thermo Fisher</td><td>S01916</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸钠</td><td>Lifecore</td><td>HA700k-5</td><td>分子量范围500-750 kDa</td></tr><tr><td>1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI-22980</td><td></td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>130672-5G</td><td></td></tr><tr><td>盐酸（HCl）</td><td>Thermo Fisher</td><td>SA48-500</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Thermo Fisher</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>胱胺二盐酸盐</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC111770250</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP172-25</td><td></td></tr><tr><td>Ellman试剂（5-(3-羧基-4-硝基苯基)二硫代-2-硝基苯甲酸）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D218200-1G</td><td></td></tr><tr><td>重水（氧化氘）</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC166301000</td><td></td></tr><tr><td>0.22&amp;micro;m 真空驱动滤器</td><td>CellTreat</td><td>229706</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Thermo Fisher</td><td>P32080-100T</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Thermo Fisher</td><td>MT-21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>4臂-PEG-马来酰亚胺</td><td>JenKem Technology</td><td>A7029-1</td><td>分子量约为20 kDa</td></tr><tr><td>4臂-PEG-巯基</td><td>JenKem Technology</td><td>A7039-1</td><td>分子量约为20 kDa</td></tr><tr><td>L-半胱氨酸&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7880-100G</td><td></td></tr><tr><td>RGD细胞外基质模拟肽</td><td>Genscript Biotech</td><td>N/A</td><td>定制肽，序列为&quot;GCGYGRGDSPG&quot;，N端应乙酰化</td></tr><tr><td>硅胶模具</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GBL664201-25EA</td><td>使用剃刀切割成单个片状</td></tr><tr><td>完全培养基</td><td>Various</td><td>Various</td><td>DMEM/F12（Thermo Fisher）添加无血清补充剂（GeminiBio的G21）、表皮生长因子50 ng/mL（Peprotech）、成纤维细胞生长因子20 ng/mL（Pepro Tech）和肝素25&amp;micro;g/mL（Sigma Aldrich）；不同实验室培养基配方可能不同</td></tr><tr><td>患者来源的胶质母细胞瘤细胞</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>20G针头</td><td>BD医疗</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>1mL注射器</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>10mL注射器</td><td>BD医疗</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>RIPA裂解缓冲液</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI-89901</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶/磷酸酶抑制剂小片剂</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5892970001</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-814-5Q</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>70&amp;micro;m细胞筛</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Thermo Fisher</td><td>AC416785000</td><td>溶于PBS配制成4%（w/v），保持pH 7.4</td></tr><tr><td>D-蔗糖</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>最佳切割温度（O.C.T.）包埋剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC9373881</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养孵箱</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>任何具备5% CO₂和37°C条件的通用孵箱</td></tr><tr><td>冰箱/冷冻柜</td><td>Thermo Fisher</td><td>N/A</td><td>任何具备-20°C和-80°C制冷能力的通用实验室设备</td></tr><tr><td>一次性包埋模具</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-20</td><td></td></tr><tr><td>冷冻干燥机</td><td>Labconco</td><td>N/A</td><td>任何可达到-105°C的冻干机</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>棕色小瓶</td><td>Kimble Chase</td><td>60912D-2</td><td></td></tr><tr><td>宽口移液器吸头</td><td>Thermo Fisher</td><td>9405120</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷</td><td>Thermo Fisher</td><td>03551-4</td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

基于透明质酸的水凝胶用于患者来源的胶质母细胞瘤细胞三维培养

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见且致死性最高的中枢神经系统肿瘤。近年来，许多研究聚焦于脑部独特微环境中细胞外基质（ECM）组分（如透明质酸，HA）如何促进GBM的进展与侵袭。然而，大多数体外（in vitro）培养模型并未将GBM细胞置于ECM环境中进行研究。小鼠异种移植模型也被广泛使用，但体内（in vivo）模型难以分离肿瘤微环境复杂组分中各个特征对肿瘤行为的独立影响。本文介绍一种基于透明质酸（HA）水凝胶的三维（3D）培养平台，使研究人员能够独立调控HA的浓度与刚度。该水凝胶由高分子量HA和聚乙二醇（PEG）组成，并在活细胞存在下通过迈克尔加成反应交联形成。来源于患者的GBM细胞在该3D水凝胶培养系统中表现出与标准胶质瘤球培养相当甚至更优的存活率和增殖能力。该水凝胶系统还可掺入模拟ECM的多肽，以单独研究特定细胞-ECM相互作用的影响。水凝胶具有良好的光学透明性，便于对3D培养中的活细胞进行成像。最后，HA水凝胶培养体系与多种常规分子和细胞分析技术兼容，包括PCR、蛋白质印迹（Western blotting）以及冷冻切片后免疫荧光染色。

每批巯基化HA均应使用1H-NMR或Ellman法检测巯基化程度。采用本方案进行HA修饰可稳定获得约5%的巯基化率（定义为巯基与HA二糖单元的摩尔比）(图1)。
建立这一新型培养平台需要各实验室在开展大规模实验前进行严格的测试，以确保良好的细胞培养活性。我们采用80 µL水凝胶，接种密度为500,000 cells/mL（即每凝胶40,000个细胞），其细胞增殖率始终与胶质瘤球体培养相当，甚至更优(图2A-2C)。由于HA/PEG水凝胶具有良好的光学透明性，可通过相差显微镜或荧光显微镜直接观察活体三维培养中的细胞行为。图3A显示，在包封4天后，含有RGD的水凝胶中的胶质母细胞瘤（GBM）...

在此，我们介绍一种在正交可调生物材料中三维培养患者来源的胶质母细胞瘤细胞的实验方案，该生物材料旨在模拟脑基质。该方法提供了一种 体外，可维持多种特性的实验平台 体内 胶质母细胞瘤细胞在培养过程中通常会丢失。

胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统中最常见且最具致死性的癌症。近年来，许多研究聚焦于细胞外环境如何影响该肿瘤的进展……

该方法有助于解答有关胶质母细胞瘤及其细胞外基质如何促进治疗耐药性的关键问题。该技术可实现可调节的三维细胞培养平台的模块化构建，可用于在更接近大脑原生环境的条件下培养患者来源的胶质母细胞瘤细胞。首先，将洁净干燥的硅橡胶模具放入未经组织培养处理的12孔板的每个孔中，并使用移液器吸头的洁净钝端将模具贴附于孔板底部。检查模具与孔板底部之间的密封性后，通过离心收集胶质母细胞瘤细胞培养物中解离的胶质瘤球体，并将沉淀重悬于1毫升细胞解离酶中。室温孵育5分钟后，轻轻敲击离心管使细胞分散，并加入4毫升完全培养基终止酶反应。再次离心细胞，将沉淀重悬于1毫升新鲜完全培养基中，随后通过70微米滤膜过滤细胞。用额外的4毫升完全培养基冲洗滤器，并将悬液分装成两份，每份含有8×10⁴个细胞，分别加入离心管中。通过离心收集细胞，然后将其中一份细胞沉淀重悬于80微升新鲜配制的聚乙二醇马来酰亚胺（PEG-Mal-RGD）溶液中，另一份沉淀重悬于80微升新鲜配制的PEG-Mal-CYS溶液中，每份对应一个模具。使用200微升宽口移液枪头，向每个橡胶硅胶模具中加入40微升透明质酸溶液，随后加入40微升的PEG-Mal-CYS或PEG-Mal-RGD细胞悬液。每孔快速吹打混合不超过10次。由于凝胶化时间较快，一旦两种水凝胶组分混合，必须使用宽口移液枪头快速而充分地混匀溶液。此步骤需要练习。然后，将包埋有细胞的凝胶置于37摄氏度、5% CO2的细胞培养箱中孵育5至10分钟。孵育结束后，向每块凝胶中加入2至2.5毫升培养基，使用无菌的2微升枪头和镊子轻轻将凝胶从模具壁上分离。接着，用灭菌镊子将模具从孔板中取出，并将孔板放回细胞培养箱中继续培养。进行单细胞提取时，在适当的实验终点，吸除孔中的上清液，并将每个孔中的凝胶培养物转移至各自的1.5毫升微量离心管中。加入500微升细胞解离酶，在37摄氏度孵育5分钟，期间偶尔轻弹混匀，然后将混合物转移至预冷的、各含5毫升完全培养基的50毫升离心管中。接着，使用配备20号针头的10毫升注射器，将每种细胞悬液轻轻通过针头抽吸8次，并通过70微米细胞筛网过滤至新的50毫升离心管中。从水凝胶中解离细胞时，务必缓慢按压注射器推杆，以避免剪切力损伤细胞膜完整性。用五毫升新鲜培养基冲洗滤网，并通过离心收集细胞。随后，根据标准操作流程，将细胞沉淀重悬于适当的流式细胞术缓冲液中进行染色和分选。为了冷冻保存水凝胶以进行切片，从孔板中移除上清液，并在4°C条件下用2毫升4%多聚甲醛孵育凝胶培养物过夜。次日早晨，将固定液替换为2毫升含5%蔗糖的PBS溶液，在室温下孵育1小时。孵育结束后，将5%蔗糖溶液替换为2毫升含20%蔗糖的PBS溶液，在室温下进行两次、每次30分钟的孵育。第二次30分钟孵育后，更换20%蔗糖溶液，于4°C条件下过夜孵育。次日早晨，将PBS溶液中的蔗糖小心替换为20%蔗糖

hyaluronic-acid-based-hydrogels-for-3-dimensional-culture-patient

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

透明质酸基水凝胶对3维患者源性胶质瘤细胞培养的研究

本视频展示了一种建立胶质细胞三维培养的技术。将来源于大鼠脑的胶质细胞包埋在含有细胞外基质成分的光交联聚合物基质中。在培养基中孵育后，胶质细胞在支撑基质内增殖，形成三维培养体系。...

建立大鼠脑源性胶质细胞的三维培养

本视频展示了如何将来源于脑肿瘤的胶质瘤球分离为单个细胞，并将其包封在基于透明质酸的水凝胶中。该过程促进细胞间的相互作用，形成结构化的三维胶质母细胞瘤模型。...

一种基于透明质酸的水凝胶用于胶质母细胞瘤细胞的三维培养

利用三维人类生物凝胶培养系统，可将多形性胶质母细胞瘤的患者来源异种移植瘤微型化为活体微肿瘤。这种模拟体内环境的三维肿瘤检测方法适用于药物反应测试和分子谱型分析，包括激酶组学分析。...

利用三维人类生物凝胶培养系统和患者来源的胶质母细胞瘤细胞生成微肿瘤用于激酶组学分析和药物反应测试

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改进的原代胶质细胞三维水凝胶培养方法 体外 神经炎症建模

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水凝胶阵列可提高三维肿瘤模型中基质组分与治疗药物筛选的通量

在此，我们介绍一种可实现肿瘤类球体快速、稳定且低成本制备并进行水凝胶包封的实验方案。该方法无需特殊设备，具有广泛的适用性，尤其适用于研究类球体与基质间的相互作用以及构建 体外 组织生理学或病理学模型...

肿瘤类球体的制备及其在聚乙二醇水凝胶中的包封用于研究类球体-基质相互作用

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本文介绍了一种利用水凝胶作为脂肪源性干细胞（ADSC）三维（3D）细胞培养支架的实验方案，并引入光生物调节（PBM）以增强ADSCs在3D培养环境中的增殖能力。...

脂肪源性干细胞在光生物调节增强的水凝胶中的三维细胞培养

我们介绍一种利用新诊断和复发性肿瘤患者来源的磁性胶质瘤球体构建的三维胶质母细胞瘤迁移模型。该平台可实现对患者特异性迁移动态的可视化，并可用于评估治疗效果。在迁移完成后，该检测方法还可进行多重分析，以评估蛋白质的定位和表达模式。...

可重复的缺氧条件下磁性纳米颗粒介导类球体定位的三维胶质母细胞瘤迁移实验

学习使用透明质酸基水凝胶构建三维患者源性胶质母细胞瘤细胞培养系统。该方法模拟脑基质微环境，有助于研究肿瘤行为和治疗耐药机制，为神经肿瘤学研究提供可靠平台。

基于透明质酸的水凝胶用于患者来源的胶质母细胞瘤细胞三维培养

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