Name: 乙型肝炎体外感染形成的低拷贝数综合病毒 dna 的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: 学习使用体外感染和反向PCR技术检测乙型肝炎病毒DNA整合的方法。该技术可单拷贝分辨率精确定位病毒-宿主DNA连接位点，适用于HBV及其他整合病毒的研究。

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本工作获得了德国感染病研究中心（DZIF）、肝炎研究项目5.807和5.704、德国研究基金会（DFG）TRR179（课题组15）以及澳大利亚艾滋病和肝炎病毒学研究中⼼的资助。
我们感谢William Mason教授在开发原始invPCR方法以及向我们演示该技术过程中所做出的贡献。我们感谢Yi Ni博士和Florian A. Lempp博士提供试剂（细胞系和乙型肝炎病毒接种物）。我们感谢Anja Rippert、Franziska Schlund、Sarah Engelhardt以及Katrin Schöneweis博士在技术方面提供的协助。我们感谢Miriam Kleinig对文稿的校对，同时感谢Nicholas Shackel教授和Ralf Bartenschlager教授持续的支持。

1. 细胞感染与DNA提取
<ol>
	<li>在添加了10% v/v 胎牛血清、1×青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养Huh7-NTCP细胞8,9。 
	注意：此方法此前已有详细报道40。</li>
	<li>将2 × 105 个细胞/mL的Huh7-NTCP细胞以每孔1 mL DMEM接种至12孔板中。</li>
	<li>若需测试细胞处理条件（例如，HBV抑制剂），则在接种后4小时（HBV感染前1天）将其加入培养上清中。作为阴性对照，加入200 nM Myrcludex B（一种强效的HBV进入抑制剂41）。</li>
	<li>使用经肝素柱纯化42的HepAD3843上清液作为接种物，在500 µL培养基（含10% v/v 胎牛血清、1×青霉素/链霉素、2 mM L-谷氨酰胺和2.5% v/v DMSO的DMEM）中以1,000 VGE/细胞的剂量感染细胞，该培养基还含有4% w/v 聚乙二醇8000［溶于1×磷酸盐缓冲液（PBS）］。</li>
	<li>将细胞置于37 °C培养箱中培养（设定为5% CO2和90%湿度）。</li>
	<li>感染后16–24小时，用1 mL无菌1× PBS洗涤细胞两次。</li>
	<li>HBV感染后每隔2天更换一次培养基，直至收获细胞。</li>
	<li>感染后第3天，用5 µM 替诺福韦酯和10 µM 拉米夫定处理细胞，以限制可被invPCR扩增的HBV复制中间体的产生。</li>
	<li>感染后第5天，用200 µL胰蛋白酶-EDTA消化细胞，并将其重悬于2 mL DMEM中（含10% v/v 胎牛血清、1×青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺），同时加入5 µM 替诺福韦酯和10 µM 拉米夫定。</li>
	<li>将细胞悬液转移至6孔板中，诱导完成一轮有丝分裂（已有报道表明该过程可导致HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）44及其他可被invPCR扩增的HBV DNA中间体的丢失）。</li>
	<li>感染后第7天，用400 µL胰蛋白酶-EDTA消化扩增后的细胞，并将细胞悬液重悬于1 mL DMEM中。将悬液转移至1.5 mL离心管中，在500 × g条件下离心5分钟收集细胞沉淀，并用移液器吸除上清液。</li>
	<li>（可选）将细胞沉淀在-20 °C保存，直至进行DNA提取。</li>
	<li>按照制造商说明书，使用DNA提取试剂盒从细胞沉淀中提取DNA。通过光密度测定法估算最终DNA浓度。 
	注意：在100 μL洗脱体积中，DNA产量通常约为250–400 ng/μL。</li>
</ol>
2. DNA 片段的倒位
<ol>
	<li>将步骤1中提取的总DNA约1.5–2.5 μg分装至一个200 μL的PCR管中。加入适量的限制性内切酶预混液，使反应总体积为40 μL，其中含有1×消化反应缓冲液（例如，CutSmart 缓冲液）和 10 U NcoI-HF</li>
	<li>充分混匀反应液，然后在小型离心机中离心收集。将限制性内切酶反应置于PCR仪中，在37 °C孵育1小时，以获得最佳消化效率。</li>
	<li>通过在 80 °C 下孵育 20 分钟使限制性内切酶失活。</li>
	<li>将整个限制性内切酶反应液转移至一个1.5 mL离心管中。加入400 μL 1x T4 DNA连接酶缓冲液和500 U T4 DNA连接酶，并充分混匀。较大的反应体积有利于消化后的DNA片段发生分子内连接（而非分子间连接）。</li>
	<li>将连接反应在室温下孵育2小时，以确保连接完全。</li>
	<li>在70 °C下灭活T4 DNA连接酶20分钟。</li>
	<li>加入10 μL 10% w/v 十二烷基硫酸钠，以确保T4连接酶完全失活。</li>
	<li>通过瞬时涡旋振荡混匀各管，并短暂离心收集反应液。加入 NaCl 至终浓度为 100 mM，以及葡聚糖（35–45 kDa）至终浓度为 90 µg/mL。再次通过瞬时涡旋振荡混匀各管，并短暂离心收集反应液。</li>
	<li>加入900 μL 100%乙醇，倒置混匀。在-20 °C下沉淀DNA过夜。</li>
	<li>通过在14,000 × g离心15分钟使沉淀的DNA成团。使用P200移液器吸弃上清液。用500 μL 70%（v/v）乙醇洗涤沉淀，然后在14,000 × g离心15分钟。</li>
	<li>用P200移液器吸去乙醇。将DNA沉淀在室温下空气干燥20分钟。</li>
	<li>将沉淀溶解于20 μL H2O. 加入20 μL限制性内切酶预混液，使反应体系终体积为40 μL，其中包含1x消化反应缓冲液和5 U的 BsiHKAI 和 5 U 的 SphI-HF. 将限制性内切酶反应置于37 °C的加热块中孵育（该温度是 SphI-HF）孵育 1 小时。</li>
	<li>短暂离心反应混合物。将限制性内切酶反应置于65 °C的加热块中孵育（该温度为 BsiHKAI）孵育1小时。</li>
	<li>短暂离心反应混合物。</li>
	<li>将倒置的 DNA 在 -20 °C 保存，直至进行下一步。</li>
</ol>
3. 巢式 PCR
<ol>
	<li>使用DNA降解溶液去除可重复使用的硅胶垫密封圈上的潜在扩增子，用无DNA的水彻底冲洗该垫片，并在配制PCR混合液的同时于室温下晾干。</li>
	<li>配制1 mL含有外侧正向引物（5’-TTC GCT TCA CCT CTG CAC G-3’）和反向引物（5’-AAA GGA CGT CCC GCG CAG-3’）的1x PCR混合液，引物终浓度为0.5 µM。</li>
	<li>将170 μL的1x PCR混合液加入96孔PCR板的A1和E1孔中。</li>
	<li>将120 μL的1x PCR混合液加入B1至H1孔中。</li>
	<li>向A1和E1孔中各加入10 μL步骤2中获得的倒置DNA（同一块PCR板可同时分析两个不同的倒置样本）。使用设定为100 μL的P1000移液器轻柔吹打约10次，混匀各孔中的反应体系。</li>
	<li>通过每步转移60 μL，将A1至D1孔中的样品按1:3比例进行连续稀释。每步稀释后，使用设定为100 μL的P1000移液器轻柔吹打约10次混匀各孔，避免产生气泡。对E1孔重复此步骤3.6，稀释至H1孔。</li>
	<li>使用多通道移液器将A1-H1孔中的反应混合液各10 μL分装至A2-H2、A3-H3，依此类推，直至A12-H12孔。用步骤3.1中干燥的硅胶垫覆盖PCR板，并用力压紧。</li>
	<li>将PCR板放入PCR仪中，运行以下程序：95 °C预变性10分钟；进行35个循环（95 °C变性15秒，54 °C退火15秒，72 °C延伸3分钟）；72 °C最终延伸7分钟；然后将PCR板置于室温保存。</li>
	<li>用本生灯将96针复制器的针头加热至红热，随后在室温下冷却至少5分钟。</li>
	<li>向第二块PCR板的各孔中加入含凝胶上样缓冲液的1x PCR混合液10 μL，并加入内侧正向引物（5’-CGC ATG GAG ACC ACC GTG A-3’）和反向引物（5’-CAC AGC CTA GCA GCC ATG G-3’），引物终浓度为0.5 µM。</li>
	<li>小心移除第一轮PCR所用96孔PCR板上的硅胶垫，避免孔间交叉污染。</li>
	<li>使用已冷却的复制器，将第一轮PCR产物从96孔板转移至新分装的96孔板中。进行巢式PCR扩增，反应条件与步骤3.8相同，但初始变性步骤由95 °C 10分钟改为95 °C 2分钟。</li>
</ol>
4. PCR 产物纯化与凝胶回收
<ol>
	<li>使用96孔板和1.3%（w/v）琼脂糖凝胶，通过凝胶电泳分析PCR产物。对于100 mL琼脂糖凝胶，以200 V电压电泳10–15分钟。</li>
	<li>使用一次性饮用吸管从琼脂糖凝胶中切下DNA条带。针对每个PCR产物，将吸管及琼脂糖凝胶块放入1.5 mL离心管中，并用剪刀将吸管剪至合适长度。 
	注意：仅需从能够分辨出单一PCR产物的稀释样品中回收条带即可。</li>
	<li>（可选）将离心管在-20°C保存，以备后续提取使用。</li>
	<li>通过挤压吸管碎片的一端，将琼脂糖凝胶块弹入各离心管中。向每管中加入300 μL凝胶提取缓冲液和5 μL凝胶提取玻璃珠悬液。</li>
	<li>按照凝胶回收试剂盒的生产商说明书进行PCR产物提取（洗涤步骤使用半量试剂），并用30 μL水从玻璃珠上洗脱DNA。</li>
	<li>将纯化的DNA送交进行Sanger测序（遵循测序服务供应商的说明），使用第二轮巢式PCR中的正向引物。</li>
</ol>
5. 序列分析
<ol>
	<li>通过核苷酸BLAST分析（使用默认设置，比对整个核苷酸序列库）确认病毒-细胞DNA连接处。 
	注：代表性结果详见于 图3 如下。
	<ol>
		<li>若仅观察到序列的部分比对，应在重新运行BLAST分析之前截去5’端HBV DNA序列。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用严格的选择标准来判断特定序列是否代表真实的整合连接位点，具体如下：
	<ol>
		<li>仅包含含有以下序列的 &#62;20 bp的细胞序列，以实现对细胞基因组的可靠比对。</li>
		<li>忽略在假定的病毒-细胞整合位点附近10 bp范围内含有任何所用限制性内切酶识别位点的序列，因为这些序列很可能代表 体外 连接事件而非真实的整合连接点。</li>
		<li>忽略测序色谱图中假定整合位点两侧荧光峰值信号明显不一致的序列，这些很可能是由测序反应或毛细管电泳过程中交叉污染产生的假象。</li>
		<li>将独特的整合事件定义为在病毒-细胞连接处具有完全相同的乙型肝炎病毒（HBV）和细胞序列的事件。 
		注意：相同的整合事件重复出现可能是由于含有这些整合事件的细胞发生了克隆扩增，或在PCR过程中发生了交叉污染（可通过阴性对照反应进行检测，具体见下文代表性结果部分）。由于采用的是非同源末端连接途径，针对特定细胞序列的重复整合在每次整合事件中应表现出不同的HBV末端位点。15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将倒置DNA模板的稀释倍数乘以该稀释度下检测到的病毒-细胞连接数，再归一化至反转反应中输入的总DNA量，计算整合频率。通常情况下，整合频率约为1:104 细胞</li>
</ol>

S.U. 是保护 Myrcludex B 作为 HBV/HDV 入侵抑制剂的专利的共同申请人和共同发明人。T.T. 宣布不存在利益冲突。

在进行本实验方案之前，需要注意的是，该反向PCR（invPCR）检测是一种高度敏感的技术，能够扩增单拷贝的DNA模板。因此，防止PCR产物污染至关重要。为减少PCR产物污染，可采取以下通用策略：（i）为实验的不同步骤设立物理上相互隔离的操作区域。每个区域应配备专用的实验服，且在不同区域间移动时必须更换手套。以下区域按污染风险从高到低排序列出：PCR产物提取及测序反应体系构建区域（PCR后操作区）；PCR模板添加及灼烧接种针转移区域（我们使用带有去污染紫外灯的PCR操作台，效果良好）；DNA提取及反向转化操作区域（PCR前操作区）；以及 &#34;无需DNA模板&#34; 仅用于配制母液和PCR溶液的区域。（ii）注意实验室内的气流可能引起的交叉污染。特别是在火焰灭菌针头转移步骤中，PCR反应最容易发生交叉污染，从而导致整合频率的定量结果不准确。可使用PCR专用通风罩以减少此类气流干扰。阴性对照孔（例如， Myrcludex B 处理的样本或无模板对照）也可用于检测 PCR 中的交叉污染。（iii）定期使用 DNA 降解溶液擦拭移液器和工作台面，以减少潜在的 PCR 污染物。
本方案旨在检测源自 HepAD38 细胞系的已知感染性 HBV 克隆的整合情况42。如果所使用的接种物为不同 HBV DNA 序列（例如，来自患者血清），则应首先对 HBV 基因组进行测序，以确认 PCR 引物和反向设计的兼容性。在先前发表的研究中19，我们使用了三组引物，它们结合于预期 HBV DNA 整合位点两侧的保守 HBV DNA 序列。已有其他引物序列和方案被用于确定 HBV 的基因组序列44,45,46,47,48&#160;，也可能成功应用。
此外，可使用不同的乙型肝炎病毒（HBV）易感细胞（例如，原代人肝细胞、分化的HepaRG细胞、HepG2-NTCP细胞）；然而，我们发现，在考虑扩增的病毒-细胞DNA连接数量与扩增的病毒中间体DNA数量之比时，Huh7-NTCP细胞具有最高的信噪比13。特别是，像原代人肝细胞或分化的HepaRG细胞这类终末分化的细胞不能有效进行有丝分裂，导致细胞内残留高水平的可扩增HBV DNA复制中间体。我们发现，在终末分化细胞中，约90%的扩增序列代表HBV DNA重排（而非整合事件），而在肝癌细胞系中该比例为70–50%13。这些产物通常是HBV DNA基因组，其表面抗原和核心开放读码框存在大片段缺失，或代表在SphI位点之前含有额外NcoI位点的HBV准种。这些HBV物种的扩增方法（包括示意图）此前已有详细描述13。
该方法存在若干缺点。由于该实验方案耗时较长且需要多天完成，反向PCR不适用于对大量样本进行高通量分析。此外，由于本方法依赖于有限稀释滴定法，因此在定量方面精确度不高；尽管如此，它应能轻松检测到整合频率的对数水平变化。
此外，我们的反转录检测方案仅适用于检测发生在HBV基因组DR2与DR1区域之间的整合事件，因为大多数HBV整合事件均发生于该区域49NGS对HBV患者组织的分析表明，有相当一部分（高达约50%）可能也出现在该区域之外49新的invPCR设计理论上能够检测这些其他整合位点，尽管据我们所知，目前尚未有相关实验实施。此外，由于反转反应需要在病毒-细胞连接序列的下游存在特定的限制性内切酶位点，invPCR无法检测发生在HBV基因组DR2和DR1区域内的全部整合事件。即， 我们估计，使用该方法可检测到约10%的所有整合事件。 计算机模拟 模拟13然而，当应用于处理种类较少的集中样本批次时，反向PCR（invPCR）是目前唯一可用于在单碱基对分辨率下检测整合型HBV DNA的实用方法。
因此，我们设想该方法将在发现诱导乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合的因素方面发挥关键作用，这些因素包括病毒因素（通过HBV接种物的突变）、细胞因素（通过特异性细胞基因的敲除或过表达，或通过应用各种药物）以及环境因素（例如，暴露于氧化应激）。借助本方法及新开发的HBV感染系统，我们能够以前所未有的方式控制这些因素，从而将其有效分离并进行更深入的表征。我们还预期，这将有助于深入理解HBV DNA整合对细胞造成的后果，包括整合形式在多大程度上表达病毒抗原（例如，HBx或HBsAg50）、这种表达受到何种调控，以及HBV整合是否显著改变细胞表型，使其向更具促癌状态转变。这些未来研究的结果将对慢性乙型肝炎的治疗策略以及对病毒本身的基础认知产生深远影响。

乙型肝炎病毒（HBV）是一种双链DNA病毒，可导致终身慢性感染，进而引发肝硬化和肝细胞癌（HCC）。1,2,3. 尽管存在多种驱动HBV持续存在的分子机制4 (例如， 表观遗传病毒转录模板的高稳定性、免疫监视逃逸以及肝细胞在肝脏中的低更新率，及其相关的肝细胞癌（HCC）发生风险5,6 (例如， 慢性炎症和细胞应激通路的激活）与乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合至宿主细胞基因组之间存在关联（上述两种现象已有报道的机制之一），但该领域的研究仍十分有限。主要原因在于缺乏合适的 体外 用于HBV的感染系统，可可靠检测整合事件。本文描述了一种近期开发的方案，适用于两者 体外 HBV DNA 整合的产生与检测，可用于阐明其潜在的分子机制及后果。
HBV的复制以及HBV DNA整合的形成此前已有详细综述7。简而言之，HBV利用钠-牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）作为主要的细胞受体进入肝细胞8,9。含有HBV松弛环状DNA（rcDNA）基因组的HBV核衣壳进入细胞核，在核内rcDNA被转化为游离型的共价闭合环状DNA（cccDNA）。核内的cccDNA作为病毒mRNA和前基因组RNA（pgRNA）的转录模板10。随后，HBV聚合酶和pgRNA被包装至新形成的核衣壳中（由HBV核心蛋白二聚体组成）。在核衣壳内，HBV pgRNA发生逆转录，生成松弛环状DNA（rcDNA）基因组或双链线性DNA（dslDNA）基因组11,12。最终，这些含有HBV DNA基因组的成熟核衣壳被包膜并以病毒颗粒形式释放出去。
包膜颗粒感染肝细胞并携带双链线性DNA分子可能导致病毒整合至宿主细胞基因组13，导致HBV DNA的复制缺陷型形式7,14,15乙型肝炎病毒DNA整合发生在染色体双链DNA断裂位点15越来越多的证据表明，每次整合事件均基本随机地发生在宿主细胞基因组的不同位置16,17此外，HBV DNA 整合的发生率相对较低，约为每 10 个中 1 次4 细胞13,18,19,20关于HBV DNA整合，仍有一些重要问题尚未解答，特别是涉及其确切的分子通路、对病毒和宿主因素的依赖性、整合形式所表达的病毒抗原，以及这些抗原对病毒持续存在的可能贡献。7我们已建立了一个 体外 模型以阐明其中一些问题。
HBV DNA 整合事件的罕见性（无论是在每细胞的整合率还是每个独特整合事件的拷贝数方面） 体外 乙型肝炎病毒（HBV）感染模型使其难以被检测。在我们的实验中，细胞有丝分裂受到限制。 体外 系统，因为分裂中的细胞不支持高效感染。因此，与患者肝组织中肝细胞发生显著克隆扩增的情况不同18,19,20，每个感染细胞池中每种整合序列仅有极少拷贝（1到2个） 体外我们还发现，整合主要发生在肝细胞的初始感染期间（而非慢性感染的肝细胞中持续发生）13因此，仅仅通过延长细胞培养时间并不能增加HBV DNA的整合。
通常，以往用于检测整合型HBV DNA的方法，包括Southern印迹杂交21,22,23,24,25、Alu-PCR26,27、介导连接PCR28以及全基因组测序29,30,31,32,33，均缺乏检测单拷贝整合事件的灵敏度。我们及其他研究人员已采用反向巢式PCR（invPCR）来检测感染肝脏中鸭、土拨鼠和人类的嗜肝DNA病毒DNA整合13,14,18,19,34,35,36。其他研究者对invPCR技术引入了程序性改进，这些改进可能影响假阳性信号的产生，并限制定量能力37。若按照本实验方案所述操作，invPCR是一种特异且灵敏的检测方法，可识别并以绝对拷贝数对多个HBV DNA整合事件进行定量。该方法可实现HBV-细胞DNA连接区域的单碱基对分辨率测序，从而支持对整合位点处病毒与宿主DNA序列进行生物信息学分析13。
我们此前已描述过38&#160;来自多种来源的HBV感染组织DNA的invPCR结果，包括速冻肝组织、石蜡包埋肝切片以及通过激光显微切割分离的极小组织样本19. 本方案概述了一种改进的反向PCR（invPCR）检测方法，该方法使用从细胞培养来源的组织中提取的DNA进行检测 体外 感染，其中整合的拷贝数较低（每次整合1–2个拷贝）。所形成的HBV DNA整合片段 体外 在细胞基因组中的分布以及整合的病毒序列内部的连接位置方面，与患者组织中发现的情况相似13,16，提示在感染的肝脏中存在类似的通路。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s PBS</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>使用前需热灭活</td></tr><tr><td>青霉素，10,000 U/mL；链霉素，10 mg/mL，100&amp;times;</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺，200 mM</td><td>PAA</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶，0.5 mg/mL；EDTA，0.22 mg/mL，1&amp;times;</td><td>PAA</td><td>L11-004</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇（PEG），分子量 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89510</td><td>以 1×PBS 配制成 40% w/v 储存液，使用前高压灭菌</td></tr><tr><td>用于光谱分析的二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Merck</td><td>102950</td><td></td></tr><tr><td>替诺福韦酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CDS021622</td><td>溶于 DMSO</td></tr><tr><td>拉米夫定</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1295</td><td>溶于 DMSO</td></tr><tr><td>NucleoSpin 组织提取试剂盒</td><td>Macherey Nagel</td><td>740952.250</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000/2000c 分光光度计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nco&lt;/em&gt;I-HF</td><td>NEB</td><td>R3193L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>433209</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖（35–45 kDa）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1662-10G</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32205-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Bsi&lt;/em&gt;HKAI</td><td>NEB</td><td>R0570L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Sph&lt;/em&gt;I-HF</td><td>NEB</td><td>R3182L</td><td></td></tr><tr><td>Amplitaq Gold Taq 试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4331816</td><td>用于第一轮巢式 PCR</td></tr><tr><td>96 孔 PCR 板用硅胶密封垫</td><td>Biorad</td><td>2239442</td><td></td></tr><tr><td>DNAZap PCR DNA 降解溶液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>96 孔 PCR 板</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CLS6509 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>96 针复制器</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>250520</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Flexi PCR 试剂盒</td><td>Promega</td><td>M8295</td><td>用于第二轮巢式 PCR，使用绿色缓冲液以便琼脂糖凝胶上样</td></tr><tr><td>Biozym LE 琼脂糖</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II 凝胶回收试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>20051</td><td></td></tr></tbody></table>

低拷贝数整合病毒dna的检测方法 体外 乙型肝炎感染

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

乙型肝炎病毒（HBV）是一种常见的经血液传播的病原体，可因慢性感染导致肝癌和肝硬化。该病毒通常通过一种游离的DNA中间体进行复制；然而，尽管这种整合形式并非病毒复制所必需，已观察到HBV DNA片段整合入宿主基因组的现象。目前，HBV DNA整合发生的具体目的、时机及机制尚不明确，但近期数据显示，这种整合在感染后极早期即可发生。本文中 体外 详细描述了HBV DNA整合的生成与检测方法。本方案可特异性扩增病毒-细胞DNA整合的单拷贝，实现对连接序列的绝对定量和单碱基对分辨率分析。该技术已应用于多种HBV易感细胞类型（包括原代人肝细胞）、多种HBV突变体，并可联合不同药物处理条件使用。我们预计该技术将成为解析这一临床相关现象背后分子机制的关键检测手段。

反向PCR技术的示意图如下所示 图1成功的反向PCR的琼脂糖凝胶电泳示例结果如图所示 图2 PCR产物分离前后 图3 显示步骤5.1中BLAST分析结果，分别对应以下两种情况：(i) 病毒-细胞DNA连接区的扩增；(ii) 乙型肝炎病毒（HBV）DNA复制中间体的扩增。
阳性对照的预期结果：按照上述方法（图1）使用肝素纯化的HBV病毒液感染Huh7-NTCP细胞，可作为阳性对照。在此情况下，每个样本在第二次或第三次1:3稀释后应获得单一的PCR产物（相当于每次稀释约含104个细胞当量，图2）。在这些稀释度下，约50%的产物代表真实的病毒-细胞DNA连接结构，其余一半则代表HBV DNA中间体的扩增产物（图3）。
在以往的研究中13我们发现病毒-细胞连接位点重复出现的情况极少，表明HBV DNA整合并无细胞基因组上的偏好性位点。我们还发现 &gt;80%的病毒-细胞连接位点位于核苷酸1732至1832之间（依据HBV基因型D的核苷酸编号，GenBank登录号#U95551.1），其中后者代表HBV dslDNA形式的右端末端。通过本方法检测到的真实病毒-细胞连接位点序列如下 体外 实验数据已在 GenBank 公开提供（登录号 MH057851 至 MH058006）。
阴性对照的预期结果：未感染的 Huh7-NTCP 细胞或经 Myrcludex B 预处理的接种 Huh7-NTCP 细胞均可作为阴性对照。对这些细胞中提取的 DNA 进行 InvPCR 分析时，不应产生任何 PCR 产物。将这些阴性对照样本与阳性样本在同一块 PCR 板上运行，可用于检测巢式 PCR 过程中的交叉污染。检测交叉污染最严格的方法是在 96 孔板上将阴性对照样本置于 A-D 行，阳性样本置于 E-H 行。在此情况下，阳性样本最高浓度的稀释液应与阴性样本最低浓度的稀释液相邻排布。若在阴性对照样本中观察到扩增产物，应采取讨论部分建议的措施以最大限度减少交叉污染事件。
<img alt="使用NcoI和BsiHKAI酶进行DNA线性化与消化的示意图，以及T4连接酶作用" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：检测HBV DNA整合的反向PCR（invPCR）流程示意图。 HBV感染后，仅有少数Huh7-NTCP细胞中含有HBV双链线性DNA（红色）整合至宿主细胞基因组（红色），如上部所示。随后从细胞中提取总DNA（步骤1），进行反向连接（步骤2），并通过巢式PCR扩增（步骤3）。图中显示了在切除的病毒-细胞DNA连接区域中限制性内切酶位点（NcoI 和 BsiHKAI）的相对位置。本图改编自先前发表的研究13。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="琼脂糖凝胶电泳结果、DNA条带分离过程、稀释系列比较、实验分析" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：成功进行反向PCR（invPCR）后的琼脂糖凝胶电泳及后续凝胶回收。 “M”代表DNA分子量标记物。每行12个孔表示PCR板上单一稀释度的技术重复。每块PCR板/琼脂糖凝胶可同时运行两个反向DNA样本。各稀释度的PCR产物应以约1:3的比例逐级稀释。通常只需从两个最低浓度稀释度中提取产物，其中单一条带易于分离，因为乙型肝炎病毒（HBV）DNA整合率由终点稀释法确定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="序列比对图；病毒-细胞连接区和病毒-病毒连接产物；生物信息学分析结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58202/58202fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：invPCR 产物序列的 BLAST 分析。 由于 Sanger 测序可产生较长的序列片段，因此 DNA 序列的来源通常明确无误。在上图面板中，由 Sanger 测序生成的 FASTA 序列文件在不同区域均显示出与 HBV 及宿主细胞基因组的强比对信号，提示存在真实的病毒-细胞 DNA 连接区。在下图面板中，序列仅与 HBV 基因组的片段比对，提示该产物来源于重排的 HBV DNA 基因组的扩增。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58202/58202fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

我们在此描述 体外 通过乙型肝炎病毒感染系统生成乙型肝炎病毒DNA，并利用反向巢式PCR对其（1–2拷贝）整合进行高灵敏度检测。

低拷贝数整合病毒DNA的检测方法 体外 乙型肝炎感染

乙型肝炎病毒（HBV）是一种常见的经血液传播的病原体，可因慢性感染导致肝癌和肝硬化。该病毒通常……

该方法可用于解答乙型肝炎病毒学中的关键问题，例如寻找影响HPV DNA整合的细胞或病毒学因素。该技术具有多项优势：成本相对较低，操作简便，结果分析简单，且灵敏度非常高，可检测至单拷贝水平。尽管该方法可用于研究乙型肝炎病毒（HBV）的整合，也可用于其他整合至宿主细胞基因组的病毒，例如人类免疫缺陷病毒（HIV）、人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-1）或人乳头瘤病毒（HPV）。进行细胞感染时，将每毫升200,000个细胞接种于12孔板中，每孔加入1毫升D-MEM培养基。次日，使用肝素柱纯化的HEP-AD38上清液作为接种物，在500微升培养基中以每细胞1,000个病毒基因组当量（VGE）的感染复数感染细胞。然后，在37摄氏度条件下培养细胞。次日，用一毫升无菌的1倍PBS洗涤细胞两次。此后每2天更换一次培养基，直至收获细胞。感染后第3天，用5 µM替诺福韦地索普西和10 µM拉米夫定处理细胞，以限制可通过反向PCR扩增的HBV复制中间体的产生。感染后第5天，用200 µL胰蛋白酶-EDTA消化部分细胞，并将其重悬于2 mL含有5 µM替诺福韦地索普西和10 µM拉米夫定的D-MEM培养基中。随后将细胞悬液转移至6孔板中，以诱导细胞完成一轮有丝分裂。感染后第7天，用400微升胰蛋白酶-EDTA溶液消化扩增的细胞，并将细胞悬浮于1毫升D-MEM培养基中。随后，将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中。在500 × g条件下离心5分钟，沉淀细胞。通过抽吸去除上清液。使用DNA提取试剂盒，按照制造商说明书从细胞沉淀中提取DNA。进行DNA反转时，将1.5至2.5微克总DNA提取物加入到一个200微升的PCR管中。接下来，加入适量的限制性内切酶预混液，使反应体系总体积为 40 微升，其中包含 1 倍消化反应缓冲液和 10 单位 NCO-1HF。将限制性内切酶反应置于 PCR 仪中，在 37 摄氏度孵育 1 小时，以获得最佳消化效率。随后，于 80 摄氏度孵育 20 分钟，以灭活限制性内切酶。将整个限制性内切酶反应体系转移至一个1.5毫升离心管中。随后加入400微升1倍浓度的T4 DNA连接酶缓冲液和500单位的T4 DNA连接酶，并充分混匀。较大的反应体积有利于消化后的DNA片段发生分子内连接。将连接反应在室温下孵育2小时，以确保连接完全。2小时后，在70摄氏度下灭活T4 DNA连接酶20分钟。随后，加入10 µL的10%十二烷基硫酸钠，以确保T4连接酶完全失活。加入氯化钠至终浓度为 100 毫摩尔，加入葡聚糖至终浓度为 90 微克/毫升。短暂涡旋振荡混匀，并短暂离心收集反应液。接着，加入 900 微升 100% 乙醇，颠倒混匀。在负20摄氏度下过夜沉淀DNA。然后在14000 × g条件下离心15分钟，收集沉淀的DNA。随后，通过抽吸去除上清液。用500微升70%乙醇洗涤沉淀。在14000 × g条件下离心15分钟。然后，通过抽吸去除乙醇，并在室温下将DNA沉淀晾干20分钟。将沉淀溶解于20微升水中，并加入20微升限制性酶主混合液，使反应总体积为40微升，其中包含1倍消化反应缓冲液、5单位BSIHk-1和5单位SPH-1HF。随后，将限制性酶反应置于37摄氏度的加热块中孵育1小时。短暂离心反应混合物后，再将限制性酶反应置于65摄氏度的加热块中孵育1小时。在此步骤中，使用DNA降解溶液去除可重复使用的硅胶垫密封圈上可能存在的扩增子。用无DNA的水彻底冲洗垫圈，并在室温下晾干。接着，配制1毫升1倍浓度的PCR反应混合液，其中包含浓度为0.5微摩尔的外侧正向引物和反向引物。在96孔PCR板的A-1和E-1孔中加入170 µL的1倍PCR混合液。然后，在B-1和H-1孔中加入120 µL的1倍PCR混合液。随后，在A-1和E-1孔中加入10 µL的反转录DNA。使用设置为 100 微升的 P-1000 移液器，轻轻吹打每个孔中的反应液，每个孔约 10 次，以混匀各孔中的反应。将 A-1 至 D-1 孔中的样品进行连续三倍稀释，每步转移 60 微升，稀释比例为 1:3。每步操作后，使用设置为 100 微升的 P-1000 移液器轻轻吹打各孔，每个孔约 10 次，以混匀孔内液体。避免产生气泡，对 E-1 孔重复上述操作，依次稀释至 H-1 孔。随后，使用多通道移液器将 A-1 和 H-1 孔中的反应混合物各 10 µL 分别转移至 A-2、H-2、A-3、H-3 等孔中，依此类推，直至 96 孔板的 A-12 和 H-12 孔。用干燥硅胶垫覆盖 PCR 板，并用力按压密封。然后，将反应板放入PCR仪中，运行指定程序，之后将反应板转移至室温。随后，用本生灯将96针复制器的针加热至红热，再于室温下冷却至少5分钟。向第二个PCR板的各孔中加入10 µL 1倍PCR混合液，其中包含可直接上样电泳的缓冲液，以及浓度为0.5 µmol/L的内侧正向引物和反向引物。小心地从第一轮 PCR 的 96 孔板上取下硅胶垫，避免各孔之间发生交叉污染。使用已冷却的复制器，将第一轮 PCR 的 96 孔板中的 PCR 产物转移至新准备的 96 孔板中。按照指定条件进行巢式 PCR。为了分离PCR产物，使用96孔板和1.3琼脂糖凝胶进行凝胶电泳分析。对于100毫升琼脂糖凝胶，以200伏电压电泳10至15分钟。随后，使用一次性饮用吸管从琼脂糖凝胶中切下DNA条带。对于每个PCR产物，将吸管和琼脂糖凝胶块放入一个1.5毫升离心管中，用剪刀将吸管剪至合适长度。随后，通过挤压吸管片段的一端，将琼脂糖凝胶块挤入各离心管中。然后向每根离心管中加入300 µL凝胶回收缓冲液和5 µL凝胶回收玻璃珠。按照凝胶回收试剂盒的生产商说明书提取PCR产物，并用30微升水将磁珠中的DNA洗脱并稀释。将纯化后的DNA用于Sanger测序，测序引物为第二轮巢式PCR中使用的正向引物。此处展示的是成功进行反向PCR的琼脂糖凝胶电泳结果，分别显示PCR产物分离前后的电泳图谱。M 代表 DNA 标记，每行的 12 个孔代表 PCR 板上单一稀释度的技术重复。在此情况下，每个样本经过第二次或第三次 1:3 稀释后，应获得单一的 PCR 产物。在这些稀释度下，约 50% 的产物将代表真实的病毒-细胞 DNA 连接。而另一半则代表HBV DNA中间体的扩增。该技术使研究人员能够在高度可控的体外感染系统中探索HPV DNA的整合。其他方法，如生物信息学分析，可用于回答进一步的问题。例如，当 HPV DNA 整合到细胞基因组的特定区域时。请注意，操作乙型肝炎病毒时可能存在危险，因此在进行这些操作时，必须采取适当的感染防控措施，例如使用生物安全柜以及提前接种疫苗。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

乙型肝炎体外感染形成的低拷贝数综合病毒 dna 的检测

来源：Ren, S., et al. 丙型肝炎病毒复制分析方案. J. Vis. Exp.

检测感染细胞中丙型肝炎病毒复制复合体的免疫荧光实验

本视频演示了一种 体外 检测乙型肝炎病毒（HBV）感染的技术 通过...

一种用于检测病毒感染的体外重组病毒报告系统

丙型肝炎病毒（HCV）是一种导致肝脏疾病（包括肝硬化和肝癌）的重要人类病原体。HCV感染性细胞培养系统对于理解HCV复制的分子机制以及开发新的治疗方法至关重要。本文中，我们描述了一种用于研究HCV复制周期各个阶段的实验方案。...

丙型肝炎病毒复制分析方案

在此，我们介绍一种新开发的乙型肝炎病毒（HBV）报告系统，用于监测HBV生命周期的早期阶段。该系统经过简化 体外...

开发乙型肝炎病毒报告系统以监测复制周期的早期阶段

本文介绍了一种通过过继性细胞转移（ACT）将干细胞来源的病毒抗原（Ag）特异性T淋巴细胞移植到小鼠体内，从而有效抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的实验方案。该方法可进一步优化，用于HBV感染的潜在ACT免疫治疗研究。...

干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

本文描述了一种在新型基因工程293T细胞（293T-NE-3NRs，表达人源NTCP、HNF4α、RXRα和PPARα）以及传统肝细胞（HepG2-NE，表达人源NTCP）中进行乙型肝炎病毒（HBV）感染的详细实验方案。...

在非肝源性293T-NE-3NRs细胞中建立乙型肝炎病毒感染模型

我们介绍了一种利用等温滴定量热法检测靶向乙肝病毒（HBV）进入宿主细胞前后生命周期阶段的抗病毒化合物的方案，该方法通过测定化合物与宿主钠-牛磺胆酸共转运多肽结合亲和力（KD）来评估其作用。抗病毒效果则通过检测病毒生命周期标志物（共价闭合环状DNA形成、转录及病毒组装）的抑制情况来确定。...

一种通过钠-牛磺胆酸共转运多肽研究乙型肝炎病毒进入的高效肝细胞模型作为治疗靶点

基于实时聚合酶链式反应（PCR）的乙型肝炎病毒（HBV）DNA检测与定量是一种用于诊断和监测HBV感染的高灵敏度、高准确性方法。本文介绍了一种用于检测HBV...

基于实时聚合酶链式反应的乙型肝炎病毒DNA检测与定量

目前尚无针对戊型肝炎病毒（HEV）的标准病毒中和检测方法，HEV 是一种非致细胞病变的正链 RNA 病毒。本文介绍一种基于荧光标记病毒衣壳蛋白定量的荧光减少中和试验（FRNT），用于评估抗 HEV...

戊型肝炎病毒荧光减量中和试验用于测定中和抗体滴度

我们描述了从感染细胞中分离高纯度疱疹病毒核衣壳DNA的方法。从溶液中最终捕获的DNA具有高浓度和高纯度，非常适合用于高通量测序、高保真PCR反应以及转染以产生新的病毒重组体。...

从核衣壳中制备病毒DNA

学习使用体外感染和反向PCR技术检测乙型肝炎病毒DNA整合的方法。该技术可单拷贝分辨率精确定位病毒-宿主DNA连接位点，适用于HBV及其他整合病毒的研究。

低拷贝数整合病毒DNA的检测方法体外乙型肝炎感染

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