Name: 麻醉大鼠中枢神经系统操作对肾交感神经活动的急性变化量化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: 了解麻醉大鼠肾交感神经活动记录方法，用于研究中枢神经系统对肾脏交感神经输出的调控机制。该技术结合股动脉插管和立体定位手术，可同步测量平均动脉压并进行药理学或光遗传学操作。

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本研究由国家护理研究所（K99/R00NR014369）资助。

所有所述方法均经伊利诺伊大学芝加哥分校机构动物护理委员会批准。
1. 制备双极RSNA电极
<ol>
	<li>制作电极时，截取两段不锈钢丝，每段长约 18 mm。另截取一段长约 15 mm 的聚乙烯（PE-50）套管。将两根金属丝穿入套管中，使金属丝两端均露出套管。</li>
	<li>剥除金属丝末端的绝缘层，修剪后保留 2–3 mm 的裸露金属丝。在一端，将公端插针压接在裸露的金属丝上。将插针与金属丝牢固焊接，固定于连接器条中，并用环氧树脂覆盖连接处。 
	注：为避免焊接，也可采用快速连接/拆卸的鳄鱼夹作为替代方案。</li>
	<li>在电极的另一端，剥除金属丝末端的绝缘层，保留 2–3 mm 的裸露金属丝。将该段金属丝弯曲，形成裸露部分的小型 &#34;V&#34; 形钩状结构。 
	注：此部分电极将与肾交感神经接触。必须对这一端进行密封，防止液体进入套管。可有效使用硅胶或环氧树脂进行密封。</li>
</ol>
2. 给予麻醉并准备手术区域
<ol>
	<li>对一只雄性Sprague Dawley大鼠（年龄9-11周，体重150-400 g）实施麻醉。通过腹腔（IP）注射给予戊巴比妥钠50 mg/kg。手术期间为评估麻醉深度是否稳定，每15分钟检查一次足趾夹捏反射，并根据需要追加麻醉剂量。 
	注：在先前的研究中，戊巴比妥钠（Nembutal）被用于实现持续稳定的麻醉状态，且不会干扰肾交感神经活动（RSNA）的调节4,5,6。本方案适用于非存活性手术，因此无需术后恢复或术后监测阶段。</li>
	<li>根据机构动物护理指南准备手术区域（即：剃除大鼠腹部、背部和头部的毛发；用10%聚维酮碘溶液清洁皮肤；涂抹眼用润滑剂；并将大鼠置于加热垫上）。实验期间维持体温在37 °C。</li>
</ol>
3. 股静脉插管（用于静脉通路）
<ol>
	<li>将肝素加入0.9%无菌生理盐水中（使其终浓度为20单位/毫升）。用22G针头吸取肝素化盐水至1毫升注射器中。将15厘米长的PE-50导管连接至针头，并用该溶液充满导管。</li>
	<li>将大鼠仰卧固定，在腹股沟区域做一长约2厘米的横向切口。使用棉签轻轻分离结缔组织，暴露股静脉和股动脉。为保持切口开放，可使用丝线固定的单钩弹性手术牵开器，或使用小型止血钳。</li>
	<li>使用止血钳将22G针头尖端弯成90°角，作为导管引入器10。</li>
	<li>在显微镜下观察血管。用弯头镊子轻轻分离静脉和动脉。在静脉下方（远端和近端各一）放置两根长12厘米的5-0丝线缝合线；以相同方式在动脉下方放置缝合线。
	<ol>
		<li>结扎远端（下方）缝线以阻断静脉血流；使用丝线胶带或小型止血钳将该缝线边缘固定于手术区域。轻柔地拉紧静脉，但力度不宜过大以免撕裂血管。将静脉调整至与术者惯用手垂直的方向。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将近端缝线打一个松散的单结暂时阻断静脉。用精细止血镊轻轻夹住该缝线以阻断血流。非惯用手持带有弯曲尖端的22G针头，惯用手用镊子夹持导管。</li>
	<li>用导管引入器（步骤3.3）在静脉上穿刺一个小孔，将预先充满肝素化盐水的PE-50导管插入血管；利用弯曲的针头保持血管开口开放，并辅助将导管尖端准确置入血管内10。
	<ol>
		<li>松开近端缝线，缓慢注入0.2毫升肝素化盐水冲洗静脉；推进导管。检查静脉回血情况以确认导管位置正确。完成近端缝线的结扎，并结扎远端缝线，将导管牢固固定于静脉内。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在实验过程中利用静脉通路给予补充麻醉药或其他药物，并用于采血。若需频繁进行静脉输液和采血，可使用三通连接器。每15分钟检查一次足趾夹捏痛反应，以调整麻醉深度。</li>
</ol>
4. 为平均动脉压监测进行股动脉插管
<ol>
	<li>在显微镜下观察动脉。与静脉插管方法类似，结扎远端缝线（步骤 3.4）以阻断动脉；用丝线胶带将该缝线边缘固定于手术区域，并使动脉方向垂直于术者惯用手。</li>
	<li>使用压力传感器/输注系统进行动脉通路
	<ol>
		<li>将压力传感器/管路连接至500 mL 0.9%生理盐水袋。用生理盐水冲洗管路，彻底排除所有气泡，并将盐水袋置于加压袋内以对系统加压。</li>
		<li>如步骤 3.1 所述，用22G针头吸取肝素化生理盐水填充1 mL注射器，并将15 cm PE-50管连接至针头（用肝素化生理盐水冲洗管路）。</li>
		<li>在近端缝线上打一个松散的半结，短暂阻断动脉。非惯用手持导管引入器（步骤 3.3）；惯用手使用血管插管镊夹持PE-50管的远端尖端。用弯曲的22G针头在动脉上穿刺一个小孔，并将导管插入血管内。</li>
		<li>松开近端缝线，缓慢向动脉内推注0.2 mL肝素化生理盐水，并尽可能深入地推进导管。检查是否有动脉血回流，以确认导管位置正确。完成近端缝线的结扎，并结合远端缝线结扎，将管路固定于动脉内。将动脉导管连接至压力传感器/管路。 
		注意：可将管路的远端部分用胶带固定于大鼠后肢，以稳定动脉通路。Jespersen et al.11 描述了一种替代的血管插管方法；该方案使用牵开器扩大切口，以组织胶水而非缝线固定管路，且不使用弯曲针头作为导引。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用遥测系统进行动脉通路
	<ol>
		<li>在动脉插管前，于高倍放大镜下检查压力感应导管。确保导管内无气泡或碎屑，且液体填充（近端）与凝胶填充（远端）部分之间存在完整液面。每次植入前，需重新填充导管远端尖端的凝胶。使用磁铁开启发射器；在手术过程中监测血压，以确保导管位置准确。</li>
		<li>在近端缝线上打一个松散的单结半结，短暂阻断股动脉。非惯用手持导管引入器（步骤 3.3）。使用血管插管镊夹持遥测装置导管的尖端，避免凝胶从尖端移位。</li>
		<li>用弯曲的22G针头在动脉上穿刺一个小孔，并使用血管插管镊将导管插入动脉，操作过程中避免导致尖端凝胶移位。尽可能深入地推进导管。利用近端和远端缝线结扎，固定压力导管。</li>
		<li>将遥测植入装置主体置于切口附近的侧腹部，并使用带切割针的4-0尼龙缝线关闭切口。在记录期结束后，使用磁铁关闭遥测设备，以延长电池寿命。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 将大鼠置于立体定位手术框中以暴露脑部
<ol>
	<li>将大鼠轻柔地置于立体定位手术架上，使其呈俯卧位。</li>
	<li>将大鼠置于耳杆之间，并调节门齿杆，使后囟（lambda）与前囟（bregma）处于同一高度。定位可能因大鼠品系、体重及中枢神经系统靶点的位置而异。</li>
	<li>使用手术刀沿头皮正中线做一条长约2 cm的头尾向切口。用棉签彻底清除颅骨表面的结缔组织。向颅骨滴加过氧化氢，以帮助清晰显示前囟、后囟及正中缝。</li>
	<li>参考大鼠脑图谱进行靶点定位12，在颅骨上钻出适合电极插入的骨孔开窗。</li>
</ol>
6. 分离肾交感神经
<ol>
	<li>将导线式肾交感神经活性（RSNA）电极（步骤1.1-1.3）连接至10倍前置放大器和微电极放大器。</li>
	<li>在将大鼠固定于立体定位仪之前或之后，通过腹膜后切口暴露肾神经。当大鼠已固定于立体定位仪中后，放置RSNA电极。使用手术刀从肋缘下方4-5 cm处开始，沿尾侧方向做一皮肤切口，位置略偏于脊柱。钝性分离切口组织，以暴露椎旁肌。</li>
	<li>使用剪刀在脂肪与肌肉交界处做一浅表的、长约1-2 cm的头尾向切口。用棉签轻轻推开覆盖在肌肉上的脂肪组织，以暴露肾脏。注意切勿进入腹膜腔。</li>
	<li>使用牵开器轻柔地将肾脏与椎旁肌分离，以暴露肾动脉和腹主动脉。避免过度牵拉血管，以防损伤肾神经。使用一块2&#34; × 2&#34;的生理盐水浸湿棉纱垫保护肾脏，防止损伤。</li>
	<li>在高倍放大下，于切口腔隙内辨认肾神经。神经束最易在主动脉与肾动脉形成的直角区域观察到。肾神经紧随肾动脉从主动脉走行至肾脏。</li>
	<li>选择一段将置于记录电极上的神经束。使用显微解剖镊子轻柔地将神经纤维从周围组织或血管中分离出来。</li>
	<li>将导线式RSNA电极固定于电极夹持器中（例如，固定在支撑架上的鳄鱼夹）。将电极缓慢下降至神经段水平。使用神经钩轻柔地将肾神经段提起并置于电极上，避免牵拉神经。 
	注意：神经应平置于裸露导线的两个&#34;V&#34;形钩内，且与神经走向平行。电极导线不得接触其他任何组织、血液或淋巴液。</li>
	<li>向切口内填充石蜡油，以防止暴露的肾交感神经干燥。使用接地夹，一端连接切口处皮肤，另一端连接法拉第笼。</li>
	<li>通过高通和低通滤波器（10 Hz 和 3 kHz）将信号导入放大器。增益可调节至10 K。配备音频监测器以评估RSNA的脉冲放电模式。采样频率设置为2,000–10,000 Hz4,5,6,7,8。当假设中枢神经系统干预可能引发快速或短暂的交感反应时，应采用更高的采样频率。</li>
</ol>
7. 记录数据
<ol>
	<li>通过静脉注射 1 mL 生理盐水或 10 µg/mL 去氧肾上腺素（0.1 mL）诱发压力感受性反射，以评估肾交感神经活动（RSNA）记录的质量。如图1所示，输注应引起血压（BP）升高并抑制 RSNA。平均动脉压升高 60–80 mmHg 即足以实现肾交感神经抑制4,13,14。</li>
	<li>如有必要，调整电极位置以改善信号质量。若神经未同时接触电极的两个钩状电极，或有组织、血液或淋巴液接触导线，则需重新定位。 
	注：是否需要重新定位取决于神经放电的听觉特征。
	<ol>
		<li>若 RSNA 的爆发未与心动周期同步出现，或记录中存在任何干扰，则应小心重新调整电极位置。</li>
		<li>由于呼吸运动也可能影响 RSNA 记录质量，可通过轻柔移动电极至肌肉运动在呼吸过程中不干扰电极的位置，以改善信号。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获得清晰信号后，通过回吸矿物油并在切口腔内使用硅胶覆盖神经与电极连接处，固定 RSNA 电极。在硅胶完全固化前，不得移动大鼠。</li>
	<li>在持续记录 RSNA 和平均动脉压的同时，实施中枢神经系统（CNS）干预方案。若使用微量注射仪/脉冲发生器进行脑干干预，可将该设备的逻辑信号输入 RSNA/BP 记录系统，以标记 CNS 操作的时间点。</li>
	<li>实验结束后，通过在硅胶与脊髓肌肉之间压碎记录电极近端的神经，测定噪声水平。记录至少 30 秒的该&#34;零&#34;值 RSNA 信号4,5,6。作为量化噪声的替代方法，可给予短效神经节阻断剂，如阿托品、六甲溴铵、氯甲碘铵或戊双吡铵酒石酸盐8,15,16,17。</li>
	<li>小心移除 RSNA 电极，并清除导线电极上残留的硅胶痕迹。保存电极以供重复使用。关闭遥测发射器并小心取出，注意避免损坏导管尖端。</li>
</ol>
8. 安乐死（经心灌注）
<ol>
	<li>通过注射染料或荧光染料、制造电解损伤或检测 c-fos 表达来确定中枢神经系统操作的位置。</li>
	<li>如果脑组织分析需要固定，则准备大鼠进行经心脏灌注。通过评估趾夹反射以确保大鼠仍处于深度麻醉状态。必要时追加麻醉。在通风橱内进行经心脏灌注，使用多聚甲醛固定液。 
	注意：对皮肤/眼睛有强烈刺激性。</li>
	<li>将管路插入灌注泵，并用0.9%生理盐水预冲管路。</li>
	<li>在肋缘下方通过皮肤和腹壁做一条5-6 cm的侧向切口，打开胸腔。小心地将肝脏与膈肌分离。使用弯头钝头剪刀在膈肌上做一小切口。将0.1 mL肝素直接注入左心室。</li>
	<li>将灌注针插入左心室（不锈钢灌胃针在此步骤中效果良好），可通过穿刺心脏，或使用锐利剪刀做一小切口后将灌胃针插入，使针尖透过主动脉壁可见（但不应到达主动脉弓）。使用外科夹或电凝夹固定针头位置。</li>
	<li>使用输液泵注入0.9%生理盐水（室温）。立即在右心房处做2-3 mm切口，作为生理盐水冲洗的流出通道。不要切断降主动脉。持续冲洗直至肝脏颜色由红褐色变为淡黄色，整个过程约灌注400 mL，耗时2-3分钟。</li>
	<li>停止泵送。更换灌注液为固定剂（例如，10%福尔马林或4%多聚甲醛），在2-3分钟内灌注400 mL。取出脑组织，将样本置于固定液中于4 °C过夜保存，随后转移至30%蔗糖溶液（将30 mL蔗糖溶解于100 mL 0.1 M磷酸盐缓冲液中）中至少3天，或直至脑组织沉底，以进行冷冻保护，为冷冻切片做准备18。</li>
</ol>
9. 分析数据
<ol>
	<li>对原始RSNA进行全波整流以获得绝对值。对原始噪声信号的10秒片段进行全波整流。必须排除任何受低信噪比影响的研究。在量化RSNA的研究中，研究者应用了 先验的 信噪比需超过2:1至6:1等标准17,19,20.</li>
	<li>计算非重叠片段的平均整流RSNA（µV），并减去噪声估计值（µV）。根据实验目的，研究者可选择如10 s等时间段图1）或1秒。使用生理学软件中的波形分析功能计算均值，或导出数据至电子表格，以计算选定时间段的平均值。</li>
	<li>为在不同动物间进行标准化，将各数值表示为相对于基线的百分比变化，用于后续分析。采用参数统计方法进行组间比较。</li>
</ol>

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Anne M. Fink 是 Data Sciences International 公司客户咨询委员会的成员。

测量肾交感神经活性（RSNA）的关键步骤包括：（1）在分离肾脏与脊旁肌以及将神经段放置于记录电极上时，避免牵拉肾动脉和神经；（2）仔细地从周围组织或血管中分离出肾神经纤维；（3）确保电极导线无组织、血液或淋巴液附着；（4）通过在肾神经上涂抹石蜡油并在神经-电极组件上覆盖硅胶，防止神经干燥。若需排除故障，需确保记录系统充分接地。为获得清晰的RSNA信号，在用硅胶包埋前，可在观察和监听原始RSNA信号的同时，小心调整电极的位置。手术成功完成后，可获得稳定的RSNA信号，该信号在持续数小时的实验中可受中枢神经系统（CNS）干预的调控。
在解读结果时，研究人员应考虑麻醉对平均动脉压和肾交感神经活性（RSNA）的影响。本方案采用巴比妥类麻醉剂（戊巴比妥钠），其可能降低平均动脉压并改变自主神经反应21。根据实验目的，也可选用其他注射用制剂或吸入式麻醉（通过鼻罩或气管造口）22。研究人员可考虑使用乌拉坦23或α-氯醛糖...

关于自主神经系统对心血管系统调控的临床前研究发现，为高血压、心力衰竭和慢性肾病等疾病的管理策略提供了依据。交感神经系统过度活跃以及迷走神经心脏张力降低，会导致血压（BP）升高1。持续增强的肾交感神经输出会促进儿茶酚胺分泌并减少肾血流量，对心血管系统和肾系统产生有害影响2,3。为了明确导致自主神经功能障碍的神经生物学通路，在啮齿类动物中开展的研究对于揭示中枢神经系统（CNS）神经元如何调控交感神经参数至关重要。本实验方案的目的是提供在麻醉大鼠中测量肾交感神经活动（RSNA）和血压（BP）的技术细节，并概述用于量化中枢神经系统干预后急性交感神经变化的技术方法。
急性（非存活）肾交感神经活性（RSNA）测量（持续时间为分钟至小时）在科学家对麻醉大鼠进行中枢神经系统药理学、电刺激或光遗传学干预以确定特定核团功能时非常有用。利用这些方法，研究人员已对孤束核、导水管周围灰质、脚桥被盖核以及延髓头端腹外侧区等结构进行了研究，以明确调控交感神经参数的神经生物学通路4,5,6,7。该方法对于识别在慢性自主神经功能障碍模型中需进一步研究的中枢神经系统靶点具有重要意义8,9。完成此类实验需要配备电烙铁、手术显微镜、立体定位仪、微电极放大器和音频监测器。根据实验室中可能产生电噪声的因素，手术/记录区域可能需要使用法拉第笼或接地带来降低RSNA记录中的电噪声。若脑组织分析需要固定处理，则还需配备灌流泵和通风橱。数据可通过多种生理学软件/数据采集系统（模拟-数字转换器）进行数字化和记录4,5，这些系统在分析选项及与遥测信号整合的兼容性方面各有不同。

<table><tbody><tr><td>不锈钢丝</td><td>A-M Systems; Sequim, WA</td><td>791000</td><td>RSNA电极</td></tr><tr><td>聚乙烯（PE-50）管</td><td>VWR; Radnor, PA</td><td>63019-048</td><td>RSNA电极；血管插管</td></tr><tr><td>微型针式连接器</td><td>A-M Systems; Sequim, WA</td><td>520200</td><td>RSNA电极</td></tr><tr><td>压接工具</td><td>Daniels Manufacturing Corp.; Orlando, FL</td><td>M22520</td><td>RSNA电极</td></tr><tr><td>连接条</td><td>Amphenol; Clinton Township, MI</td><td>221-2653</td><td>RSNA电极</td></tr><tr><td>J-B Kwik环氧树脂</td><td>J-B Weld, Sulphur Springs, TX</td><td>8270</td><td>RSNA电极</td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Permatex; Hartford, CT</td><td>2222</td><td>RSNA电极</td></tr><tr><td>肝素钠注射液（10 mL小瓶，1000 U/mL）</td><td>KV Veterinary Supply; David City, NE</td><td>P03466</td><td>静脉通路通畅性维持</td></tr><tr><td>盐酸去氧肾上腺素注射液（1 mL小瓶；10 mg/mL）</td><td>ACE Surgical Supply; Brockton, MA</td><td>950-6312</td><td>检测肾交感神经抑制作用</td></tr><tr><td>单钩弹性外科固定针</td><td>Harvard Apparatus; Holliston, MA</td><td>72-2595</td><td>切口</td></tr><tr><td>丝质外科胶带</td><td>3M, Minneapolis, MN</td><td>1538-0</td><td>固定外科固定针</td></tr><tr><td>20 G针头</td><td>Sigma-Aldrich; St. Louis, MO</td><td>Z192554-100EA</td><td>血管插管</td></tr><tr><td>Dumont #7弯镊</td><td>Fine Science Tools; Foster City, CA</td><td>11274-20</td><td>血管插管</td></tr><tr><td>5-0丝线结扎线</td><td>Braintree Scientific; Braintree, MA</td><td>SUT-S 106</td><td>血管插管</td></tr><tr><td>精细止血钳</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD</td><td>RS-7117</td><td>血管插管和RSNA手术</td></tr><tr><td>Crile止血钳</td><td>Fine Science Tools; Foster City, CA</td><td>13004-14</td><td>针头弯曲</td></tr><tr><td>遥测发射器</td><td>Data Sciences International; Minneapolis, MN</td><td>PA-10</td><td>平均动脉压监测（遥测）</td></tr><tr><td>Re-gel注射器</td><td>Data Sciences International; Minneapolis, MN</td><td>276-0038-001</td><td>遥测发射器重复使用</td></tr><tr><td>一次性压力传感器</td><td>Transpac; San Clemente, CA</td><td>MI-1224</td><td>平均动脉压监测</td></tr><tr><td>Clear-Cuff压力输注器</td><td>MILA International Inc.; Florence, KY</td><td>2281339</td><td>平均动脉压监测</td></tr><tr><td>血管插管镊</td><td>Fine Science Tools; Foster City, CA</td><td>00574-11</td><td>导管插入</td></tr><tr><td>带反向切割针的黑色单丝尼龙4-0缝线</td><td>McKesson Medical-Surgical; San Francisco, CA</td><td>S661GX</td><td>固定遥测发射器</td></tr><tr><td>遥测接收器</td><td>Data Sciences International; Minneapolis, MN</td><td>RPC-1</td><td>平均动脉压监测（遥测）</td></tr><tr><td>LabChart Pro（软件），PowerLab（数据采集硬件）</td><td>AD Instruments; Colorado Springs, CO</td><td>ML846, MX2 matrix 2.0（兼容Data Science International遥测系统）</td><td>软件/数据采集硬件的三种选择</td></tr><tr><td>SciWorks（软件），DataWave（数据采集硬件）</td><td>DataWave Technologies, Loveland, CO</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spike 2（软件），Micro1401-3</td><td>Cambridge Electronic Design Ltd., London UK</td><td>1401-3</td><td></td></tr><tr><td>微型钻</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.; Gaithersburg, MD</td><td>RS-6300</td><td>中枢神经系统手术</td></tr><tr><td>立体定位手术架</td><td>Stoelting; Wood Dale, IL</td><td>51600</td><td>中枢神经系统手术</td></tr><tr><td>带10倍前置放大器的微电极放大器</td><td>A-M Systems; Sequim, WA</td><td>1800-2</td><td>RSNA记录</td></tr><tr><td>牵开器</td><td>Fine Science Tools; Foster City, CA</td><td>17009-07</td><td>RSNA手术</td></tr><tr><td>显微解剖镊</td><td>Fine Science Tools; Foster City, CA</td><td>11251-10</td><td>RSNA手术</td></tr><tr><td>微型钩</td><td>Fine Science Tools; Foster City, CA</td><td>10064-14</td><td>RSNA手术</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Fisher Scientific; Waltham, MA</td><td>8042-47-5</td><td>RSNA手术</td></tr><tr><td>音频监视器</td><td>A-M Systems; Sequim, WA</td><td>3300</td><td>RSNA手术</td></tr><tr><td>硅胶</td><td>Wacker, Munchen; Germany</td><td>RT601A-B</td><td>RSNA手术</td></tr><tr><td>电夹</td><td>Tyco Electronics; Schaffhausen, Switzerland</td><td>EB0283-000</td><td>接地或固定灌注针</td></tr><tr><td>Bonn剪刀，直头/锐头</td><td>Roboz Surgical Instrument Co; Gaithersburg, MD</td><td>RS-5840</td><td>灌注</td></tr><tr><td>灌胃针</td><td>Harvard Apparatus; Holliston, MA</td><td>75-0286</td><td>灌注</td></tr><tr><td>Masterflex灌注泵</td><td>Cole-Parmer; Vernon Hills, IL</td><td>7524-10</td><td>灌注</td></tr><tr><td>Masterflex铂固化硅胶管</td><td>Cole-Parmer; Vernon Hills, IL</td><td>96410-15</td><td>灌注</td></tr><tr><td>福尔马林（10%缓冲液；4 L）</td><td>Sigma-Aldrich; St. Louis, MO</td><td>HT501128</td><td>灌注</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich; St. Louis, MO</td><td>S0389</td><td>冷冻保护</td></tr></tbody></table>

量化麻醉大鼠中枢神经系统干预后肾交感神经活动的急性变化

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

肾交感神经活动（RSNA）和平均动脉压是心血管与自主神经研究中的重要参数；然而，目前尚缺乏指导科研人员进行这些变量测量与分析的技术资源。本方案描述了在麻醉大鼠中测量RSNA和平均动脉压的方法。该方案还包括在记录RSNA期间进入脑部以进行中枢神经系统（CNS）干预的操作步骤。RSNA记录技术可与药理学、光遗传学或电刺激等中枢神经系统干预手段联合使用。当研究者需要在非存活实验中测量短期（分钟至小时）的自主神经反应，并将其与中枢神经系统核团进行解剖学关联时，该方法尤为适用。本方法不适用于获取大鼠的慢性（存活）RSNA记录。RSNA放电、平均整流后的RSNA以及平均动脉压可通过参数统计学方法进行量化和进一步分析。本文还介绍了获得静脉通路、遥测记录平均动脉压以及脑组织固定以用于后续组织学分析的方法。

图1展示了戊巴比妥麻醉大鼠的肾交感神经活动（RSNA）和血压（BP）记录示例。通过静脉注射去氧肾上腺素以升高平均动脉压，从而诱发压力感受性反射及短暂的交感神经抑制4,6。为定量分析RSNA，将原始RSNA信号整流后按不重叠的10秒时间段进行平均，并从每个时间段中减去噪声估计值。
<img alt="显示原始信号、整流信号和噪声信号以及血压相关性分析的RSNA分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58205/58205fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：静脉注射去氧肾上腺素后肾交感神经活性（RSNA）与血压（BP）的变...

测量中枢神经系统（CNS）干预所引发的交感神经和心血管反应的方法，对于推动神经科学研究具有重要意义。本方案旨在帮助科研人员测量和量化麻醉大鼠（非存活实验）中肾交感神经活动（RSNA）的急性变化。

肾交感神经活动（RSNA）和平均动脉压是心血管与自主神经研究中的重要参数；然而，目前存在……

该方法有助于解答有关自主神经系统的关键问题，特别是关于调节肾交感神经输出的中枢神经系统机制。该技术的主要优势在于，能够测量中枢神经系统干预对肾交感神经输出的影响。在动脉插管前，需在高倍显微镜下检查压力感应导管，确认导管内无气泡和碎屑，并且液体与凝胶填充部分之间具有完整的新月形液面。每次植入前，需重新填充导管远端尖端的凝胶，并使用磁铁打开发射器。在近端缝线上打一个松散的单结，以暂时阻断股动脉。用非优势手持住导管导入器，使用血管插管镊夹住遥测装置套管的尖端，避免尖端处的凝胶移位。使用弯头22号针尖在动脉上穿刺一个小孔，并尽可能将套管插入动脉内。然后用近端和远端缝线固定压力导管。将遥测植入装置主体置于切口附近的侧腹部皮下。为了进入脑部，将大鼠轻轻置于立体定位手术架上，呈俯卧位，头部位于耳杆之间，并调节门齿杆，使后囟和前囟的高度保持一致。接着，沿头皮中线做一条长约2厘米的头尾向切口，使用棉签用力清除颅骨表面的结缔组织。在暴露的颅骨上涂抹过氧化氢，以帮助清晰观察前囟、后囟及中线缝合线。使用大鼠脑图谱指导定位，在颅骨上钻一个适合电极进入的环钻骨窗。为分离肾交感神经，将导线型肾交感神经活动（RSNA）电极连接至10倍前置放大器和微电极放大器，并从肋缘下方4至5厘米处开始，沿脊柱稍偏外侧向尾端做一手术刀切口。钝性分离以暴露椎旁肌，并在脂肪与肌肉交界处做一非常表浅的、长1至2厘米、头尾方向的切口。使用棉签将脂肪从肌肉上推开，以在不进入腹膜腔的情况下观察肾脏。使用拉钩轻轻将肾脏与椎旁肌肉分离，以暴露肾动脉和腹主动脉。使用高倍放大以在切口间隙中识别肾神经。神经束最易见于主动脉与肾动脉形成的直角区域，紧随肾动脉从主动脉至肾脏的走行。然后使用显微解剖镊子轻轻分离一段神经束，将其从周围组织中游离出来，以便放置于记录电极上。将导线式RSNA电极固定于电极夹中，并将电极下降至神经段所在水平。使用神经钩轻轻将肾神经的一段提起并置于电极上，注意不要牵拉神经。用矿物油填充切口，以保持暴露的肾交感神经湿润。将接地夹一端连接至动物，另一端连接至法拉第笼，并使用高通和低通滤波器将信号引导至放大器。然后将增益调节至10千赫兹，并连接音频监测器以评估肾交感神经放电模式。为评估肾交感神经活动（RSNA）记录的质量，可通过静脉注射100微升浓度为10微克/毫升的去氧肾上腺素，诱发压力感受性反射，升高血压并抑制肾交感神经活动，必要时调整电极位置以优化信号质量。一旦获得清晰信号，吸除石蜡油，并用硅胶固定电极位置。在此代表性实验中，通过静脉注射去氧肾上腺素以升高平均动脉压，从而诱发压力感受性反射及短暂的交感神经抑制。为量化肾交感神经活动（RSNA），将原始RSNA信号整流后，按无重叠的10秒时间段进行平均，并从每个时间段中减去噪声估计值。进行此操作时，需注意确保大鼠已充分麻醉，正确固定于立体定位仪中，并确保系统良好接地以减少电噪声。完成此操作并采集脑组织后，可应用组织学方法来鉴定控制交感神经兴奋反应的中枢神经系统核团类型。该技术可使神经科学家在麻醉大鼠中探索自主神经调节机制，为未来动物研究中理解血压和肾功能的调控提供依据。切记必须至少每15分钟评估一次麻醉深度。并根据需要提供补充麻醉。

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麻醉大鼠中枢神经系统操作对肾交感神经活动的急性变化量化

由于手术操作简便且行为学结果稳定，坐骨神经慢性压迫是神经病理性疼痛的主要动物模型之一。术后24小时内即可形成疼痛过敏状态，并可使用冯·弗赖麻醉计（机械测试）和足底镇痛仪（热测试）进行定量测量。...

坐骨神经慢性缩窄性损伤及大鼠疼痛过敏检测

本视频演示了一种研究大鼠动脉压力变化时肾交感神经（RSNs）活动的技术。首先将压力感应导管连接至股动脉，暴露肾交感神经。随后将神经提起并置于记录电极上，记录其电活动。接着注射血管收缩药物以升高血压，并监测肾交感神经活动的相应变化。...

记录大鼠动脉压力变化引起的肾交感神经活动反应

本视频演示了在血管紧张素II诱导的高血压小鼠模型中，采用苯酚破坏肾动脉交感神经功能以降低血压的操作步骤。...

肾动脉交感神经去神经术在血管紧张素II诱导的高血压小鼠模型中的应用

麻醉小鼠表现出非生理性的全身血压，由于血压与自主神经系统之间存在密切关系，这使得无法对自主神经张力进行有意义的评估。因此，本文介绍了一种在清醒小鼠中同时记录肾交感神经活动和血压并进行静脉输注的新方法。...

清醒自由活动小鼠中同时记录肾交感神经活动和血压并进行静脉输注的新方法

本研究介绍了一种简化的手术方法和技术，通过使用硅胶粘合剂分离神经-电极复合体并进行阴茎海绵体内压力测量，以实现海绵体神经刺激。...

大鼠阴茎海绵体神经刺激及海绵体内压记录

本文介绍了一种对由血管紧张素II输注诱导高血压的小鼠进行肾交感神经消融（RDN）的实验方案。该方法可重复、操作便捷，可用于研究RDN对高血压及心脏肥厚的调控机制。...

经血管内去肾交感神经术改善血管紧张素II输注诱导的高血压

我们介绍了一种在坐骨神经慢性压迫损伤模型中应用付氏皮下针刺法诱导大鼠坐骨神经痛的实验方案。...

富氏皮下针刺法对坐骨神经痛疗效的研究：慢性缩窄性损伤大鼠模型中的行为学与电生理学变化

我们介绍了一种同时记录脊髓多通道细胞外电活动和心功能，并分析与心搏同步的脊髓背角神经元的方法。该方法为研究针刺诱导胸腔内脏功能变化背后的脊髓机制提供了一个时间同步的研究框架。...

研究躯体刺激对大鼠脊髓背角心脏锁定神经元反应的编码特征

在此，我们介绍一种用于评估急性麻醉条件下外周神经中感觉轴突激活与阻滞的方法， 体内...

评估麻醉大鼠外周疼痛阻滞的电生理学方法

视神经横断是成年中枢神经系统损伤的常用模型。视网膜神经节细胞（RGCs）的轴突被完全横断（轴突切断术）后，90%的细胞在轴突切断术后14天内死亡。该模型易于进行实验操作，且具有高度可重复性。...

视神经横断：中枢神经系统中成年神经元凋亡的模型

了解麻醉大鼠肾交感神经活动记录方法，用于研究中枢神经系统对肾脏交感神经输出的调控机制。该技术结合股动脉插管和立体定位手术，可同步测量平均动脉压并进行药理学或光遗传学操作。

量化麻醉大鼠中枢神经系统干预后肾交感神经活动的急性变化

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