一种用于高通量筛选的平台 沙门氏菌 种（复数形式）/志贺氏菌 种（spp.）

该方法为沙门氏菌和志贺氏菌的筛查提供了高通量平台。该技术的主要优势在于可重复、特异性强、灵敏度高且通量高。该技术结合了核酸扩增检测（NAAT）的快速方法与培养法，即首先应用实时PCR进行初筛，然后将阳性样本送交细菌培养与鉴定。

尽管本方法侧重于沙门氏菌和志贺氏菌的筛查，但也可应用于其他病原体，如弧菌、葡萄球菌、大肠杆菌等。该方法的可视化演示至关重要，因为样本中的背景菌群使得正确菌落的选择较为困难。首先，向每个样本中加入三毫升营养肉汤。

然后，将样品在36摄氏度下孵育6小时。之后，以800 ×g离心预增菌培养物2分钟。接着，将上清液转移至新管中，并在12,000 ×g下再次离心5分钟。

弃去上清液后，向沉淀中加入100微升DNA提取液。然后，将离心管涡旋振荡一分钟。接着，将样品置于干浴器中，于1,000摄氏度加热。

重复离心后，将上清液收集至新管中。首先，按照文本方案配制反应混合液并设置循环程序。然后，在荧光定量实时PCR仪上进行实时PCR反应。

首先，将100微升预增菌培养物加入5毫升亚硒酸盐胱氨酸培养基中。然后，在36摄氏度下培养18至24小时。接着，挑取一环培养物，将其涂布于平板上。

然后，将平板在36摄氏度下孵育18至24小时。孵育结束后，挑选可疑菌落并将其转移至新的平板。在36摄氏度下再次孵育18至24小时。

然后，使用自动微生物鉴定系统鉴定可疑菌落。开始进行O抗原表征时，向洁净的载玻片上加入一滴O抗原多价血清。取一环菌落转移至载玻片上，并在血清中研磨均匀。

如果细菌呈现流动的沙粒状，则使用O抗原单价血清重复之前的处理步骤，直至完成抗原鉴定。开始H抗原鉴定时，取一滴H抗原多价血清加入洁净的载玻片上，然后挑取一环菌落，与血清混匀并涂布成网格状。

使用H抗原单价血清重复处理，直至确定特异性H抗原。为分离培养物，取一环预增菌培养物并涂布于平板上。然后，在36°C下孵育18至24小时。

孵育后，挑取一个形态可疑的菌落接种到平板上。将平板在36°C条件下孵育17至24小时。随后，使用自动化微生物鉴定系统对该菌落进行生化鉴定。

接下来，在洁净的载玻片上滴加一滴志贺菌属多价血清。然后，用微量接种环取少量细菌，研磨混入血清中。最后，若血清呈现流动的沙粒样外观，则使用志贺菌属单价血清进一步鉴定该细菌。

采用本方案对患者的粪便样本进行了沙门氏菌属和志贺氏菌属的筛查。通过实时PCR检测，在HEX通道中观察到成功的扩增信号，表明该样本沙门氏菌属呈阳性。进一步的实时PCR结果显示，样本二沙门氏菌属呈阳性，因此被选中进行靶向性的沙门氏菌属培养。

在沙门氏菌属的选择性培养中，将粉红色和紫色的菌落分别划线接种，并进行生化鉴定。结果表明，2号样本的菌落为副伤寒沙门氏菌B型。通过实时PCR检测，FAM通道出现成功扩增，表明该样本志贺菌属呈阳性。进一步的实时PCR结果显示，10号样本志贺菌属呈阳性，因此被选中进行选择性培养。

在志贺氏菌属的引导培养中，将粉红色-红色和无色的菌落分别划线接种，并进行生化鉴定。结果表明，样本10含有福氏志贺氏菌II相细菌。在进行此操作时，需注意由于序列变异所导致的方法局限性。

在完成此操作步骤后，还可进行其他方法（如直接培养），以避免实时 PCR 出现假阴性结果。该技术为沙门氏菌和志贺氏菌检测领域的研究人员提供了新的途径，因为新方案可使阳性检出率提高一倍，并显著降低工作量和周转时间（TAT）。请注意，操作沙门氏菌和志贺氏菌可能具有极高危险性，在执行本操作时应始终穿戴个人防护装备（PPE）。