Name: 沙门氏菌筛选的高通量平台. (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 了解沙门氏菌和志贺氏菌的高通量筛选方法，结合实时PCR与引导培养技术。该方法具有高特异性和灵敏度，可应用于其他病原体检测，为微生物学研究提供可靠工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

本工作得到了中国珠海市科技计划项目（项目编号 20171009E030064）、中国广东省科技计划项目（项目编号 2015A020211004）以及中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（项目编号 2016IK302、2017IK224）的支持。

本方案遵循珠海国际旅行卫生保健中心人类研究伦理委员会制定的指南。实验过程中请采用标准的无菌操作。
1. 培养基成分与制备
<ol>
	<li>制备营养肉汤：将1%蛋白胨、0.3%牛肉浸膏、0.5%氯化钠、0.1%葡萄糖溶于H₂O中2O，调节pH至7.5，于121 °C高压灭菌15分钟。</li>
	<li>制备亚硒酸盐胱氨酸培养基：溶解0.5%蛋白胨、0.4%乳糖、1% Na2HCO3，0.4% 亚硒酸氢钠，0.001% L-半胱氨酸在 H2O，调节pH至7.0，并煮沸5分钟。</li>
	<li>制备木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂（XLD）平板：将0.3%酵母提取物、0.5% L-赖氨酸、0.375%木糖、0.75%乳糖、0.75%蔗糖、0.5%氯化钠、0.008%酚红、0.68%硫代硫酸钠、0.08%柠檬酸铁铵、0.25%脱氧胆酸钠、1.5%琼脂溶于H₂O中2O，并调节pH至7.4。然后煮沸5分钟，倒入90 mm培养皿中。</li>
	<li>制备 沙门氏菌 显色培养基平板：将1.5%琼脂、0.7%蛋白胨和酵母提取物、1.29%选择性试剂溶解于H2然后煮沸5分钟，倒入90 mm培养皿中。</li>
	<li>制备营养琼脂平板：将1%蛋白胨、0.3%牛肉提取物、0.5%氯化钠、1.5%琼脂溶于H₂O中2O，并调节pH至7.3。随后在121 °C下高压灭菌15分钟，倒入90 mm培养皿中。</li>
	<li>制备麦康凯琼脂（MAC）平板：将2%蛋白胨、1%乳糖、0.5%氯化钠、0.5%OX胆盐、0.0025%中性红、1.5%琼脂、0.0001%结晶紫溶解于H₂O中2O，并调节pH至7.2。随后在115 °C下高压灭菌20分钟，倒入90 mm培养皿中。</li>
</ol>
2. 实时 PCR
<ol>
	<li>样本采集
	<ol>
		<li>将肛拭子插入患者肛门内 3-5 cm 深处，旋转 360°。</li>
		<li>将肛拭子放入无菌采样管中，标记样本编号。</li>
		<li>尽快将样本送至实验室。 
		注意：样本可在 4 °C 保存，但不得超过 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预增菌
	<ol>
		<li>向每支采样管中的样本加入 3 mL 营养肉汤。</li>
		<li>在培养箱中 36 °C 培养 6 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样本混合（可选）
	<ol>
		<li>若样本数量超过 10 个，可从每份预增菌培养物中取 100 µL，将 8-10 个样本混合至一支 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>正确标记。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA 提取
	<ol>
		<li>将预增菌培养物在 800 × g 离心 2 分钟，使大颗粒沉淀，转移上清液至新管中，在 12,000 × g 离心 5 分钟。用移液器吸弃上清液。</li>
		<li>向沉淀中加入 100 µL DNA 提取液（0.01 M pH 8.0 Tris-EDTA，0.01% Nonidet P 40 (NP40)），剧烈涡旋振荡 1 分钟。</li>
		<li>在干浴仪中 100 °C 煮沸 5 分钟。</li>
		<li>在 12,000 × g 离心 5 分钟，用新管收集上清液，作为后续实时 PCR 分析的模板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实时 PCR
	<ol>
		<li>反应体系配制如下：每个样本加入 12.5 µL 2× 反应混合液，每种引物 0.4 µM，每种探针 0.2 µM（序列见表 1）27，模板 5 µL（按步骤 2.4.4 制备），用 ddH2O 补足至 25 µL 总体积。</li>
		<li>循环程序设置如下：95 °C 预变性 3 分钟，随后进行 40 个循环（95 °C 变性 15 秒，55 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 34 秒）。在延伸步骤（72 °C）期间，由荧光实时 PCR 仪自动采集 6-羧基荧光素（FAM）和六氯荧光素（HEX）通道的荧光信号。</li>
		<li>按照仪器说明书，在荧光实时 PCR 仪上进行实时 PCR 检测。</li>
		<li>若 FAM/HEX 通道出现阴性结果，表明样本中沙门氏菌（Salmonella spp.）/志贺氏菌（Shigella spp.）为阴性，可直接进入第 4 步并出具阴性报告。</li>
		<li>若 HEX 和/或 FAM 通道出现阳性结果，分别提示样本可能为志贺氏菌（Shigella spp.）和/或沙门氏菌（Salmonella spp.）阳性。 
		注意：若在步骤 2.3 中进行了样本混合，则应对构成该阳性混合样本的各个单独样本重新进行实时 PCR 检测，以筛选出真正的阳性样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 指导性培养
<ol>
	<li>Salmonella spp. PCR 阳性样本
	<ol>
		<li>选择性培养基培养
		<ol>
			<li>取 100 µL 前增菌培养物加入含有 5 mL 亚硒酸盐胱氨酸培养基的试管中。置于 36 °C 恒温培养箱中培养 18–24 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>平板分离培养
		<ol>
			<li>用微量接种环取一环培养物，在 XLD 平板或 Salmonella 显色琼脂平板上划线接种。置于 36 °C 恒温培养箱中培养 18–24 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>生化鉴定
		<ol>
			<li>在 XLD 平板上挑选可疑菌落（粉红色菌落，有或无黑色中心；黑色菌落；黄色菌落，有或无黑色中心）或在 Salmonella 显色琼脂平板上挑选可疑菌落（紫色或紫红色菌落，表面光滑且呈圆形）（图 2）。</li>
			<li>根据仪器说明书，将可疑菌落接种至自动化微生物鉴定系统进行生化鉴定。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>血清学分型
		<ol>
			<li>O 抗原分型
			<ol>
				<li>取一滴 O 抗原多价血清滴加于洁净载玻片上。</li>
				<li>用微量接种环取一环菌落，在血清中研磨混匀。</li>
				<li>若出现类似流沙样凝集现象，则表明菌落与血清发生反应，进入步骤 3.1.4.1.4（图 3）；否则进入步骤 3.1.4.1.5。</li>
				<li>使用 O 抗原单价血清重复步骤 3.1.4.1.1 至 3.1.4.1.3，直至确定特异性 O 抗原类型。</li>
				<li>使用 Vi 血清重复步骤 3.1.4.1.1 至 3.1.4.1.3。将与 Vi 血清发生反应的菌落收集于试管中，在干浴器中 100 °C 煮沸 5 分钟，然后以 12,000 × g 离心 5 分钟。取沉淀物重复步骤 3.1.4.1.1 至 3.1.4.1.4，直至确定特异性 O 抗原类型。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>H 抗原分型
			<ol>
				<li>取一滴 H 抗原多价血清滴加于洁净载玻片上。</li>
				<li>用微量接种环取一环菌落，在血清中研磨混匀。</li>
				<li>若出现类似流沙样凝集现象，则表明菌落与血清发生反应，进入步骤 3.1.4.2.4。</li>
				<li>使用 H 抗原单价血清重复步骤 3.1.4.2.1 至 3.1.4.2.3，直至确定特异性 H 抗原类型。 
				注：有时需要进行血清诱导以鉴定第二相 H 抗原。如需诱导，请执行以下可选步骤。</li>
				<li>（可选）在营养琼脂平板上滴加一滴特异性 H 抗原血清，待血清完全吸收。</li>
				<li>（可选）用微量接种环取一环菌落，在已吸收特异性 H 抗原血清的平板上划线接种。置于 36 °C 恒温培养箱中培养 18–24 小时。</li>
				<li>（可选）使用 H 抗原单价血清重复步骤 3.1.4.2.1 至 3.1.4.2.3，直至鉴定出第二相 H 抗原。</li>
				<li>进入步骤 4。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Shigella spp. PCR 阳性样本
	<ol>
		<li>平板分离培养
		<ol>
			<li>用微量接种环取一环前增菌培养物，在 XLD 平板或 MAC 平板上划线接种。置于 36 °C 恒温培养箱中培养 18–24 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>生化鉴定
		<ol>
			<li>在 XLD 平板上挑选可疑菌落（光滑、圆形、透明、红色菌落）或在 MAC 平板上挑选可疑菌落（光滑、圆形、透明、无色菌落，直径约 2–3 mm；Shigella sonnei 菌落可能较大，随培养时间延长逐渐变为淡粉色）（图 4）。</li>
			<li>根据仪器说明书，将可疑菌落接种至自动化微生物鉴定系统进行生化鉴定。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>血清学分型
		<ol>
			<li>取一滴 Shigella spp. 多价血清滴加于洁净载玻片上。</li>
			<li>用微量接种环取一环菌落，在血清中研磨混匀。</li>
			<li>若出现类似流沙样凝集现象，则表明菌落与血清发生反应，进入步骤 3.2.3.4。</li>
			<li>使用 Shigella spp. 单价血清重复步骤 3.2.3.1 至 3.2.3.3，直至确定具体的 Shigella spp. 类型。</li>
			<li>进入步骤 4。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 报告
<ol>
	<li>根据上述结果出具阳性或阴性报告。</li>
</ol>

<ol><li>Roy, S. L., Scallan, E., Beach, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rate+of+acute+gastrointestinal+illness+in+developed+countries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">The rate of acute gastrointestinal illness in developed countries.</a> Journal of Water and Health. 4, Suppl 2 31-69 (2006).</li>
<li>Wilking, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+gastrointestinal+illness+in+adults+in+Germany%3A+a+population-based+telephone+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Acute gastrointestinal illness in adults in Germany: a population-based telephone survey.</a> Epidemiology and Infection. 141 (11), 2365-2375 (2013).</li>
<li>Friesema, I. H. M., Lugnér, A. K., van Duynhoven, Y. T. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Costs+of+gastroenteritis+in+the+Netherlands%2C+with+special+attention+for+severe+cases%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Costs of gastroenteritis in the Netherlands, with special attention for severe cases.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (8), 1895-1900 (2012).</li>
<li>Henson, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+costs+of+acute+gastrointestinal+illness+in+British+Columbia%2C+Canada%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Estimation of the costs of acute gastrointestinal illness in British Columbia, Canada.</a> International Journal of Food Microbiology. 127 (1-2), 43-52 (2008).</li>
<li>Okhuysen, P. C., Jiang, Z. D., Carlin, L., Forbes, C., DuPont, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-diarrhea+chronic+intestinal+symptoms+and+irritable+bowel+syndrome+in+North+American+travelers+to+Mexico%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Post-diarrhea chronic intestinal symptoms and irritable bowel syndrome in North American travelers to Mexico.</a> The American Journal of Gastroenterology. 99 (9), 1774-1778 (2004).</li>
<li>Wongboot, W., Okada, K., Chantaroj, S., Kamjumphol, W., Hamada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+detection+and+quantification+of+19+diarrhea-related+pathogens+with+a+quantitative+real-time+PCR+panel+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous detection and quantification of 19 diarrhea-related pathogens with a quantitative real-time PCR panel assay.</a> Journal of Microbiological Methods. 151, 76-82 (2018).</li>
<li>Van Lint, P., De Witte, E., Ursi, J. P., Van Herendael, B., Van Schaeren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening+algorithm+for+diagnosing+bacterial+gastroenteritis+by+real-time+PCR+in+combination+with+guided+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Microbiology+and+Infectious+Disease%22%5BJournal%5D)">A screening algorithm for diagnosing bacterial gastroenteritis by real-time PCR in combination with guided culture.</a> Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 85 (2), 255-259 (2016).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+molecular+diagnostic+methods+to+identify+causes+of+diarrhoea+in+children%3A+a+reanalysis+of+the+GEMS+case-control+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study.</a> Lancet. 388 (10051), 1291-1301 (2016).</li>
<li>Wang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveillance+of+shigellosis+by+real-time+PCR+suggests+underestimation+of+shigellosis+prevalence+by+culture-based+methods+in+a+population+of+rural+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Surveillance of shigellosis by real-time PCR suggests underestimation of shigellosis prevalence by culture-based methods in a population of rural China.</a> Journal of Infection. 61 (6), 471-475 (2010).</li>
<li>Wikswo, M. E., Hall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreaks+of+acute+gastroenteritis+transmitted+by+person-to-person+contact--United+States%2C+2009-2010%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Surveillance+Summaries%22%5BJournal%5D)">Outbreaks of acute gastroenteritis transmitted by person-to-person contact--United States, 2009-2010.</a> MMWR Surveillance Summaries. 61 (9), 1-12 (2012).</li>
<li>Shen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+12+Gastrointestinal+Pathogens+Spectrum+of+Acute+Infectious+Diarrhea+in+a+Sentinel+Hospital%2C+Shenzhen%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The 12 Gastrointestinal Pathogens Spectrum of Acute Infectious Diarrhea in a Sentinel Hospital, Shenzhen, China.</a> Frontiers in Microbiology. 7, 1926(2016).</li>
<li>Tariq, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+antimicrobial+resistance+and+integron+association+of+multidrug-resistant+clinical+isolates+of+Shigella+species+from+Faisalabad%2C+Pakistan%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of antimicrobial resistance and integron association of multidrug-resistant clinical isolates of Shigella species from Faisalabad, Pakistan.</a> Canadian Journal of Microbiology. 58 (9), 1047-1054 (2012).</li>
<li>Ferrari, R. G., Panzenhagen, P. H. N., Conte-Junior, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+Genotypic+Eligible+Methods+for+Salmonella+Typhimurium+Source+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and Genotypic Eligible Methods for Salmonella Typhimurium Source Tracking.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2587(2017).</li>
<li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+viable+but+nonculturable+state+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The viable but nonculturable state in bacteria.</a> The Journal of Microbiology. 43, Spec No 93-100 (2005).</li>
<li>Rintala, A., Munukka, E., Weintraub, A., Ullberg, M., Eerola, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+multiplex+real-time+PCR+kit+Amplidiag%28R%29+Bacterial+GE+in+the+detection+of+bacterial+pathogens+from+stool+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a multiplex real-time PCR kit Amplidiag(R) Bacterial GE in the detection of bacterial pathogens from stool samples.</a> Journal of Microbiological Methods. 128, 61-65 (2016).</li>
<li>Wohlwend, N., Tiermann, S., Risch, L., Risch, M., Bodmer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+Multiplex+Real-Time+PCR+Assay+for+Detecting+Major+Bacterial+Enteric+Pathogens+in+Fecal+Specimens%3A+Intestinal+Inflammation+and+Bacterial+Load+Are+Correlated+in+Campylobacter+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a Multiplex Real-Time PCR Assay for Detecting Major Bacterial Enteric Pathogens in Fecal Specimens: Intestinal Inflammation and Bacterial Load Are Correlated in Campylobacter Infections.</a> Journal of Clinical Microbiology. 54 (9), 2262-2266 (2016).</li>
<li>Van Lint, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+real-time+multiplex+PCR+for+the+simultaneous+detection+of+Campylobacter+jejuni%2C+Salmonella+spp.%2C+Shigella+spp.%2FEIEC%2C+and+Yersinia+enterocolitica+in+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Journal+of+Clinical+Microbiology+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a real-time multiplex PCR for the simultaneous detection of Campylobacter jejuni, Salmonella spp., Shigella spp./EIEC, and Yersinia enterocolitica in fecal samples.</a> Eur Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 34 (3), 535-542 (2015).</li>
<li>Kamkamidze, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Identification+Of+The+Etiological+Factors+Causing+Diarrheal+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Georgian+Medical+News%22%5BJournal%5D)">Rapid Identification Of The Etiological Factors Causing Diarrheal Diseases.</a> Georgian Medical News. (258), 89-92 (2016).</li>
<li>Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Application+of+a+Visual+DNA+Microarray+for+the+Detection+of+Food-borne+Pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Establishment and Application of a Visual DNA Microarray for the Detection of Food-borne Pathogens.</a> Analytical Sciences. 32 (2), 215-218 (2016).</li>
<li>Zhuang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Salmonella+spp.+by+a+loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+method+targeting+bcfD+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detection of Salmonella spp. by a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method targeting bcfD gene.</a> Letters in Applied Microbiology. 59 (6), 658-664 (2014).</li>
<li>Shi, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+simultaneous+detection+of+Salmonella+and+Shigella+using+modified+molecular+beacons+and+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Zhonghua+Liu+Xing+Bing+Xue+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">Rapid simultaneous detection of Salmonella and Shigella using modified molecular beacons and real-time PCR.</a> Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 27 (12), 1053-1056 (2006).</li>
<li>Mo, Q. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+96-microwell+plate+DNA+diagnostic+chip+for+detection+of+foodborne+bacteria+and+its+application+in+an+incident+of+food+poisoning%5BTitle%5D)+AND+%22Nan+Fang+Yi+Ke+Da+Xue+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">Preparation of a 96-microwell plate DNA diagnostic chip for detection of foodborne bacteria and its application in an incident of food poisoning.</a> Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 30 (3), 417-421 (2010).</li>
<li>Wang, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe-free+and+sensitive+detection+of+diarrhea-causing+pathogens+using+RT-PCR+combined+high+resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Probe-free and sensitive detection of diarrhea-causing pathogens using RT-PCR combined high resolution melting analysis.</a> Biologicals. 44 (5), 360-366 (2016).</li>
<li>Sun, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+simultaneous+screening+of+seven+clinically+important+enteric+pathogens+using+a+magnetic+bead+based+DNA+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Rapid simultaneous screening of seven clinically important enteric pathogens using a magnetic bead based DNA microarray.</a> World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27 (1), 163-169 (2011).</li>
<li>Qi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+for+rapid+detection+of+five+important+pathogenic+vibrios%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+health+laboratory+technology%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay for rapid detection of five important pathogenic vibrios.</a> Chinese Journal of health laboratory technology. (24), 3497-3500 (2014).</li>
<li>Blanco, G., Diaz de Tuesta, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-+and+molecular-based+detection+of+swine-adapted+Salmonella+shed+by+avian+scavengers%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Culture- and molecular-based detection of swine-adapted Salmonella shed by avian scavengers.</a> Science of the Total Environment. 634, 1513-1518 (2018).</li>
<li>Tang, X. J., Yang, Z., Chen, X. B., Tian, W. F., Tu, C. N., Wang, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verification+and+large+scale+clinical+evaluation+of+a+national+standard+protocol+for+Salmonella.spp.%2FShigella.spp.+screening+using+real-time+PCR+combined+with+guided+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Verification and large scale clinical evaluation of a national standard protocol for Salmonella.spp./Shigella.spp. screening using real-time PCR combined with guided culture.</a> Journal of Microbiological Methods. 145, 14-19 (2018).</li>
<li>Dekker, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drinking+water+from+dug+wells+in+rural+ghana--salmonella+contamination%2C+environmental+factors%2C+and+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Drinking water from dug wells in rural ghana--salmonella contamination, environmental factors, and genotypes.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 12 (4), 3535-3546 (2015).</li>
<li>Gargano, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mortality+from+selected+diseases+that+can+be+transmitted+by+water+-+United+States%2C+2003-2009%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Water+and+Health%22%5BJournal%5D)">Mortality from selected diseases that can be transmitted by water - United States, 2003-2009.</a> Journal of Water and Health. 15 (3), 438-450 (2017).</li>
<li>Kumar, R., Surendran, P. K., Thampuran, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+culture%2C+ELISA+and+PCR+assays+for+the+detection+of+Salmonella+in+seafood%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood.</a> Letters in Applied Microbiology. 46 (2), 221-226 (2008).</li>
<li>Herrera-Leon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blind+comparison+of+traditional+serotyping+with+three+multiplex+PCRs+for+the+identification+of+Salmonella+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes.</a> Research in Microbiology. 158 (2), 122-127 (2007).</li>
<li>Cunningham, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-hour+molecular+detection+of+Campylobacter%2C+Salmonella%2C+Yersinia%2C+and+Shigella+species+in+feces+with+accuracy+as+high+as+that+of+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Three-hour molecular detection of Campylobacter, Salmonella, Yersinia, and Shigella species in feces with accuracy as high as that of culture.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48 (8), 2929-2933 (2010).</li>
<li>Eriksson, E., Aspan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+culture%2C+ELISA+and+PCR+techniques+for+salmonella+detection+in+faecal+samples+for+cattle%2C+pig+and+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of culture, ELISA and PCR techniques for salmonella detection in faecal samples for cattle, pig and poultry.</a> BMC Veterinary Research. 3, 21(2007).</li>
<li>Dutta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+performance+characteristics+of+a+direct+PCR+with+stool+samples+in+comparison+to+conventional+techniques+for+diagnosis+of+Shigella+and+enteroinvasive+Escherichia+coli+infection+in+children+with+acute+diarrhoea+in+Calcutta%2C+India%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and performance characteristics of a direct PCR with stool samples in comparison to conventional techniques for diagnosis of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli infection in children with acute diarrhoea in Calcutta, India.</a> Journal of Medical Microbiology. 50 (8), 667-674 (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

由于 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 spp. 常与食物中毒及急性胃肠炎的粪-口传播有关28,29 常规方法要么费时，要么费力7我们描述了一个用于高通量的平台 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 spp. 筛查，采用实时PCR结合导向培养法。
为充分发挥该平台的性能，需考虑若干步骤。第一步是样本在营养肉汤（Nutrient Broth）中的预增菌步骤（步骤2.2）。尽管对于有明显症状（如腹泻）患者的粪便样本无需进行预增菌步骤， 等等。，对于在食品和饮用水从业人员岗前体检时采集的肛拭子样本，仍需进行常规的6小时预增菌步骤，因为这类人群主要是健康或至少无症状的成年人。如果该方案仅用于检测 沙门氏菌 spp.，则可使用亚硒酸盐胱氨酸增菌液进行预增菌，以提高检测灵敏度。第二个关键步骤是可疑菌落的鉴定（步骤 3.1.3...

腹泻仍然是全球范围内发病率较高的常见健康问题1,2。尽管其死亡率相对较低，但部分患者会出现持续数周的各种症状（如稀便、水样便、排便急迫感），导致较高的社会经济负担3,4。更严重的是，若未及时治疗，部分患者甚至可能发展为肠易激综合征5。可引起腹泻的病原体包括多种细菌、病毒和寄生虫6。Salmonella spp./Shigella spp. 是导致急性胃肠炎传播最常见的细菌之一7,8,9,10,11。因此，许多国家已出台法律法规，要求对从事食品和饮用水相关工作的人员定期进行 Salmonella spp./Shigella spp. 筛查。例如，中国政府已颁布法规，规定每年必须进行一次 Salmonella spp./Shigella spp. 强制性筛查。
金标准方法用于 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 细菌培养是检测菌种的常用方法。通过细菌培养以及后续的生化鉴定和血清学表征，我们可以确定细菌的种类，这有助于疾病暴发的管理和抗菌药物谱的建立，从而辅助患者的治疗12它还可以帮助追踪感染的来源 沙门氏菌 种（复数）/志贺氏菌 种爆发13然而，该方法耗时耗力（需要手动操作），尤其在检测大量样本时需花费数天时间7此外，活的但不可培养（VBNC） 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 sp.（复数：spp.）可能存在于某些粪便样本中14鉴于这些缺点，许多实验室已尝试开发新的检测技术 沙门氏菌 种（复数）/志贺氏菌 sp.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25所有这些方法均采用核酸扩增检测（NAAT），其中聚合酶链式反应（PCR）最为常见。这类基于NAAT的方法存在一个主要局限性，即死亡细菌，甚至含有不完整基因组DNA的细菌碎片，也可能产生阳性结果26，这可能在很大程度上影响疾病的准确诊断。Blanco 等 表明分子检测具有高度敏感性，不仅针对活的 沙门氏菌 在培养物中，以及来自既往感染或污染的不完整基因组和死亡或无活力的细菌26因此，应开发新技术。
本文介绍了一种将基于核酸扩增技术（NAAT）的方法与培养法相结合的新方法。如图1所示，该新方法首先进行实时PCR筛查，然后将阳性样本送交细菌培养与鉴定。

<table><tbody><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>798681</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Sigma</td><td>11332473001</td><td></td></tr><tr><td>ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Takara</td><td>9012</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSTAR HS (Premix)</td><td>Takara</td><td>R040Q</td><td></td></tr><tr><td>营养肉汤</td><td>LandBridge</td><td>CM106</td><td></td></tr><tr><td>营养琼脂</td><td>LandBridge</td><td>CM107</td><td></td></tr><tr><td>亚硒酸盐胱氨酸培养基</td><td>LandBridge</td><td>CM225</td><td></td></tr><tr><td>XLD</td><td>LandBridge</td><td>CM219</td><td></td></tr><tr><td>MAC&amp;nbsp;</td><td>LandBridge</td><td>CM908</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt; 显色琼脂</td><td>CHROMagar</td><td>SA130</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt; 诊断血清</td><td>天润</td><td>SAL60</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella&lt;/em&gt; 诊断血清</td><td>天润</td><td>SHI54</td><td></td></tr><tr><td>肛拭子（含采样管）</td><td>华辰阳</td><td></td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>明生</td><td>7102</td><td></td></tr><tr><td>微量接种环</td><td>维康康</td><td>W511</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>精宏</td><td>DNP-9082</td><td></td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>AUL</td><td>SS-325</td><td></td></tr><tr><td>干式恒温器</td><td>精宏</td><td>KB-20</td><td></td></tr><tr><td>全自动微生物鉴定系统</td><td>bioM&amp;eacute;rieux</td><td>VITEK2</td><td>可使用其他等效系统</td></tr><tr><td>荧光实时PCR仪</td><td>赛默飞世尔</td><td>ABI7500</td><td>可使用其他等效仪器</td></tr></tbody></table>

一种用于高通量筛选的平台 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 种（spp.）

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

急性胃肠炎的粪口传播时有发生，尤其是在处理食物和水源的人员感染了Salmonella spp./Shigella spp. 的情况下。检测Salmonella spp./Shigella spp. 的金标准方法是直接培养法，但该方法费时费力。本文介绍一种结合实时聚合酶链式反应（PCR）与引导培养的高通量Salmonella spp./Shigella spp. 筛查平台。该方法包含两个主要阶段：实时PCR和引导培养。在第一阶段（实时PCR）中，我们详细说明该方法的各个步骤：样本采集、前增菌、DNA提取和实时PCR检测。若实时PCR结果为阳性，则进入第二阶段（引导培养）：选择性培养、生化鉴定和血清学分型。我们还展示了该流程产生的代表性结果。本文所述方案可作为快速、特异、灵敏且高通量筛查Salmonella spp./Shigella spp. 的有效平台。

该方案用于对从事食品和饮用水处理人员的肛门粪便样本中沙门氏菌属（Salmonella spp.）和志贺氏菌属（Shigella spp.）的筛查。
在实时 PCR 步骤中，如图 5A所示，HEX 荧光通道中出现了成功扩增，表明该混合样本对沙门氏菌属（Salmonella spp.）呈阳性。随后对该阳性混合样本所包含的各个独立样本进行进一步的实时 PCR 检测。如图 5B所示，样本 2 呈阳性。因此，选择样本 2 进行沙门氏菌属（Salmonella spp.）的导向培养。在图 5C中，FAM 荧光通道中出...

Salmonella spp./Shigella spp. 是导致腹泻的常见病原体。本文介绍一种高通量平台，用于通过实时 PCR 结合导向培养法对 Salmonella spp./Shigella spp. 进行筛查。

急性胃肠炎的粪-口传播时有发生，尤其是在处理食物和水源的人员感染沙门氏菌的情况下……

该方法为沙门氏菌和志贺氏菌的筛查提供了高通量平台。该技术的主要优势在于可重复、特异性强、灵敏度高且通量高。该技术结合了核酸扩增检测（NAAT）的快速方法与培养法，即首先应用实时PCR进行初筛，然后将阳性样本送交细菌培养与鉴定。尽管本方法侧重于沙门氏菌和志贺氏菌的筛查，但也可应用于其他病原体，如弧菌、葡萄球菌、大肠杆菌等。该方法的可视化演示至关重要，因为样本中的背景菌群使得正确菌落的选择较为困难。首先，向每个样本中加入三毫升营养肉汤。然后，将样品在36摄氏度下孵育6小时。之后，以800 ×g离心预增菌培养物2分钟。接着，将上清液转移至新管中，并在12,000 ×g下再次离心5分钟。弃去上清液后，向沉淀中加入100微升DNA提取液。然后，将离心管涡旋振荡一分钟。接着，将样品置于干浴器中，于1,000摄氏度加热。重复离心后，将上清液收集至新管中。首先，按照文本方案配制反应混合液并设置循环程序。然后，在荧光定量实时PCR仪上进行实时PCR反应。首先，将100微升预增菌培养物加入5毫升亚硒酸盐胱氨酸培养基中。然后，在36摄氏度下培养18至24小时。接着，挑取一环培养物，将其涂布于平板上。然后，将平板在36摄氏度下孵育18至24小时。孵育结束后，挑选可疑菌落并将其转移至新的平板。在36摄氏度下再次孵育18至24小时。然后，使用自动微生物鉴定系统鉴定可疑菌落。开始进行O抗原表征时，向洁净的载玻片上加入一滴O抗原多价血清。取一环菌落转移至载玻片上，并在血清中研磨均匀。如果细菌呈现流动的沙粒状，则使用O抗原单价血清重复之前的处理步骤，直至完成抗原鉴定。开始H抗原鉴定时，取一滴H抗原多价血清加入洁净的载玻片上，然后挑取一环菌落，与血清混匀并涂布成网格状。使用H抗原单价血清重复处理，直至确定特异性H抗原。为分离培养物，取一环预增菌培养物并涂布于平板上。然后，在36°C下孵育18至24小时。孵育后，挑取一个形态可疑的菌落接种到平板上。将平板在36°C条件下孵育17至24小时。随后，使用自动化微生物鉴定系统对该菌落进行生化鉴定。接下来，在洁净的载玻片上滴加一滴志贺菌属多价血清。然后，用微量接种环取少量细菌，研磨混入血清中。最后，若血清呈现流动的沙粒样外观，则使用志贺菌属单价血清进一步鉴定该细菌。采用本方案对患者的粪便样本进行了沙门氏菌属和志贺氏菌属的筛查。通过实时PCR检测，在HEX通道中观察到成功的扩增信号，表明该样本沙门氏菌属呈阳性。进一步的实时PCR结果显示，样本二沙门氏菌属呈阳性，因此被选中进行靶向性的沙门氏菌属培养。在沙门氏菌属的选择性培养中，将粉红色和紫色的菌落分别划线接种，并进行生化鉴定。结果表明，2号样本的菌落为副伤寒沙门氏菌B型。通过实时PCR检测，FAM通道出现成功扩增，表明该样本志贺菌属呈阳性。进一步的实时PCR结果显示，10号样本志贺菌属呈阳性，因此被选中进行

a-high-throughput-platform-for-screening-salmonella-sppshigella

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

沙门氏菌筛选的高通量平台.

本文描述了一种基于液体培养和分配表达荧光报告蛋白的C. elegans菌株的方法，该方法无需昂贵的分选设备。该策略可应用于多种可诱导的C.

使用荧光标记的 C. elegans 菌株进行高通量筛选与生物传感

我们介绍一种低成本、高通量的方法，用于在大肠杆菌（E.

高通量筛选真菌内切葡聚糖酶活性 大肠杆菌

来源： 杨志， 等一种用于高通量筛选的平台 沙门氏菌 种（spp.）志贺氏菌 spp. 视频实验杂志 (2018)本视频展示了选择性富集与鉴定 沙门氏菌 使用木糖赖氨酸脱氧胆酸盐（XLD）和显色琼脂。亚硒酸盐肉汤可促进 沙门氏菌...

使用木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂和显色琼脂选择性富集与鉴定沙门氏菌

高通量检测方法以 体外 表型 沙门氏菌 或高通量检测细菌在吞噬细胞中的定植、侵袭及复制能力的方法已被建立。该方法已被用于评估 沙门氏菌...

高通量表型分析实验 肠炎沙门氏菌 鼠伤寒沙门菌与巨噬细胞的黏附、侵袭及复制

本实验方案的总体目标是合成一种功能性纳米传感器，通过结合磁弛豫和荧光发射两种模式，实现对特定目标病原菌的便携式、低成本且快速的检测。...

使用磁荧光纳米传感器进行食源性致病菌筛查：快速检测 E. Coli O157:H7

本文介绍一种可灵活应用的全生物体高内涵筛选工具，可用于研究宿主与病原体之间的相互作用，并适用于药物发现。...

一种高通量、高内涵、基于液体的 C. elegans 病理系统

本文介绍了一种用于测定血清中抗Shigella抗体杀菌活性的实验方案。将血清与细菌及外源补体混合，孵育后将反应混合物接种于琼脂平板。存活的细菌形成菌落，使用自动菌落计数仪进行计数，并据此确定杀菌滴度。...

高通量 志贺氏菌特异性杀菌试验

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种等温核酸扩增检测技术（iNAAT），在病原体检测领域已引起广泛关注。本文介绍一种经多家实验室验证的 沙门氏菌 LAMP 协议作为一种快速、可靠且稳健的筛查方法 沙门氏菌 在动物饲料中检测并确认疑似阳性样本 沙门氏菌...

环介导等温扩增技术用于筛查 沙门氏菌 在动物饲料中检测并确认 沙门氏菌 从培养物分离

肠道微生物可能对宿主的健康产生正面或负面的影响 通过 特异性或保守性机制 秀丽隐杆线虫 是一种用于筛选此类微生物的便捷平台。本实验方案描述了对48种细菌分离株进行高通量筛选，以评估其对线虫应激抗性的影响，该指标被用作线虫健康状况的替代参数。...

高通量筛选影响微生物分离物 秀丽隐杆线虫 健康

本文介绍了智能高通量抗菌药物敏感性检测/噬菌体筛选系统的原理、结构及操作方法。以中国山东地区家禽分离的沙门氏菌（Salmonella）为例，说明该系统的应用。计算了Lar指数，并全面讨论了其在评估抗菌药物耐药性中的意义。...

智能高通量抗菌药物敏感性检测/噬菌体筛选系统的应用及抗菌耐药性幼虫指数

本方案介绍了一种用于工业微生物的标准高通量筛选流程。该流程包括通过ARTP诱变构建突变体文库，利用自动化微流控技术进行正向液滴筛选，随后对筛选结果进行验证。该工作流程的可靠性已通过筛选高产B.

高通量筛选L-乳酸高产菌株 Bacillus coagulans 利用自动化液滴微流控平台筛选突变体

了解沙门氏菌和志贺氏菌的高通量筛选方法，结合实时PCR与引导培养技术。该方法具有高特异性和灵敏度，可应用于其他病原体检测，为微生物学研究提供可靠工具。

一种用于高通量筛选的平台沙门氏菌种（复数形式）/志贺氏菌种（spp.）

探索更多视频

一种用于高通量筛选的平台 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 种（spp.）

探索更多视频

一种用于高通量筛选的平台沙门氏菌种（复数形式）/志贺氏菌种（spp.）