乙型肝炎体外感染形成的低拷贝数综合病毒 dna 的检测

此方法可用于回答乙型肝炎病毒学中的关键问题，例如发现影响HPVDNA整合的细胞或病毒学因素。这种技术有多种优点。它相对便宜，而且易于执行，分析结果很简单，而且非常敏感，归结为单份。

虽然此方法可用于提供对 HBV 集成的见解，但也可用于集成到宿主细胞基因组的其他病毒，如 HIV、HTLV-1 或 HPV。为了感染这些细胞，每毫升在12个井盘中播种20万个细胞，用1毫升D-mem。第二天，使用 HEP-AD 38 中的 Heparin 柱纯化 su-na-din 作为 inoculant，以每细胞 1，000 VGE 的速度感染细胞，在 500 微升培养基中感染细胞。

然后，在37摄氏度下培养细胞。然后，第二天，用一毫升无菌PBS清洗细胞两次。然后，每2天更换一次培养，直到收获。

在感染后的第3天，用5微摩尔特诺福韦异体和10微摩尔拉米夫定治疗细胞，以限制通过反向PCR放大的HBV复制中间体的生产。在第5天，感染后，用200微升的三丁辛EDTA对一些细胞进行三试，并在含有5微摩尔特诺福韦去洛西和10微摩尔拉米夫丁的2毫升D-mem中重新悬浮。随后，将细胞悬浮液转移到六井板，诱导一轮线粒体。

在感染后的第7天，在400微升的尝试性细胞的尝试，并在1毫微的D-mem中悬浮混合物。然后，在1.5毫升管中转移悬浮液。在500倍G下离心，使细胞分裂5分钟。

并删除苏每纳丁的愿望。根据制造商的指示，使用DNA提取试剂盒从细胞颗粒中提取DNA。对于DNA反转，将总DNA提取物的1.5至2.5微克分配到200微升PCR管中。

接下来，加入适当数量的限制性酶主混合，产生40微升的反应量，含有1倍的消化反应缓冲液和10个单位NCO-1HF。在37摄氏度的PCR机中孵育限制性酶反应一小时，以获得最佳的消化效率。然后，通过孵育80摄氏度20分钟，使限制酶灭活。

将整个限制性酶反应转移到1.5毫升管中。随后，加入400微升1倍T4 DNA连体缓冲液和500单位T4DNA连体，并彻底混合。大反应量鼓励消化的DNA片段的分子内结扎。

在室温下孵育结扎反应2小时，确保完全结扎。2小时后，在70摄氏度下灭活T4 DNA连结酶20分钟。然后，加入10微升的10钠硫酸钠，以确保T4利塞完全灭活。

将氯化钠加入到100毫摩尔的最终浓度中，将脱氧二氧化碳加入每毫升90微克的最终浓度。通过脉冲涡旋混合，并短暂地旋转反应混合。接下来，加入900微升100乙醇，通过反转混合。

一夜之间将DNA沉淀在负20摄氏度。在14000次G下离心，在15分钟内对沉淀的DNA进行颗粒化。之后，通过渴望去除苏/纳-用餐。

用 500 微升 70 乙醇清洗颗粒。并在 14000 次 G 下离心 15 分钟。然后，通过吸气去除乙醇，并在室温下风干DNA颗粒20分钟。

将颗粒溶解在20微升水中，加入20微升的限制性酶主混合，产生40微升反应量，含有1倍消化反应缓冲液、5个单位BSIHK-1和5个单位的SPH-1HF。巢，孵育限制酶反应在37摄氏度的热块，1小时。简要地旋转反应混合物，在65摄氏度的热块中孵育限制性酶反应1小时。

在此过程中，使用 DNA 降解溶液从可重复使用的硅垫密封件中去除潜在的安普利森。用脱氧核糖核酸水彻底冲洗垫子，并在室温下风干。接下来，准备一毫器的1倍PCR混合包含外向和反向底向在浓度为0.5微摩尔。

如果 1 倍 PCR 混合到 96 孔 PCR 板中的 A-1 和 E-1 井中，则添加 170 微升。然后，在B-1和H-1井中加入1倍PCR混合的120微升。之后，在 A-1 和 E-1 井中加入 10 微升的倒置 DNA。

使用 P-1000 设置为 100 微升，通过轻轻移液每个井中的反应混合约 10 次。通过在每个步骤中转移 60 微升，以 1:3 的比例连续稀释从 A-1 到 D-1 的样品。使用 P-1000 设置为 100 微升，轻轻移液 10 次，将孔在每一步混合。

避免形成气泡，重复井 E-1 的过程，稀释到井 H-1。随后，使用多通道移液器将10微升反应混合物从井中的 A-1、H-1 放入井中，进入 A-2、H2、A-3、H-3 等油井，直到到达 96 孔板的 A-12、H-12 井。用干硅垫盖住 PCR 板，然后用力按压。

然后，将板放在 PCR 机器中，然后运行指示的程序，然后再将板传输到室温。之后，使用 Bunsen 燃烧器将 96 针复制器的引脚加热至红热，然后在室温下冷却至少 5 分钟。用 10 微升 1 倍 PCR 混合的孔填充第二个 PCR 板的孔，包含凝胶负载就绪缓冲液，内向和反向为 0.5 微摩尔。

小心地将硅垫从第一轮 PCR 的 96 孔板的 PCR 板上拆下，避免井间交叉污染。使用冷却的复制器将 96 井板的 PCR 产品从第一轮 PCR 传输到新分配的 96 井板。执行嵌套的 PCR，使用指示的条件。

要分离 PCR 产品，请使用 96 井板和 1.3 Agarose 凝胶，通过凝胶电泳分析它们。对于 100 毫升的阿加罗斯凝胶，以 200 伏特运行 10 到 15 分钟。之后，使用一次性吸管从阿加罗斯凝胶中切除DNA带。

对于每个 PCR 产品，将吸管和 Agarose 凝胶塞插入 1.5 毫升管中，用剪刀修剪吸管大小。之后，通过挤压稻草碎片的末端，将阿加罗斯插头弹出到每个管中。然后在每个管中加入300微升凝胶提取缓冲液和5微升凝胶提取玻璃珠。

根据制造商对凝胶提取套件的说明提取 PCR 产品，用 30 微升水稀释珠子中的 DNA。提交桑格测序的纯化DNA，使用第二轮嵌套PCR中使用的前底。此处显示了一个成功反向 PCR 的 Agarose 凝胶电泳示例，该示例在 PCR 产品隔离之前和之后。

M 代表后者的 DNA 标记，每行 12 表示 PCR 板上单个稀释时的技术复制。在这种情况下，单个 PCR 产品应通过每个样品的第二次或第三次 1:3 稀释实现。在这些稀释时，大约50%的产品将代表真正的病毒细胞DNA结。

而另一半代表HBVDNA中间体的放大。这项技术使研究人员能够探索HPVDNA在高度控制的体外感染系统中的整合。其他方法，如生物学分析，可用于回答进一步的问题。

例如，如果HPV DNA整合发生在细胞基因组的特定区域。不要忘记，在执行这些程序时，应始终使用感染乙型肝炎病毒（可能具有危险和适当的感染控制，如生物安全柜和事先接种疫苗）。