Name: 用 crispr/cas9 基因编辑生成重组禽流感病毒载体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 了解利用NHEJ-CRISPR/Cas9与Cre-Lox系统构建重组火鸡疱疹病毒载体疫苗的快速方法。该技术可实现多价禽类疫苗的高效开发，助力家禽疾病防控研究。

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作者感谢 Pippa Hawes 在共聚焦成像方面的协助。本项目获得了生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）基金 BBS/E/I/00007034 和 BB/L014262/1 的资助。

1. Cas9/gRNA 表达载体和供体质粒的制备
<ol>
	<li>构建Cas9/gRNA表达质粒
	<ol>
		<li>按照先前所述方法设计靶向HVT病毒UL45与UL46基因间区的gRNA序列22。将该向导RNA靶序列与HVT基因组进行比对，以排除HVT基因组中任何可能的脱靶序列。合成并克隆靶向UL45/46区域的gRNA序列，以及来自已发表数据的sg-A序列23，插入至pX459-V2载体中，方法如前所述22。使用U6-Fwd引物通过Sanger测序验证克隆后的gRNA序列24。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>供体质粒的构建
	<ol>
		<li>为构建含有VP2表达盒并携带可移除GFP报告基因表达盒的供体质粒，设计寡核苷酸Donor-F和Donor-R，其包含以下元件（图1A 和 图3A）：两端各有一个sg-A靶序列，用于GFP报告基因表达盒的克隆与切除的PacI位点两侧各有一个LoxP序列，以及两个用于VP2表达盒克隆的SfiI位点。</li>
		<li>将上述序列克隆至pGEM-T-easy载体中，随后将GFP和VP2基因表达盒克隆至该重组载体中，构建命名为pGEM-sgA-GFP-VP2的供体质粒22。 
		注：可使用任何克隆载体构建供体质粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质粒DNA制备
	<ol>
		<li>根据制造商说明书，使用商业化的DNA提取试剂盒分别制备供体质粒和Cas9/gRNA表达质粒的DNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. CRISPR/Cas9 介导的基因敲入：转染与感染
<ol>
	<li>转染前一天，使用10日龄鸡胚在添加了5%胎牛血清（FBS）、10%胰蛋白胨磷酸盐肉汤、100 U/mL青霉素-链霉素和0.25 µg/mL两性霉素B的M199培养基中制备鸡胚成纤维细胞（CEFs），用于转染/感染实验。每孔加入2.5 mL培养基，以1.3 × 106个细胞/孔的密度接种至6孔板的每个孔中。 
	注意：CEF细胞可在4 °C下保存3天。</li>
	<li>使用适当的转染试剂，按照制造商说明书，将步骤2.1中制备的CEF细胞与0.5 µg UL45/46-gRNA、0.5 µg sg-A以及1 µg pGEM-sgA-GFP-VP2共转染。将细胞在38.5 °C、5% CO2的培养箱中孵育12小时。</li>
	<li>在Cas9/gRNA和供体质粒转染后12小时，用M199培养基将HVT病毒原液稀释至1 × 105 pfu/mL。向每个转染细胞孔中加入130 µL稀释后的病毒，并设置一个未转染细胞孔作为阴性对照，加入等量病毒。将转染/感染的细胞在38.5 °C、5% CO2条件下孵育3天。所有操作均须依照资助方批准的《联合操作规范》（JCoPR）进行。</li>
</ol>
3. HVT 重组病毒的收获与纯化
<ol>
	<li>荧光激活细胞分选
	<ol>
		<li>在分选前一天，准备两块96孔板，每孔预先接种2 × 104 个CEF细胞。</li>
		<li>转染或感染后第3天，用胰蛋白酶消化CEF细胞。吸除各孔中的培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞层。每孔加入1 mL 0.05%胰蛋白酶-EDTA（0.48 mM），在38.5 °C培养箱中消化约5分钟。</li>
		<li>将细胞用50 µL胎牛血清（FBS）重悬，并转移至1.5 mL微量离心管中。以200 × g 离心5分钟。</li>
		<li>用含1% FBS的1 mL PBS重悬细胞。使用血细胞计数板计数细胞，并将细胞浓度调整至1 × 106 个/mL。 
		注：细胞可在冰上保存1–2小时。</li>
		<li>将细胞通过聚苯乙烯分选管的滤帽转移至分选管中。根据细胞分选仪的制造商说明，将表达GFP的单个细胞分选至已接种CEF细胞的96孔板中。将分选后的细胞在38.5 °C、5% CO2 条件下培养5天。 
		注：若原始孔中表达GFP的单个细胞过多而GFP阳性蚀斑较少，则在分选前可能需要进行一次病毒传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重组病毒的传代
	<ol>
		<li>在传代前一天，准备6孔板，每孔接种1.3 × 106 个CEF细胞。分选后第5天，在荧光显微镜下检查96孔板，标记含有单个GFP阳性蚀斑的孔。 
		注：代表性GFP阳性蚀斑见图2A。</li>
		<li>用50 µL胰蛋白酶-EDTA对每个GFP阳性孔消化3分钟，加入50 µL培养基，重悬细胞后将其转移至一个含CEF细胞的6孔板孔中。此即为第一代重组HVT病毒。</li>
		<li>3天后收获第一代重组病毒，将每种病毒各取1 mL加入含10%胎牛血清（FCS）、10%二甲基亚砜（DMSO）和80%培养基的冻存液中，冻存于液氮中。 
		注：收获时间根据病毒的数量和增殖能力而定，通常为2–4天。</li>
		<li>收集每种第一代病毒的1 × 105 个细胞，离心后弃去上清液。将细胞沉淀在-20 °C保存，用于DNA提取。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过聚合酶链式反应检测基因组插入
	<ol>
		<li>进行DNA提取时，将步骤3.2.4中的细胞沉淀解冻，并用50 µL裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl [pH 8]，1 mM EDTA，25 mM NaCl，以及200 µg/mL蛋白酶K）重悬，在65 °C裂解30分钟，随后在95 °C加热2分钟以灭活蛋白酶K。</li>
		<li>使用3'连接区引物（表1）进行聚合酶链式反应（PCR），每反应使用1 µL DNA样本。每个样本在冰上配制以下20 µL反应体系：2× PCR预混液（10 µL）、10 µM上游引物（0.5 µL）、10 µM下游引物（0.5 µL）、DNA模板（1 µL）和无核酸酶水（8 µL）。扩增程序为：95 °C预变性2分钟；95 °C变性30秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸40秒，共35个循环；72 °C终延伸7分钟。取2 µL扩增产物上样至1%琼脂糖凝胶的一个孔中进行电泳分析。 
		注：代表性3'连接区PCR结果见图2A。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 荧光报告基因的切除 通过 Cre-lox 系统
<ol>
	<li>为了从重组病毒中移除 GFP 基因，使用转染试剂按照制造商说明书，将 2 µg 的 Cre 重组酶表达质粒转染至预先接种了 CEF 细胞的 6 孔板中。</li>
	<li>转染后 12 小时，从液氮中取出一管重组病毒解冻，轻轻重悬后，向每孔转染细胞中加入 50 µL 病毒液，并设一孔为阴性对照，加入等量病毒。在 38.5 °C、5% CO2 条件下孵育 3 天。</li>
</ol>
5. 噬菌斑纯化
<ol>
	<li>荧光激活细胞分选
	<ol>
		<li>在分选前一天，将CEF细胞以每孔2 × 104个细胞接种至两块96孔板中。</li>
		<li>按照第4步感染后72小时（即第3.1步所述程序）处理感染细胞，用于分选。将单个无荧光信号的细胞分选至已接种CEF细胞的96孔板中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重组病毒的传代及PCR验证
	<ol>
		<li>分选后第5天，挑选5–10个无荧光的单个噬斑，加入50 µL胰蛋白酶-EDTA溶液，在38.5 °C下消化3分钟，随后加入50 µL培养基重悬细胞。 
		注：代表性GFP阴性噬斑见图2B。</li>
		<li>将一半细胞接种至预先接种了CEF细胞的6孔板中的每个孔，作为第二代病毒。</li>
		<li>将每个克隆剩余的细胞在200 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，用50 µL裂解缓冲液重悬细胞，用于DNA提取。</li>
		<li>使用5'连接区引物（表1），取1 µL DNA模板，按照第3.3.2步所述相同的PCR反应条件进行PCR扩增。 
		注：代表性5'连接区PCR结果见图2B。</li>
		<li>根据PCR结果，选择三个至五个HVT重组阳性克隆进行后续传代和验证。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 重组HVT的验证
<ol>
	<li>间接免疫荧光检测
	<ol>
		<li>将上一步（5.2）获得的第二代重组HVT感染前一天接种于24孔板中的CEF细胞（每孔2.5 × 105个细胞）。感染后48小时，吸除细胞培养基，加入500 µL含4%多聚甲醛的PBS固定细胞。室温孵育30分钟，随后吸除固定液，用PBS洗涤细胞层3次。 
		注意：此步骤后细胞可在4 °C保存数周。</li>
		<li>吸除PBS，加入500 µL含0.1% Triton X-100的溶液，室温孵育15分钟以通透细胞，随后用PBS洗涤细胞层3次。</li>
		<li>加入封闭缓冲液（含5%牛血清的PBS）封闭非特异性结合位点，室温孵育1小时。</li>
		<li>将一抗（抗VP2单克隆抗体HH7-或HVT感染鸡血清）用封闭缓冲液按1:200稀释，每孔加入200 µL，室温孵育1小时，随后用PBS洗涤细胞层3次。</li>
		<li>将二抗（Alexa 568标记的山羊抗小鼠IgG或Alexa 488标记的山羊抗鸡IgG）用封闭缓冲液按1:200稀释，每孔加入200 µL，室温孵育1小时，用PBS洗涤细胞3次。在荧光显微镜下观察蛋白表达情况。 
		注意：典型的VP2染色结果见图4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>VP2基因测序
	<ol>
		<li>使用高保真DNA聚合酶及引物UL45-F1和UL46-R1（表1）扩增覆盖UL45与UL46基因间区的DNA序列，以检测完整插入片段。</li>
		<li>配制以下50 µL反应体系：10x Pfx反应缓冲液5 µL，10 µM上下游引物混合液1.5 µL，10 mM dNTP混合液1 µL，50 mM MgSO4 1 µL，DNA模板1 µL，Pfx DNA聚合酶0.5 µL，加无核酸酶水至50 µL。扩增程序为：95 °C预变性2分钟；95 °C变性15秒，55 °C退火30秒，68 °C延伸3分钟，共35个循环。将全部PCR产物上样至1%琼脂糖凝胶进行电泳分析。</li>
		<li>按照DNA凝胶回收试剂盒说明书纯化PCR产物。将10 µL PCR产物（浓度30 ng/µL）送至测序公司，以确认VP2基因的敲入情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 重组病毒的稳定性
<ol>
	<li>在病毒扩增前一天，将 2.6 × 106 个 CEF 细胞接种至每个 T25 培养瓶中。</li>
	<li>从步骤 5.2 中解冻至少三个阳性克隆；将每管细胞/病毒加入一个 T25 培养瓶中。在 38.5 °C、5% CO2 条件下培养，直至观察到 50% 的细胞病变效应。</li>
	<li>用 2 mL 培养基收集细胞；取 50 µL 感染已预先接种 CEF 细胞的新 T25 培养瓶，用于下一代扩增。将重组病毒连续传代至少 15 代。每代病毒均通过 PCR 检测 VP2 序列的存在，并通过间接免疫荧光分析（IFA）检测 VP2 表达，以评估重组病毒的稳定性。</li>
</ol>

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<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+double-strand+DNA+break+repair+by+the+nonhomologous+DNA+end-joining+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway.</a> Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

CRISPR/Cas9 系统已成为基因编辑中一种重要的工具。传统的重组 HVT 载体构建技术，如同源重组13和 BAC 诱变技术25，通常需要多轮的载体克隆与筛选，以及大规模的筛选过程，可能耗时数月。本文所述的基于 NHEJ-CRISPR/Cas9 策略并结合 Cre-Lox 系统和单细胞分选的方法，在重组疫苗的构建中更为便捷、高效且快速。通过该流程，可在仅 1 - 2 周内获得重组病毒24，并且可通过荧光激活细胞分选将噬斑纯化步骤减少至单轮分离17。从 gRNA 设计和供体质粒构建到获得纯化的重组 HVT 病毒，整个过程可在 1 个月内完成。成功构建重组 HVT 的关键步骤包括：选择高效 gRNA 以靶向病毒基因组，确保外源基因插入时发生高效切割；实现高转染效率，以最大化 Cas9/gRNA 与病毒在同一细胞内相遇并进行编辑的机会；以及在供体质粒和 gRNA 质粒转染与病毒感染之间设置 12 小时的时间间隔，以确保在病毒进入细胞前，Cas9 和 gRNA 已达到适当的表达水平。
HVT 重组体构建的局限性在于通过连接 PCR 鉴定 GFP 阳性克隆的复杂性。GFP-VP2 盒子可能以任意方向插入。此处描述的连接 PCR 仅适用于鉴定正向插入的片段。若插入片段为反向，则使用所述引物对进行 PCR 将无法扩增，此时可互换使用内部引物以达到鉴定目的。另一个潜在问题是，由于 Cre 处理去除 GFP 后仍会残留 LoxP 序列，供体质粒只能用于同一病毒中单个基因的插入。若需进行多次插入，可改用带有变异 LoxP 序列的新供体质粒。
NHEJ 和 HDR（同源定向修复）是 Cas926,27 诱导的双链断裂（DSBs）的两种修复途径。NHEJ 效率更高，因其在整个细胞周期中均可发生28，而 HDR 效率较低，仅发生在 S 期和 G2 期6,29,30。本研究利用效率更高的 NHEJ 修复途径，将外源基因导入靶向位点。尽管 NHEJ 修复可能通过一种不依赖同源性的、机制上灵活的过程，连接被切割的供体序列与基因组 DNA 之间不匹配或受损的 DNA 末端，从而引入插入或缺失（indels）31,32，但这些 indels 仅可能出现在 sgA 的切割位点处，而不会影响外源基因表达盒。该方法的另一优势在于，NHEJ 不受同源臂构建的限制，使克隆步骤极为简便。这凸显了 NHEJ 在外源基因插入应用中的巨大潜力。在外源基因表达盒两端引入通用的 gRNA 靶位点，可使该过程更加迅速，供体模板可直接构建，无需针对特定 gRNA 进行筛选。含有 sgA 靶位点、LoxP 位点以及 PacI 和 SfiI 位点的供体质粒骨架，也可在不同报告基因、外源基因表达盒及不同病毒载体之间广泛共用，使这一新方法具备高度可定制化的优点。
本研究中使用携带 VP2 插入片段的 HVT 来描述本文的实验方案；然而，通过使用靶向相应目标序列的 gRNA，相同的方法也可用于在 HVT 基因组的不同基因组位点插入更多的病毒基因，从而开发多价重组 HVT 载体疫苗。其他马立克氏病病毒（MDV）疫苗株，如 SB-1 和 CVI988，以及其他禽类疱疹病毒（包括传染性喉气管炎病毒和鸭肠炎病毒），以及其他的禽类 DNA 病毒（如痘病毒和腺病毒），也可采用相同的方法进行改造，用于多价重组疫苗的开发。利用本文所述的 CRISPR/Cas9 系统平台开发新型多价载体疫苗，将对家禽产业预防多种家禽疾病具有重要意义。

马立克病（MD）是由禽疱疹病毒2型（Gallid Herpesvirus 2 [GAHV-2]）血清型1引起的鸡淋巴增生性疾病 马立克病毒属 亚科中 α-疱疹病毒亚科. 马立克病毒属 还包括两种非致病性血清型：血清型2（GaHV-3）和血清型3（MeHV-1，历史上称为HVT），二者均被用作预防马立克病（MD）的疫苗。活HVT疫苗（FC-126株）是20世纪70年代初期使用的首代MD疫苗，目前仍广泛用于二价和多价疫苗配方中，以增强对MD的保护效果。由于HVT具有良好的通用性和对人类及禽类的安全性，它还被广泛用作疫苗载体，以诱导对多种禽类疾病的免疫保护 在卵内 以及皮下孵化场给药和提供终身免疫的能力。重组HVT疫苗的制备策略基于病毒感染细胞中的常规同源重组、重叠cosmid DNA技术或BAC诱变。2然而，这些方法通常耗时较长且劳动强度大，需要构建转移载体，并在 大肠杆菌 噬斑纯化，以及从编辑后的病毒中去除BAC序列和筛选标记3,4.
CRISPR/相关蛋白（Cas9）是近年来最受欢迎的基因编辑工具，因其具有高度的通用性和特异性。CRISPR/Cas9系统已成功用于高效构建基因修饰细胞和动物模型5,6,7,8,9,10，以及多种大型DNA病毒基因组的改造11,12,13,14,15,16,17,18,19,20。在报道了一种利用CRISPR/Cas9系统编辑HVT基因组的简单高效方法后21，我们进一步建立了一套快速高效生成重组HVT的技术流程22。
为了拓展该方法的潜在应用，本文详细描述了在HVT的UL45/46位点插入表达IBDV VP2基因的重组HVT疫苗的构建方法。该方法结合使用NHEJ-CRISPR/Cas9技术将带有GFP报告基因标记的VP2基因插入病毒基因组，并利用Cre-LoxP系统在后续阶段切除GFP表达盒。与传统的同源重组和BAC重组工程技术相比，我们证明NHEJ-CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP系统是一种快速且高效的重组HVT疫苗构建策略。

<table><tbody><tr><td>M199 培养基，Earle's 盐</td><td>Life technology</td><td>11150059</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma</td><td>F0926</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>青霉素和链霉素</td><td>Life technology</td><td>15140148</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Sigma</td><td>1397-89-3</td><td>抗真菌剂</td></tr><tr><td>胰蛋白胨磷酸盐肉汤</td><td>Sigma</td><td>T8782</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>HVT Fc126 毒株</td><td>Avian Disease and Oncology Laboratory</td><td></td><td>野生型 HVT 病毒</td></tr><tr><td>pX459-v2</td><td>Addgene</td><td>质粒 #62988</td><td>Cas9 和 gRNA 表达载体</td></tr><tr><td>pGEM-T Easy 载体系统</td><td>promega</td><td>A1360</td><td>供体质粒克隆</td></tr><tr><td>Subcloning Efficiency DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>18265-017</td><td>转化</td></tr><tr><td>PacI</td><td>NEB</td><td>rR0547S</td><td>供体质粒克隆</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>NEB</td><td>R0123S</td><td>供体质粒克隆</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td>克隆</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep 试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td>质粒提取</td></tr><tr><td>TransIT-X2</td><td>Mirus</td><td>MIR 6004</td><td>转染</td></tr><tr><td>细胞培养 6 孔板</td><td>Thermofisher</td><td>140675</td><td>细胞培养</td></tr><tr><td>GoTaq Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7123</td><td>连接 PCR 扩增</td></tr><tr><td>Platinum Pfx DNA 聚合酶</td><td>Thermofisher</td><td>11708021</td><td>完整插入片段的 PCR 扩增</td></tr><tr><td>山羊抗鸡 IgY (H+L) 抗体，Alexa Fluor 488 标记</td><td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG 抗体，Alexa Fluor 568 标记</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td>免疫荧光染色</td></tr><tr><td>共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica TCS SP5 LASAF</td><td>免疫荧光</td></tr><tr><td>FACS 细胞分选仪</td><td>BD biosciences</td><td>BD FACSAria</td><td>单细胞分选</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PBS 中 4%）</td><td>Santa cruz biotechnology</td><td>SC-281692</td><td>细胞固定</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>GeneTex</td><td>GTX30960</td><td>通透处理</td></tr></tbody></table>

利用crispr/cas9基因编辑技术构建重组禽疱疹病毒载体

Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing

火鸡疱疹病毒（HVT）是一种理想的病毒载体，可用于利用细菌人工染色体（BAC）诱变或传统重组方法，研制针对多种禽类疾病的重组疫苗，例如禽流感（AI）、新城疫（ND）和传染性法氏囊病（IBD）。CRISPR/Cas9系统已在多种场景中成功用于基因编辑，包括对多个大型DNA病毒基因组的操作。我们已开发出一种快速且高效的基于CRISPR/Cas9的基因组编辑流程，用于构建重组HVT。为最大化该方法的应用潜力，本文详细介绍了表达传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2蛋白的重组HVT的构建方法。VP2表达盒被插入至HVT基因组中 通过 一种依赖于NHEJ（非同源末端连接）的修复通路。首先将一个绿色荧光蛋白（GFP）表达盒连接到插入片段上，以便于观察，随后将其移除 通过 Cre-LoxP 系统。该方法为将其他病毒抗原引入HVT基因组以快速开发重组疫苗提供了一种高效途径。

重组HVT疫苗构建策略如图1所示，包括供体质粒的构建方法（图1A）以及生成重组HVT的操作流程（图1B）。转染并感染后第3天，在荧光显微镜下可观察到基因敲入孔中出现5至30个被野生型蚀斑包围的GFP阳性蚀斑。通过单细胞分选获得的纯化病毒（图2A）经3'侧翼区PCR分析，结果显示扩增出预期大小的PCR产物（图2A，下图）。利用Cre重组酶切除GFP报告基因后，超过50%的蚀斑失去GFP表达。经单细胞分选获得GFP切除后的纯化蚀斑（图2B），进一步通过5'侧翼区PCR验证，结果显示扩增出正确大小的PCR产物（图2B，下图）。图3展示了两个侧翼区PCR产物的测序结果，并以不同颜色标示各序列元件。图4通过IFA使用VP2特异性单克隆抗体和抗HVT鸡血清确认了蛋白表达。正如预期，亲本HVT感染的细胞仅能被抗HVT血清染色（绿色），而重组HVT感染的细胞则明显表达VP2基因（红色）。
<img alt="质粒图谱与CRISPR/Cas9基因敲入流程；荧光细胞分选示意图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1: 重组HVT载体疫苗的制备策略. (A) 该图展示了用于构建供体质粒的克隆策略示意图。关键元件包括两个Cas9靶位点（sgA），用于释放插入片段；两侧带有LoxP序列的报告基因GFP表达盒，用于GFP的切除；以及VP2表达盒。B该图展示了一种两步基因敲入策略的概览。GFP和VP2表达盒的插入片段通过Cas9/sgA切割释放，并在UL45/46位点插入至HVT基因组中 通过 NHEJ-CRISPR/Cas9。随后通过单细胞荧光激活细胞分选（FACS）对GFP阳性重组病毒进行分选和纯化。接着利用Cre重组酶切除GFP报告基因，并对重组病毒进行纯化和鉴定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="GFP 表达荧光、显微镜观察、HVT-GFP-VP2、HVT-VP2 的 PCR 结果及基因分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：重组 HVT 的鉴定。（A）该图显示在荧光显微镜下观察到的 GFP 阳性蚀斑（HVT-GFP-VP2）（上图），以及使用引物 VP2-F 与 UL46-R1 对 HVT-GFP-VP2 的 3' 连接区进行 PCR 鉴定的结果。（B）该图显示通过 Cre 重组酶切除 GFP 后获得的蚀斑（HVT-VP2），以及使用引物 UL45-F1 与 VP2-R1 对 HVT-VP2 的 5' 连接区进行 PCR 鉴定的结果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因组编辑示意图，包含DNA序列比对；sgRNA靶向、表达盒整合。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：重组HVT病毒的序列分析。（A）本图中不同颜色标注的关键元件序列分别为：UL45/46之间的HVT基因间区，其中下划线部分为gRNA靶序列，箭头指示Cas9切割位点；VP2表达盒，其末端序列为斜体小写字母；红色显示的sg-A靶序列，箭头指示Cas9切割位点；绿色显示的LoxP位点序列；以及蓝色显示的两个SfiI位点序列。（B）本图展示了5'和3'连接区的测序结果，以及HVT-VP2结构的示意图，图中关键元件的颜色与其在序列中的表示相对应。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="HVT 细胞检测结果：荧光显微镜、DAPI 染色、抗 HVT 血清、VP2 单克隆抗体标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58193/58193fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：重组 HVT-VP2 的表征。 本图通过间接免疫荧光法（IFA）使用抗 VP2 单克隆抗体 HH7（红色）检测，证实 VP2 在感染的 CEFs 中成功表达。HVT 感染通过使用 HVT 感染鸡血清（绿色）的 IFA 确认。比例尺 = 20 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58193/58193fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

火鸡疱疹病毒（HVT）被广泛用作重组疫苗的载体平台，以预防多种禽类疾病。本文介绍了一种简单且快速的重组HVT载体疫苗制备方法，该方法结合了NHEJ-CRISPR/Cas9与Cre-Lox系统。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建重组禽疱疹病毒载体

火鸡疱疹病毒（HVT）是一种理想的病毒载体，可用于研制针对多种禽类疾病（如禽流感等）的重组疫苗。

该方法为将其他病毒抗原引入HVT基因组以快速开发重组疫苗提供了一种高效途径。该技术的一个优势在于，首先将GFP表达盒连接至插入片段，以便于直观检测，随后可通过Cre-LoxP系统将其去除。相同策略也可用于在HVT基因组的不同位点插入更多病毒基因，或应用于其他禽类疱疹病毒，以开发多价重组疫苗。演示该实验步骤的是细胞分选专家 Katy Moffat，以及来自我实验室的科研人员 Na Tang、Yaoyao Zhang 和 Guanggang Qu。转染前一天，按照文本方案中的说明准备鸡胚成纤维细胞。将130万个细胞接种到六孔板的每个孔中，每孔含2.5毫升培养基。使用适当的转染试剂，按照制造商说明书，将0.5微克的两种Cas9引导RNA质粒和1微克供体质粒共同转染CEF细胞。将细胞在38.5°C、5%二氧化碳条件下培养12小时。转染后12小时，用M199培养基将HVT病毒原液稀释至每毫升含100,000个空斑形成单位。向每孔转染细胞中加入130微升稀释后的病毒液。设一孔未转染细胞作为阴性对照，并加入等量病毒。将细胞在38.5摄氏度、5%二氧化碳条件下培养三天。分选前一天，准备两个96孔板，每孔接种20,000个细胞。感染后第三天，取出含有转染并感染的CEF的六孔板。吸出每孔中的培养基，并用 PBS 冲洗细胞层。每孔加入 1 毫升 0.05% 胰蛋白酶-EDTA，于 38.5°C、5% CO₂ 条件下孵育约 5 分钟。随后，用 50 微升胎牛血清（FBS）重悬细胞，并将此细胞悬液转移至 1.5 毫升微量离心管中。在200 × g条件下离心5分钟。用含有1% FBS的1毫升PBS重悬细胞。使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞密度调整至每毫升100万个细胞。接下来，通过细胞筛帽将细胞转移至聚苯乙烯分选管中。使用细胞分选仪将表达GFP的单个细胞分选到预先接种的96孔板中。将含有分选后细胞的培养板置于38.5°C、5%二氧化碳条件下培养五天。五天后，使用荧光显微镜检查96孔板，标记含有单个GFP阳性斑块的孔。每个GFP阳性孔加入50微升胰蛋白酶-EDTA，消化3分钟。然后加入50微升培养基重悬细胞，并将该细胞悬液转移至六孔板的一个孔中，该孔已含有CEF细胞。将第一代重组病毒各取一管，加入冻存液后于三天内逐步降温冻存。将收获的病毒储存于液氮中。从每种第一代病毒中收集 100,000 个细胞。将细胞在2,000 rpm下离心五分钟，弃去上清液。将细胞于-20摄氏度保存，直至准备进行DNA提取。当准备进行DNA提取时，使用50微升裂解缓冲液解冻并重悬细胞沉淀。将样品在 65 摄氏度裂解 30 分钟，然后在 95 摄氏度处理 2 分钟，以灭活蛋白酶 K。使用文本方案中所述的三端连接引物，以每份 DNA 样品 1 微升进行 PCR 反应。取 2 微升扩增产物加入到 1% 琼脂糖凝胶的一个加样孔中进行凝胶电泳。为从重组病毒中去除 GFP 基因，使用转染试剂将 2 微升 Cre 重组酶表达质粒转染至预先接种了 CEF 细胞的 6 孔板中。转染后12小时，从液氮中取出一管重组病毒并解冻。轻轻重悬病毒，将50微升加入转染细胞的每孔中，设一孔为阴性对照，加入等量病毒。在38.5摄氏度下培养三天。感染后72小时，按照先前所述方法制备细胞用于分选。将单个无荧光细胞分选至预先接种了CEF的96孔板中。随后，用胰蛋白酶消化所选的蚀斑，并按照文本方案中所述方法重悬相应细胞。将一半的细胞接种至已预先接种第二代CEF细胞的96孔板的每个孔中。将每个克隆的剩余细胞在200 × g下离心5分钟。弃去上清液，加入50 µL裂解缓冲液重悬细胞，用于DNA提取。然后，按照文本方案中所述，使用一微升DNA模板和5'端连接引物进行PCR。根据PCR结果，选取三个至五个重组HVT阳性克隆进行后续传代和验证。首先，在预先接种的24孔板中，用第二代重组HVT感染CEF细胞。感染后48小时，移除培养基，加入500微升含4%多聚甲醛的PBS溶液以固定细胞。室温孵育30分钟。随后，移除固定液，并用PBS洗涤细胞层三次。吸除 PBS，加入 500 微升 0.1% Triton X-100 以通透细胞。室温孵育 15 分钟后，用 PBS 洗涤细胞层三次。加入封闭缓冲液，室温孵育 1 小时，以阻断非特异性结合。然后，用封闭缓冲液将一抗——抗 VP2 单克隆抗体 HH7 或 HVT 感染的鸡血清——稀释至 1:200。每孔加入 200 微升稀释后的一抗，室温孵育 1 小时。用 PBS 洗涤细胞层 3 次。将二抗山羊抗小鼠IgG Alexa 568或山羊抗鸡IgG Alexa 488用封闭缓冲液按1:200稀释。每孔加入200 µL稀释后的二抗，室温孵育1小时。随后用PBS洗涤细胞3次。使用荧光显微镜检测蛋白表达。在病毒扩增前一天，将260万个CEF细胞接种至每个T25培养瓶中。解冻至少三个阳性克隆，并将一管细胞或病毒加入每个培养瓶中。将培养瓶置于含5%二氧化碳的38.5摄氏度环境中孵育，直至观察到50%细胞病变效应。随后用2毫升培养基收获细胞。取50微升感染已预先接种CEF细胞的新T25培养瓶，用于下一代培养。将重组病毒连续传代至少15代。通过PCR分析每一代病毒中VP2序列的存在情况。采用间接免疫荧光实验检测每一代病毒的VP2表达情况。单细胞分选后，通过3'端连接PCR分析获得的纯化病毒，结果显示产生预期大小的PCR产物。在Cre重组酶介导下切除了GFP报告基因后，超过50%的噬斑失去GFP表达。对GFP切除后的纯化噬斑再次进行单细胞分选，并通过5'端连接PCR进一步验证，结果显示产生预期大小的PCR产物。随后通过间接免疫荧光法，使用 VP2 特异性单克隆抗体和抗 HVT 鸡血清确认蛋白表达。如预期所示，仅被亲本 HVT 感染的细胞可被抗 HVT 血清染色，而重组 HVT 感染的细胞则明显显示出 VP2 基因的表达。为了产生重组病毒，需要实现高转染率，以最大程度地增加病毒与插入片段在同一个细胞内相遇并完成编辑的概率。在此程序基础上，可开展动物实验以评估重组疫苗的免疫原性和有效性。本文所述基于CRISPR/Cas9系统平台开发的新型多价载体疫苗，将对家禽产业预防多种家禽疾病具有重要意义。

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