Name: 脊髓损伤后压力溃疡的小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 了解脊髓损伤后压力溃疡的小鼠模型建立方法，该模型通过磁铁诱导溃疡且不限制动物活动，适用于评估治疗策略和研究伤口愈合动态，为临床前研究提供可靠平台。

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本工作部分得到了新泽西州脊髓研究委员会（CSCR15IRG010）、美国国防部（SC160029）以及耶鲁大学外科系Ohse研究资助计划的支持。我们感谢罗格斯大学W.M. Keck神经科学协作中心的Sean O' Leary提供的技术协助。

所有动物操作和手术程序均依照罗格斯大学机构动物照护与使用委员会批准的方案进行。小鼠自由摄取标准饮食和水。
1. 外科和非外科器械的准备
<ol>
	<li>将手术和非手术器械在高压灭菌器中进行灭菌。&#160;</li>
	<li>用70%乙醇清洁手术操作台，并将加热垫预热至37 °C。</li>
	<li>将加热垫放置在手术台上，并覆盖无菌手术单。 
	注意：所有存活手术操作中均采用&#34;无接触&#34;技术以维持无菌状态。</li>
</ol>
2. 动物准备及T9-T10脊髓椎板切除术操作
<ol>
	<li>获取10周龄成年（Balb/c）雄性小鼠。使用吸入式麻醉仪，以5%异氟烷开始对每只动物进行麻醉，随后降低至2-3%以维持整个操作过程中的镇静状态。</li>
	<li>通过夹捏尾部或足掌诱发伤害性刺激，确认动物无反应，以判断麻醉完全。</li>
	<li>使用电动剃毛器剃除背部（从头至尾）的毛发，随后涂抹脱毛膏（3分钟）以清除残留毛发。最后用流动水或湿巾清洗背部，并将动物放回笼中。 
	注意：此步骤可避免皮肤损伤时造成额外刺激及化学污染</li>
	<li>次日，于角膜涂抹眼用软膏，以防止手术过程中眼睛干燥；随后使用聚维酮碘溶液和70%乙醇交替进行三次皮肤消毒。</li>
	<li>使用手术刀在背部中线T8-T12椎体水平处做一皮肤切口（约1.0-1.5 cm）。 
	注意：可通过从T13椎体向后计数来确定椎体位置，T13对应浮肋所在位置11,12。</li>
	<li>清除皮下脂肪组织以暴露椎旁肌，随后缓慢分离肌肉，暴露双侧棘突和椎板。 
	注意：此操作需格外小心，避免大量出血或损伤脊髓。</li>
	<li>使用显微镊子轻轻剥离椎板，实施椎板切除术以暴露脊髓（T9-T10椎体）。 
	注意：实施椎板切除术时应充分暴露脊髓，以便于建立损伤模型。在&#160;对照组中，仅进行椎板切除术。</li>
</ol>
3. 进行T9-T10完全性脊髓损伤手术
<ol>
	<li>使用镊子在 T8 节段固定脊柱，并向上提起以增强脊柱的弯曲度。</li>
	<li>使用精细剪刀在 T9 和 T10 椎骨之间横断脊髓，直至椎管底部，以确保完全横断。</li>
	<li>在手术显微镜下确认完全横断后，在椎板切除部位覆盖一块皮下脂肪，以在关闭手术部位前为脊髓提供额外保护。</li>
	<li>最后，关闭切口，使用连续缝合法缝合椎旁肌肉和浅筋膜，然后使用缝合夹关闭皮肤12。</li>
	<li>脊髓损伤（SCI）术后，观察次日的肠道活动；但需通过手动排空膀胱来管理尿潴留。 
	注意：可使用 Basso 小鼠评分（BMS）在术后第 2 天开始监测后肢功能恢复情况，之后每周一次，参见 补充图 111,12,13。</li>
</ol>
4. 完全性脊髓损伤后皮肤压力性溃疡的诱导
<ol>
	<li>脊髓损伤（SCI）手术后立即用聚维酮碘和70%酒精擦拭动物背部。</li>
	<li>对于SCI损伤部位下方的压疮（PU），使用25 G针头在磁铁施加区域周围的椭圆形区域内，于骶骨附近背部皮肤上等距（约0.5–1.0 cm）多点注射极小体积（10 µL）的0.125%布比卡因溶液。 
	注意： 对于SCI损伤部位上方的压疮，应注射于颈部背侧皮肤区域。</li>
	<li>轻轻提起小鼠背部的一处皮肤皱褶，并用两片磁盘（直径5×12 mm，每片重2.4 g，磁力3800 G）夹住皮肤皱褶（图1）。11,12</li>
	<li>磁铁放置后立即将动物放回单独的笼子，并置于加热垫上，直至完全恢复意识（图1）。</li>
	<li>磁铁作用12小时后，用异氟烷轻度麻醉动物并取下磁铁。拍摄伤口部位的照片，记录压疮的初始外观（第0天时间点）。用透明敷料膜（3M）覆盖伤口，防止干燥或污染。</li>
</ol>
5. 术后动物护理、安乐死及组织学样本采集
<ol>
	<li>手术后立即皮下注射 1 mL 0.9% 生理盐水，以补充水分。</li>
	<li>立即皮下注射布托啡诺缓释制剂（buprenorphine-SR，1 mg/kg），用于镇痛。</li>
	<li>每日皮下注射美洛昔康（meloxicam，1 mg/kg）和头孢唑林（cefazolin，50 mg/kg，持续 3–7 天），并每日两次进行手动膀胱排空。</li>
	<li>将动物单独饲养于笼中，并自由提供易于获取的食物和饮水。ad libitum。完全脊髓损伤的小鼠可利用前肢行走，能够无障碍地接近食物和饮水。</li>
	<li>脊髓损伤手术后 7 天拆除手术缝合钉。</li>
	<li>在脊髓损伤及皮肤创伤后的预定时间点，按照美国兽医协会（AVMA）《安乐死指南》14，通过吸入 CO2（3–5 分钟）对动物实施安乐死。</li>
	<li>采集受损皮肤样本，用 10% 福尔马林固定 24 小时，随后转移至 70% 乙醇中，4 °C 保存直至切片。</li>
	<li>组织处理时，将样本包埋于石蜡中，使用切片机制备薄切片（5 µm）。采用苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色以观察组织形态学（图 3）。对于免疫组织化学分析（图 4），使用适当的抗体对切片进行染色，包括 Ki67（增殖标记）、CD31（血管生成标记）和 α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），具体方法参见 Kumar 等人12。 
	注意： 可使用图像分析软件对图像特征进行定量分析12。</li>
</ol>

<ol><li>Rappl, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+changes+in+tissues+denervated+by+spinal+cord+injury+tissues+and+possible+effects+on+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Physiological changes in tissues denervated by spinal cord injury tissues and possible effects on wound healing.</a> International Wound Journal. 5 (3), 435-444 (2008).</li>
<li>Salcido, R., Popescu, A., Ahn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+in+pressure+ulcer+research%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Spinal+Cord+Medicine%22%5BJournal%5D)">Animal models in pressure ulcer research.</a> The Journal of Spinal Cord Medicine. 30 (2), 107-116 (2007).</li>
<li>Mak, A. F., Zhang, M., Tam, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanics+of+pressure+ulcer+in+body+tissues+interacting+with+external+forces+during+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Biomechanics of pressure ulcer in body tissues interacting with external forces during locomotion.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 12, 29-53 (2010).</li>
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<li>Marin, J., Nixon, J., Gorecki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+risk+factors+for+the+development+and+recurrence+of+pressure+ulcers+in+people+with+spinal+cord+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">A systematic review of risk factors for the development and recurrence of pressure ulcers in people with spinal cord injuries.</a> Spinal Cord. 51 (7), 522-527 (2013).</li>
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<li>Redelings, M. D., Lee, N. E., Sorvillo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure+ulcers%3A+more+lethal+than+we+thought%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Skin+%26+Wound%22%5BJournal%5D)">Pressure ulcers: more lethal than we thought?</a> Advances in Skin & Wound. 18 (7), 367-372 (2005).</li>
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<li>Li, C., DiPiro, N. D., Krause, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+latent+structural+equation+model+of+risk+behaviors+and+pressure+ulcer+outcomes+among+people+with+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Spinal+Cord%22%5BJournal%5D)">A latent structural equation model of risk behaviors and pressure ulcer outcomes among people with spinal cord injury.</a> Spinal Cord. 55 (6), 553-558 (2017).</li>
<li>Kumar, S., Yarmush, M. L., Berthiaume, F. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/320189228_IMPACT_OF_COMPLETE_SPINAL_CORD_INJURY_ON_NEOVASCULARIZATION_AND_TISSUE_GRANULATION_IN_MOUSE_MODEL_OF_SKIN_PRESSURE_ULCERS">Impact of complete spinal cord injury on neovascularization and tissue granulation in mouse model of skin pressure ulcers.</a> Journal of Neurotrauma. 34 (13), A72-A73 (2017).</li>
<li>Kumar, S., Yarmush, M. L., Dash, B. C., Hsia, H. C., Berthiaume, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+complete+spinal+cord+injury+on+healing+of+skin+ulcers+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Impact of complete spinal cord injury on healing of skin ulcers in mouse models.</a> Journal of Neurotrauma. 35 (6), 815-824 (2018).</li>
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<li>Stadler, I., Zhang, R. Y., Oskoui, P., Whittaker, M. S., Lanzafame, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+simple%2C+noninvasive%2C+clinically+relevant+model+of+pressure+ulcers+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Surgery%22%5BJournal%5D)">Development of a simple, noninvasive, clinically relevant model of pressure ulcers in the mouse.</a> Journal of Investigative Surgery. 17 (4), 221-227 (2004).</li>
<li>Peirce, S. M., Skalak, T. C., Rodeheaver, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+injury+in+chronic+pressure+ulcer+formation%3A+a+skin+model+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion injury in chronic pressure ulcer formation: a skin model in the rat.</a> Wound Repair and Regeneration. 8 (1), 68-76 (2000).</li>
<li>Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+approaches+to+create+murine+models+of+human+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Surgical approaches to create murine models of human wound healing.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 969618-969625 (2011).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中的实验方案描述了一种新型的压力性溃疡（PUs）实验模型，用于评估脊髓损伤（SCI）对伤口愈合的影响。通过在背部皮肤皱褶处使用两个直径为12 mm的圆盘磁铁持续作用12小时，诱导皮肤压力性溃疡，磁铁位置可置于SCI损伤部位的上方或下方。实验数据显示，SCI会延缓小鼠皮肤伤口的愈合。重要的是，这些观察结果特异性地出现在SCI神经支配水平以下的皮肤伤口中；而位于SCI水平以上的伤口，由于仍保留神经支配，其愈合模式与未发生SCI的小鼠相比基本不受影响。
本文所述的压疮（PU）造模方法基于先前在小鼠中使用过的一种已发表方法，该方法采用较弱的磁铁（1000高斯），以12小时施加磁力、随后12小时不施加磁力为一个周期，共进行三个周期15。最初，我们比较了使用一次、两次和三次12小时磁力施加周期的效果。重复施加磁力的一个缺点是每次都需要特别小心地将磁铁从皮肤皱褶处取下，并重新精确放置到相同位置。因此，单次施加操作更为简便，且已足以在小鼠背部皮肤皱褶处成功诱导出压疮。此外，该方法无需复杂设备，不影响动物的正常活动，且具有很高的可重复性。若研究中...

压力性溃疡（PUs）是创伤性脊髓损伤（SCI）的主要继发性并发症1。PUs 是指皮肤和/或皮下组织的局部损伤，通常发生在骨性隆突部位，这些部位在患者坐位或卧位时承受集中的身体重量1。皮肤、脂肪和肌肉长期受压，导致局部缺血、组织炎症、机械性损伤和坏死2,3。
压力性溃疡的发生受多种局部因素影响，包括压力和剪切力的大小、受压持续时间、皮肤湿度和温度、损伤持续时间以及整体皮肤卫生状况。此外，还有一些系统性因素也起着作用，例如整体身体状况、骨骼和肌肉组织的形态与强度4、患者年龄、血液学指标、性别，甚至包括婚姻状况、教育程度和收入等社会经济因素4,5。
压疮的预防和治疗在脊髓损伤（SCI）患者中仍然是重大挑战。约30-40%的SCI患者会发生压疮，且复发率高达60-85%，可能与瘢痕组织薄弱及保护性感觉缺失有关1。因此，压疮常导致SCI患者再次住院，并给医疗系统带来显著的经济负担（比单纯SCI患者高出80%）5,6,7,8,9,10。
据我们所知，由于缺乏合适的动物模型，目前尚无在受控实验条件下研究脊髓损伤（SCI）对压疮（PU）愈合过程影响的报道。本文描述了一种可重复且具有临床相关性的皮肤压疮小鼠模型。该模型可用于研究压疮发生及后续愈合的动态过程，也可用于测试在脊髓损伤背景下预防压疮或促进压疮愈合的潜在治疗策略。

<table><tbody><tr><td>磁铁</td><td>Master Magnetcs, Inc., Castle Rock, CO</td><td>CD14C</td><td>3800 G 磁力</td></tr><tr><td>小鼠标准饲料</td><td>PMI Nutrition International, Brentwood, MO</td><td></td><td>标准颗粒饲料</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>HENRY SCHEIN Animal Health&amp;nbsp;</td><td>SKU 029405</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH, Bethesda, MD</td><td></td><td>图像分析软件</td></tr><tr><td>BETADINE 外科洗手液</td><td>HENRY SCHEIN Animal Health&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼科软膏&amp;nbsp;</td><td>HENRY SCHEIN Animal Health&amp;nbsp;</td><td>SKU 008897</td><td></td></tr><tr><td>NAIR 脱毛乳液</td><td>Church &amp;amp; Dwight Co., Inc. Princeton, NJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ELOXIJECT（美洛昔康）注射液</td><td>HENRY SCHEIN Animal Health&amp;nbsp;</td><td>SKU 049755</td><td>5 mg/mL, 10 mL</td></tr><tr><td>头孢唑林钠</td><td>HENRY SCHEIN Animal Health&amp;nbsp;</td><td>SKU 054846</td><td>1 g, 10 mL 瓶装</td></tr><tr><td>缓释布托啡诺&amp;nbsp;</td><td>ZooPharm, Windsor, CO</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠注射液 USP</td><td>BRAUN, Irvine, CA</td><td>S8004-5384</td><td></td></tr><tr><td>10% 中性缓冲福尔马林&amp;nbsp;</td><td>VWR, Radnor, PA</td><td>16004-130</td><td></td></tr><tr><td>BALB/C 雄性小鼠</td><td>Charles River Lab., Wilmington, MA</td><td>28</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>Puritan, Guilford, ME</td><td>SKU#: 25-806</td><td></td></tr><tr><td>米歇尔缝合夹</td><td>Fine Science Tools (USA) Inc., Foster City, CA</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>外科缝合线，U.S.P.</td><td>Henry Schein Animal Health&amp;nbsp;</td><td>101-2636</td><td></td></tr></tbody></table>

脊髓损伤后压力性溃疡的小鼠模型

Mouse Model of Pressure Ulcers After Spinal Cord Injury

压力性溃疡（PUs）是创伤性脊髓损伤（SCI）常见的致残性并发症，常发生于骨骼突出部位周围的软组织。然而，在受控实验条件下使用动物模型时，SCI对皮肤伤口愈合的影响尚不明确。本研究介绍了一种简单、无创、可重复且具有临床相关性的完全SCI小鼠压力性溃疡模型。成年雄性小鼠（Balb/c，10周龄）经剃毛和脱毛处理后，在脱毛24小时后接受椎板切除术，随后进行完全性脊髓横断（T9-T10椎体）。手术后立即提起小鼠背部的一处皮肤皱褶，并用两个磁性圆盘夹紧固定12小时，从而形成缺血区域，该区域在随后数日内发展为压力性溃疡。磁片作用后第3天，损伤区域出现组织水肿和表皮消失。压力性溃疡自发形成并逐渐愈合。当伤口位于SCI水平以下时，SCI小鼠的愈合速度较对照非SCI小鼠更慢；相反，当伤口位于SCI水平以上时，SCI小鼠与对照非SCI小鼠之间的愈合情况无显著差异。该模型可能成为研究SCI后皮肤压力性溃疡发生与愈合动态过程的有用工具，也可用于评估有助于此类伤口愈合的治疗策略。

本方案在完全性脊髓损伤（SCI）条件下成功诱导了压疮（PU）。简而言之（如图1所示），所有接受或未接受完全性SCI的小鼠对磁铁的耐受性均良好，磁铁在12小时实验期间始终保持在初始位置（图1c, 1d, 1f, 1h）。所有小鼠均形成了两个圆形创面，中间由正常组织桥连接（图1e, 1g, 1i）。在无SCI的小鼠中（图1e），或SCI位于损伤部位下方（图1g）或上方（图1i）的小鼠中，初始的创面反应相似。
图2 显示了磁铁移除后第3天表皮消失，并在第7天重新出现，但在...

本文介绍了一种在脊髓损伤（SCI）小鼠模型中诱导具有临床相关性皮肤压力性溃疡（PUs）的简单方法。该模型可用于临床前研究，以筛选针对SCI患者压力性溃疡愈合的不同治疗方法。

压力性溃疡（PUs）是创伤性脊髓损伤（SCI）常见的致残性并发症，常发生于骨骼突出部位周围的软组织……

本研究的总体目标是探讨脊髓损伤对动物模型中压力性溃疡发生与愈合动态过程的影响。该技术的主要优势在于不损害动物的活动能力，且具有高度可重复性。该模型为研究伤口愈合的动态机制以及测试针对脊髓损伤患者的各种治疗策略提供了平台。开始操作前，通过夹捏尾部无反应来确认麻醉效果充分。使用电动剪刀剃除背部的毛发，随后涂抹脱毛膏，静置三分钟以清除残留的毛发。三分钟后，用湿磨砂去除脱毛膏，并以同样方式清洗背部。然后将动物放回笼中。次日，对动物进行麻醉，并在角膜上涂抹眼膏，以保护眼睛在手术过程中免于干燥。然后，用聚维酮碘溶液和70%乙醇分别对动物皮肤进行三次擦洗。切口前，使用带有25号针头的注射器在切口周围注射100微升0.125%布比卡因作为镇痛。从对应T13的浮肋向后计数，以确定T8至T12的位置。在背部T8至T12椎体水平沿正中线做一个1至1.5厘米的切口，清除皮下脂肪组织以暴露椎旁肌肉。然后缓慢分离这些肌肉，以显露双侧棘突和椎板。此操作必须极为谨慎，以避免大量出血以及对脊髓造成任何损伤。使用显微解剖镊轻轻剥离脊椎板，对 T9 至 T10 椎骨进行椎板切除术，以暴露脊髓。用镊子固定并提起 T8 处的脊柱，以增大脊柱的弯曲度。然后使用精细剪刀从 T9 与 T10 椎骨之间横切脊髓，直至椎管底部，以确保完全横断。在手术显微镜下观察到完全横断后，在关闭手术部位前，将一块皮下脂肪覆盖于椎板切除部位，以对脊髓提供额外保护。最后，关闭切口，缝合椎旁肌肉和浅筋膜，随后使用缝合夹关闭皮肤。脊髓损伤（SCI）手术后，立即用聚维酮碘和70%酒精擦拭动物背部。若需在脊髓损伤部位以下诱导压疮，可使用25号针头将10微升0.125%布比卡因溶液以椭圆形方式注射于靠近骶骨的背部皮肤，各注射点间距0.5至1厘米。轻轻提起小鼠背部的一处皮肤皱褶，并将其夹在两个磁性圆盘之间。施加磁铁后，立即将动物放回单独的笼子，并置于加热垫上，直至完全恢复意识。磁铁作用12小时后，用异氟烷对动物进行轻度麻醉，并移除磁铁。拍摄伤口部位的照片，以记录第零天时间点压力性溃疡的初始外观。用透明敷料膜覆盖伤口，以避免干燥或污染。手术后将动物单独饲养。术后立即为动物注射一毫升 0.9% 盐水以补充水分，并注射缓释布托啡诺用于镇痛。每日进行两次手动排空膀胱。脊髓损伤手术后七天拆除手术夹。在脊髓损伤及皮肤压力性溃疡诱导后的预定时间点，采集安乐死小鼠的受损皮肤样本。用10%福尔马林固定24小时。24小时后转移至70%乙醇中，并在4°C下保存直至切片。该图像显示了对照动物在去磁后第三天表皮消失的情况。箭头指示表皮伤口边缘，位于上皮衬里变薄处。在对照组动物中，表皮于第7天重新出现。对于在脊髓损伤（SCI）水平以下造成的伤口，在SCI小鼠中可见显著减慢的迁移速度。此处图示显示，与对照组小鼠相比，脊髓损伤（SCI）小鼠的伤口愈合和闭合速度较慢。对增

mouse-model-of-pressure-ulcers-after-spinal-cord-injury

Research

科研

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Bioengineering

生物工程

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