Name: 微穿刺2光子显微镜辅助小鼠鲍曼空间的研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: 学习双光子显微镜辅助微穿刺技术在小鼠肾脏中的应用，用于研究单个肾单位生理学和肾小球滤过率。该方法可实时测量蛋白质代谢物滤过，为肾小管功能研究提供新途径。

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美国国立糖尿病、消化及肾脏疾病研究所 K08 DK090754 致 MPH。NIGMS P41 GM103493 至 RDS本材料是MPH在波特兰退伍军人事务医疗中心利用其资源和设施开展工作所取得的成果。本内容不代表美国退伍军人事务部或美国政府的观点。

本文所述所有实验程序均经俄勒冈健康与科学大学机构动物照护与使用委员会批准 &amp;#38; 科学大学
1. 演示所用装置
<ol>
	<li>使用直立式双光子显微镜、三轴位移台控制器、头架/移液管支架以及用于头架/移液管支架的三轴控制器；这四个组件均为必需。 
	注意：许多类似的装置均可使用，只要能够独立实现对移液管和显微镜载物台的定量三轴控制，并且显微镜已配置为适用于in vivo直立成像即可。</li>
</ol>
2. 开始实验方案前所需的材料
<ol>
	<li>使用分子量为 2,000,000 Da 的异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-dextran），以生理盐水或磷酸盐缓冲液配制成 5% 溶液，用于眶后注射以标记肾血管系统。选择该分子量（MW）的原因是其可保留在血管内，不会发生滤过。</li>
	<li>机器拉制硼硅酸盐玻璃微电极：使用长锥形、闭口设置将微电极拉至尖端直径6–10 µm例如， 加热 = 610，速度 = 150，时间 = 250 毫秒，循环）在微量移液器拉制仪上拉制。将尖端修磨至 45°，并轻微火焰抛光。</li>
	<li>微移液管的量子点包被：根据参考方案，将量子点包被于微移液管尖端。12</li>
	<li>聚硅氧烷肾支撑/间隔物。使用聚硅氧烷腻子制作肾支撑/间隔物。制备一个1 x 1 cm的2 5 毫米厚的直角菱形体即，一个截断的立方体）从聚硅氧烷腻子中制备。从一条边的中间去除70%的聚硅氧烷，并从菱形中心去除约占其中心面积70%的圆形部分。让聚硅氧烷干燥24小时。参见 图1.</li>
	<li>显微注射器准备：用油预填充一段聚乙烯（PE）-50导管以及装有微移液管的微移液管架。若计划进行质谱分析，则必须使用全氟十氢萘，否则可使用矿物油。安装带有气密型Hamilton注射器的显微注射器，并用全氟十氢萘填充。该注射器将连接至PE-50导管和移液管架。</li>
	<li>将移液管放入移液管架中，通过前向灌注法填充PE-50管和移液管，然后将PE-50管的近端连接至充满油的Hamilton注射器，形成从移液管到注射器的液压系统。</li>
</ol>
3. 通过一种新型外科手术在液体成像柱下方经侧方移液管通路进入肾脏
注意：成像支撑系统和手术准备的组装如图1所示。所述操作在体重为20–25 g的C57BL/6小鼠上进行。
<ol>
	<li>称量小鼠体重。</li>
	<li>使用4%异氟烷诱导麻醉，并以空气/氧气混合气体中1.5–2.5%异氟烷维持麻醉。通过检测对疼痛刺激无反应及呼吸频率降低来确认小鼠已处于麻醉状态。</li>
	<li>对小鼠眼部进行润滑，将其侧卧固定于基板上，并用胶带固定四肢。</li>
	<li>皮下注射200 µL生理盐水，并插入直肠温度探头。手术期间使用加热灯、成像期间使用加热垫控制体温。</li>
	<li>使用脱毛膏去除小鼠左侧体表的所有毛发。</li>
	<li>定位脾脏（皮下可见），并在脾脏背侧和尾侧定位左肾。</li>
	<li>在皮肤上做0.5 cm切口，在腹膜上做较小切口，大小以足以使肾脏轻松突出为宜。</li>
	<li>轻柔施压使肾脏外露。将由聚硅氧烷制成的肾脏稳定模具置于肾脏周围，并用氰基丙烯酸酯胶水固定。对齐肾脏与垫片，使肾脏最外侧表面超出稳定器约1 mm。</li>
	<li>用胶水将头板固定至稳定模具，并将头板安装到基板的固定杆上。</li>
	<li>在聚硅氧烷支撑结构围绕肾脏形成的凹槽中加入1%琼脂糖溶液，将10 mm盖玻片覆盖其上并固定直至琼脂糖凝固。用胶水将盖玻片密封至头板，并用牙科水泥在盖玻片周围形成密封环。</li>
	<li>经眼眶后静脉注射FITC-葡聚糖（2,000,000 Da，5%溶液，100–150 µL），迅速将小鼠及固定装置转移至双光子显微镜载物台，持续维持麻醉，并确保显微镜载物台具备足够的废气收集系统。</li>
</ol>
4. 选择合适的肾小球并用移液管进入鲍曼氏腔
<ol>
	<li>定义：
	<ol>
		<li>将X定义为屏幕上的左右方向，以及面对显微镜时的左右方向</li>
		<li>从舞台控制器读取SX（第X阶段）</li>
		<li>将 PX 定义为移液器 X，位于移液器旋钮控制器上</li>
		<li>将Y定义为屏幕上的上下方向，向前指向显微镜，向后指向双光子成像系统</li>
		<li>将Z轴定义为向上指向天花板，向下指向地板，并通过物镜的Z轴位置在载物台上进行测量。</li>
		<li>将 S(O)Z 定义为物镜高度（即实际的物镜位置）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>找到肾脏表面，可通过目镜中绿色荧光蛋白（GFP）滤光片设置进行识别。由于注射了FITC-葡聚糖，血管系统将呈现明亮的绿色。
	<ol>
		<li>选择一个合适的肾小球。使用目镜确定肾脏表面后，切换至双光子显微镜（非扫描模式）并探索成像视野。适合进行微穿刺的特征包括：距盖玻片下方的垂直距离 &#62;30 µm（以防止移液管在进入过程中与盖玻片发生碰撞）以及从肾脏外侧囊膜到肾小球的横向距离 &#60;400 µm（超过此距离，移液管的偏差可能增加错失的概率）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>记录穿刺点的横向和纵向距离，穿刺点为肾包膜上正对肾小球微管侧的点。</li>
	<li>将物镜焦点抬升至水体中，保持 x 和 y 轴载物台坐标不变，抬升距离约为 1 厘米。</li>
	<li>将移液管尖端插入水柱中，并开启4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）激发光源。在x和y方向上移动移液管，使其尖端达到荧光最强的位置，即物镜的中心。若无此精确定位，难以在目镜中找到移液管。由于量子点无论激发波长如何，均在同一波长（本例中为红色）发射荧光，DAPI激发可产生集中于尖端的红色荧光，如图所示。 图2.</li>
	<li>将激发设置更改为红色荧光蛋白（RFP），在目镜中观察移液管，然后精确将其置于目镜视野中央。</li>
	<li>切换至双光子模式，在双光子成像下找到移液管，并将其精确置于图像中心。此位置为校准位置。</li>
	<li>保存移液器的图像。</li>
	<li>注册载物台和微操作器控制器的坐标。 
	注意：使用补充的 .html 文件（该文件将通过 JavaScript 代码执行计算，适用于未安装电子表格软件的系统）或电子表格软件，计算载物台与移液器坐标之间的偏移量，并计算移液器控制器的目标坐标。</li>
	<li>将移液器从x轴方向的水柱中移出，保持z轴和y轴位置不变。</li>
	<li>将移液器 Z 移动至目标肾小球 Z（即， 将移液器沿Z轴方向移至盖玻片下方</li>
	<li>将移液管 Y 移动至目标肾小球 Y 坐标。</li>
	<li>将双光子活体成像视野移至目标肾小球Z轴位置，然后移至肾脏边缘，记录SX值。</li>
	<li>根据配准偏移量 SX 计算肾脏边缘 PX。</li>
	<li>将载物台向移液管方向移动（增加 SX），使肾脏边缘位于屏幕左侧较远处，但仍保持可见。</li>
	<li>将移液管快速推进至比上述计算的肾脏边缘PX值小约100 µm的位置。</li>
	<li>定位移液器尖端，缓慢推进移液器。增加红色增益，并观察红色像素直方图（由于量子点和非靶向荧光的亮度极高，在移液器出现在窗口图像之前，像素分布即已发生偏移）。</li>
	<li>在活体双光子成像下推进至肾脏边缘。 
	注意：在进入肾包膜之前，可以在Y轴和Z轴方向上调整移液管的位置。然而，这样做可能导致移液管尖端断裂。如果移液管偏离目标位置，更为稳妥的做法是沿X轴方向回撤最多2 cm，重新调整方向后，再沿X轴方向推进至肾脏边缘。一旦移液管进入组织，除X轴以外任何方向的移动都会导致移液管弯曲，这种操作需要极为丰富的经验才能掌控，且常常导致移液管断裂。</li>
	<li>沿X轴缓慢移动移液管至目标小球部PX位置，同时密切观察SX。在插入微移液管的过程中，偶尔返回小球部检查其是否发生位移会有所帮助。</li>
	<li>当到达正确位置时，使用z轴层扫记录位置。 
	注意：微移液管就位后，可注入药物、蛋白质或荧光示踪剂，可抽吸液体用于后续分析，或测量相对于另一电极的压力或电荷。</li>
</ol>
5. 肾小囊腔液体的抽吸
<ol>
	<li>将微量泵设置为在 2 分钟内注入 100 nL 全氟十氢萘，以确保移液管通畅，并减少穿刺过程中因移液管堵塞带来的干扰。重新成像以确认移液管位置。</li>
	<li>等待 4–6 分钟以进行额外的滤过。</li>
	<li>设置微量泵以最高 50 nL/min 的速率抽吸最多 300 nL。 
	注意：在此抽吸速率下未观察到肾小球形态的变化，表明该速率不会改变抽吸过程中液体进入肾小囊腔的速率。由于本方法不使用传统微穿刺中的油滴阻断，因此为质谱分析而回收的样本体积可能包含部分注入的全氟十氢萘以及可能的肾小管液。对于离子选择性电极测定、荧光光谱、聚合酶链式反应及其他敏感检测终点，可使用较小体积。如果终点并非质谱分析，则可在储存前使用矿物油和标准微穿刺技术测量抽吸体积。</li>
	<li>再次成像。</li>
	<li>撤出移液管并保存样本，在分析前加入 TRIS 缓冲液并于 -80°C 保存。</li>
	<li>使用过量异氟烷或其他经批准的方法处死小鼠。 
	注意：滤过液通过肾小球毛细血管的滤过作用进入肾小囊腔。据报道，小鼠的单个肾单位肾小球滤过率（SNGFR）为 8–14 nL/min。3 然而，SNGFR 受Starling力调控，因此肾小囊腔内的负性静水压可能会增加 SNGFR。标准微穿刺方法使用矿物油阻断肾小管并维持中性压力以采集肾小管液，但这些化合物会干扰质谱分析（见下文）；因此，在本技术中，近端小管保持通畅。此外，在抽吸时，肾小囊腔内含有未知但为正值的滤过液体积。因此，液体抽吸速率可能超过 SNGFR。 
	注意：在本实验中，目标是获取比常规更大的肾小球滤过液样本，用于基于纳米蛋白质组学技术的质谱分析。由于质谱分析不能使用矿物油或石蜡等油滴阻断（这些为复杂的有机分子混合物，会降低质谱的信噪比），故采用全氟十氢萘填充微量移液管和注射器。全氟十氢萘不会阻断肾小管流动，且具有生物惰性，不会干扰质谱分析。</li>
</ol>

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<li>Sandoval, R. M., Kennedy, M. D., Low, P. S., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uptake+and+trafficking+of+fluorescent+conjugates+of+folic+acid+in+intact+kidney+determined+using+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Uptake and trafficking of fluorescent conjugates of folic acid in intact kidney determined using intravital two-photon microscopy.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 287 (2), C517-C526 (2004).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们介绍一种利用双光子显微镜进入小鼠非表层肾小球鲍曼囊腔的方法。该技术的开发旨在解决肾小球微穿刺技术中的一个关键局限性，即在小鼠中可通过单光子显微镜观察到的表层肾小球数量稀少，从而有助于实现从鲍曼囊腔抽吸液体以进行后续分析的实验目标。该技术的建立与实践依赖于六个关键步骤。首先，必须仔细完成新型外科手术准备，确保成像用水柱不会从盖玻片上流失，且盖玻片应覆盖住作为移液管穿刺目标的肾脏区域。第二，用于微穿刺的玻璃移液管必须在双光子显微镜下可见，这一目标通过使用量子点实现。第三，需要采用立体定位技术，以在三维空间中精确定位移液管进入鲍曼囊腔，穿刺深度可达肾表面以下100 µm。因此，精确匹配移液管与载物台坐标系统是关键步骤。第四，必须谨慎选择目标肾小球，确保其在不受到肾脏支撑结构和成像水柱阻碍的情况下仍可被移液管触及。最后，必须充分考虑获取样本后的分析步骤，液体样本的采集体积和时间应与后续分析方法及肾小球生理特性相匹配。
我们设计了一种采集流程，可扩展应用于多种分析，包括传统的微穿刺终点检测，如火焰光度法、离子选择性电极测量，或压力、体积及电荷的测定。此外，我们认为该技术也可适用于新型分析终点，包括聚合酶链式反应（可能在miRNA分析中先进行逆转录）以及质谱后续的代谢组学分析。为便于质谱分析所采用的特殊改进措施值得进一步讨论，但这些改进也带来一定局限性。首先，尽管质谱具有高度灵敏性，但微穿刺样本的蛋白质含量极低且体积微小，导致其蛋白质分析低于常规蛋白质组学检测的动态范围，因此必须采用简化的纳米蛋白质组学方法。8,13 其次，为了优化早期检测的蛋白质产量，我们确定需要吸取200–300 nL的样本，但 从头合成 若小鼠肾小球滤过率仅为8-14 nL/min，则获取该体积的滤液可能需要长达20分钟的抽吸时间3正如 Tojo 和 Endou 所证明的，长时间抽吸会改变早期近端小管液中的白蛋白含量14我们选择进行超过6分钟的抽吸；然而，这意味着我们的抽吸速率超过了滤液流入速率。建议本实验方法的使用者在设计工作流程时，充分考虑其实验系统中肾小球滤过的生理特性。质谱法是一种高灵敏度的技术，若引入矿物油等石油馏分，其信号将严重干扰检测结果。矿物油在微穿刺实验中常用于构建抽吸液压系统并隔离肾单位节段，但在此情况下无法使用，也无法用于其另一常见用途——纳升级样品体积的定量。因此，我们改用全氟十氢萘填充系统，该物质具有生物惰性，不会干扰质谱分析，且具备良好的光学特性。我们认为全氟十氢萘所带来的限制是可克服的，目前正致力于开发进一步的技术改进，预期将实现样品体积的测定以及肾小管节段的阻断。
大多数微穿刺研究都是在Munich-Wistar大鼠中进行的，这类大鼠具有较多的表层肾小球，但由于缺乏转基因小鼠这一分子生物学的基本工具，极大地限制了对肾小管转运及其他肾脏生理功能的生理学研究2,3。由于该新技术便于在小鼠中将微移液管插入肾小囊腔，因而缓解了这些关键限制。我们采用该技术旨在获取肾滤液，用于基于高灵敏度质谱的蛋白质组学研究，即纳米蛋白质组学（nanoproteomics）9。然而，该技术可能还具有其他应用前景。例如，利用双光子显微镜结合荧光示踪剂已显著推动了对滤过蛋白的肾脏生理学研究15,16,17。将微穿刺技术与双光子显微镜结合，有望实现利用荧光分子开展单个肾单位的生理学研究，并可将邻近未注射的肾单位作为对照。希望本文对必要操作步骤的清晰阐述，能够促进该技术在已具备双光子显微镜和/或微穿刺设备的实验室中广泛采用。尽管该操作较为复杂，但我们已多次成功实施，本文所介绍的技术优化已形成一个稳定的生理学研究平台。

本实验的目的是为小鼠的鲍曼氏囊腔及其他肾小球结构提供常规的微穿刺通路。以往用于肾脏生理学研究的微穿刺技术局限于单光子显微镜，该技术仅能对肾脏表面几微米深度内的结构成像，且在z轴方向上的精度有限。由于小鼠表面肾小球数量较少，通常难以通过单光子显微镜找到合适的表面肾小球，因此大多数微穿刺研究均在慕尼黑-维斯塔大鼠（Munich-Wistar rats）中进行，这类大鼠具有更多的表面肾小球。因此，在微穿刺研究中使用小鼠模型的优势一直受到限制1,2,3。近年来，成像技术取得了显著进展，包括微计算机断层扫描（micro-CT）4,5、纳米颗粒成像6以及成像质谱技术7，这些技术极大地拓展了可用于肾小球生理学研究的方法范畴；然而，目前仍无法替代微穿刺技术所独有的干预与取样能力。因此，通过本文介绍的技术扩展微穿刺在小鼠中的应用，有望推动新型肾脏生理学研究的发展，特别是对肾滤液成分（i.e.，代谢组学）以及转基因小鼠基本生理功能的研究，例如滤液压力和电荷的测量，这些此前仅在大鼠中完成过。
该技术中，双光子显微镜的使用可实现对肾包膜下约100 µm深度内的肾结构进行可视化观察，并可通过微吸管进行操作。因此，在迄今已成像的小鼠肾脏中，每个肾脏均有多个（5–10个）肾小球可供微穿刺。尽管该技术与传统肾微穿刺在某些方面具有相似性，但其设计初衷 从头合成 需要对传统技术进行大量改进。本方案中，我们演示了从肾小囊腔抽吸液体的操作，并展示了后续采用质谱法（纳米蛋白质组学）分析的示例结果。8,9,10,11质谱分析的后续应用需要专门的样品制备流程，本文也对此进行了演示。

<table><tbody><tr><td>直立式双光子显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM 7MP</td><td></td></tr><tr><td>三轴显微镜载物台控制器</td><td>Sutter</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>三轴探头控制器</td><td>Sutter</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>移液管固定器</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HL-U</td><td></td></tr><tr><td>探头</td><td>Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素标记葡聚糖，分子量 2000 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52471-1G</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃毛细管</td><td>Sutter</td><td>B150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>微量移液管拉制仪</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>量子点，发射波长 605 nm</td><td>Thermofisher</td><td>Q21701MP</td><td></td></tr><tr><td>聚硅氧烷</td><td>Sugru</td><td>无货号</td><td>www.sugru.com, &quot;original formula&quot;。任意颜色。</td></tr><tr><td>PE-50 导管</td><td>Instech Labs</td><td>BTPE-50</td><td></td></tr><tr><td>微量注射器</td><td>WPI</td><td>UMP-3</td><td></td></tr><tr><td>微量注射控制器</td><td>WPI</td><td>Micro4</td><td></td></tr><tr><td>全氟十氢化萘</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>306-94-5</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，10 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-0718</td><td></td></tr><tr><td>头固定板</td><td>定制</td><td>无部件编号</td><td>神经科学实验室中常见，多家供应商可提供</td></tr><tr><td>头部固定装置</td><td>定制</td><td>无部件编号</td><td>神经科学实验室中常见，多家供应商可提供</td></tr><tr><td>30 G 针头</td><td>Becton-Dickinson</td><td>125393</td><td>用于眶后注射</td></tr><tr><td>结核菌素注射器</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309626</td><td>用于眶后注射</td></tr></tbody></table>

利用双光子显微镜实现小鼠肾小囊腔的微穿刺

Micropuncture of Bowman's Space in Mice Facilitated by 2 Photon Microscopy

肾脏微穿刺和肾脏双光子成像技术是肾生理学中的开创性方法。然而，微穿刺技术受限于依赖传统显微镜观察肾单位的表面结构，而双光子成像研究则仅能在器官层面而非肾单位层面进行干预评估。特别是对小鼠肾小球的微穿刺研究，由于小鼠表面肾小球数量稀少而面临挑战。为克服这一限制，以便在小鼠生理模型中开展对鲍曼氏囊腔液的抽吸研究，我们开发了双光子肾小球微穿刺技术。本文介绍了一种新型手术准备方法，可在保留双光子显微镜所需垂直成像空间的同时，实现对肾脏的侧向通路。通过给予高分子量的异硫氰酸荧光素（FITC）-葡聚糖，使肾血管系统及肾小球在双光子成像中可见。随后，在立体定位引导下，将量子点包被的微移液管插入成像视野内多个可观察到的肾小球之一。本方案详细阐述了实施该操作所需的准备步骤、材料和方法。该技术促进了以往难以实现的肾脏生理学研究，包括从鲍曼氏囊腔以及成像深度范围内（约肾包膜下100 µm以内）肾单位各节段回收滤液。利用引入的微移液管，可同时测量压力、电荷和流量。本文提供了对鲍曼氏囊腔抽吸液进行液相色谱/质谱分析的代表性数据。我们预计该技术将在肾脏生理学研究中具有广泛的应用前景。

该操作需要对肾脏进行特殊的手术准备，以便进行双光子成像和通路建立，如图1所示。此处展示的准备方法可实现垂直成像路径，物镜位于肾脏上方，组织密度变化最小，从而为双光子显微镜提供尽可能最佳的光学条件，同时保留横向通路用于移液管操作，移液管仅在水平（x）方向上驱动。部分外置肾脏可防止肾蒂过度受张力，维持血管灌注，而定制的肾脏支撑装置则实现了成像与操作通路的双重目标。本操作中的第二个挑战是在三维空间中精确定位肾脏内的移液管，这需要对移液管与载物台的坐标系统进行配准。此过程的关键步骤如图2所示，图中显示在DAPI激发条件下，移液管被定位在双光子显微镜的水柱中。在移液管进入肾脏之前，先进入水柱并将移液管坐标与载物台坐标进行注册，这对于实现移液管在目标鲍曼腔内精确定位至关重要。移液管从右侧进入成像用水柱。开启DAPI激发光后，包被红色量子点的移液管在红橙色区域强烈荧光，可在物镜正下方仔细调整其位置。当激发光束穿过物镜中心时，可自由移动移液管至荧光最强点，确保其在目镜中清晰可见。
正确的移液管拉制和肾小球选择对于本方案的成功至关重要，如图3、图4、图5所示。图3A展示了在移液管注册过程中于液柱内成像的、经红色荧光量子点包被的玻璃微移液管，其为正确拉制的移液管，尖端宽度为6微米。图3B显示了一根拉制不良的移液管，其尖端为12 µm。由于其12 µm的直径和不规则的尖端表面（注意斜面顶部的毛边），该移液管在不造成血管损伤的情况下无法穿透肾包膜。图3C和3D说明了最佳定位相较于目标肾小球成像的重要性。图3C中所示的靠近表面、成像清晰的肾小球，因其位于肾包膜下20 µm的浅表位置而具有良好的成像效果，但由于距离表面过近，移液管在操作时会触碰到盖玻片，因此不适合本方案的操作。图3D展示了位置理想的肾小球。请注意用于显示两个肾小球的不同比例尺（所有比例尺均为50 µm）。由于成像深度引起的折射，这些肾小球的轮廓显得较模糊；该图像拍摄于肾包膜下70 µm处。肾脏侧缘位于右侧250 µm处，因此这两个肾小球均可被顺利接近。在接近操作过程中，成像将紧密聚焦于目标肾小球，如图4所示，并采用每秒采集一幅图像的方式，使研究人员能够精确观察移液管在肾小囊腔内的位置。
图4展示了一次典型的肾脏穿刺进入过程及结果，即移液尖端位于鲍曼氏腔内。图4A显示了z轴层扫数据的平均强度投影及其正交视图，可见移液尖端位于鲍曼氏腔内。请注意，由于量子点在尖端圆锥部分密集排列，产生极强的荧光，导致出现红色移液尖端光谱伪影（荧光的圆形光斑）。图4B为z轴层扫数据的三维投影，展示了另一个位于鲍曼氏腔内的移液尖端。请注意，在进入过程中，移液尖端拖拽了鲍曼氏囊，使其沿进入方向发生位移，从而在尖端后方形成明显的帐篷样结构，如实验方案中所述。
在图5中，展示了一次失败操作的结果：由于移液管开口过大，在穿透肾包膜时导致包膜破裂并引发出血。该移液管过于钝拙；在试图穿过肾包膜时，包膜被推挤至移液管尖端前方，最终导致破裂。在此图像中，肾包膜因包膜下出血而清晰可见，呈FITC荧光绿色。移液管内部可见FITC信号，表明在压力作用下的血液已进入移液管腔。箭头所指处显示，在FITC-葡聚糖背景中，移液管腔内存在大量作为充盈缺损的红细胞。
图6展示了从肾小囊腔抽吸液中获得的代表性质谱图，鉴定出小鼠尿液蛋白17（MUP17）。最后，表1列出了成功抽吸操作的示例结果，显示了通过纳米级质谱技术对3只小鼠每只抽吸6分钟所收集的抽吸液进行分析后鉴定出的蛋白质。在每种情况下，均在移出肾小囊腔的移液管时进行成像，且在肾小囊腔或移液管管腔内未观察到FITC荧光，表明抽吸液未被血浆污染。共鉴定出17种蛋白质，主要为低分子量蛋白，每种蛋白质至少由2个独特的肽段确认。质谱计数较低，与先前对肾小球滤液中蛋白质含量的估计一致，且检测到已知可被滤过的蛋白质，如维生素D结合蛋白（VTDB）、白蛋白（ALBU）和主要尿液蛋白17（MUP17）。
<img alt="用于医学实验的外科端口装置示意图，显示进入应用方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：通过定制支撑和固定装置实现肾脏部分外翻，以进行侧向操作。 左侧展示了成像柱和肾脏支撑装置的各个部件，中间为完整组装图。右侧显示了应用支撑装置前（上方）和应用后（下方）的肾脏准备状态。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="肾脏显微荧光；显微镜物镜、微移液管装置发出红色荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：实验方案中微移液管定位步骤完成后的肾脏样本准备。 此处使用 DAPI 激发以将微移液管置于双光子显微镜的水柱中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示红色纤维和绿色细胞结构的荧光显微镜图像，用于蛋白质定位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3：注射FITC-葡聚糖后吸管及肾脏的成像，展示适合与不适合进行微穿刺的肾小球。 A. 尖端为6 µm的拉制良好的吸管。 B. 边缘粗糙、钝化的尖端。 C. 该肾小球边界清晰，但距离盖玻片过近，不适合微穿刺。 D. 位置合适的肾小球。比例尺均为50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞结构中绿色-红色荧光的共聚焦显微镜图像，展示蛋白质定位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：成功穿刺导致移液管进入鲍曼氏腔——来自两种不同操作的视图。A. Z轴堆叠图像及其正交投影显示移液管尖端位于鲍曼氏腔内，并紧贴肾小球毛细血管簇。比例尺为50 µm。B. 由Z轴堆叠图像生成的三维体积渲染图同样显示移液管位于鲍曼氏腔内，并紧贴肾小球毛细血管簇。比例尺为100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示蛋白质定位和细胞结构分析的样品荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：由于移液管钝化，刺破肾包膜，导致血液流入移液管腔，造成操作失败。 可见渗出的血浆中带有FITC荧光，以及移液管内存在的红细胞（箭头）。箭头指向在移液管腔内可见的红细胞。比例尺为50 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="质谱结果；m/z 与相对丰度图；用于分析的分子峰鉴定。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58206/58206fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 6"> 
图 6：通过纳升液相色谱/质谱分析鲍曼氏囊腔穿刺液所得的主要尿蛋白 17（MUP17）的质谱图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/58206fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>蛋白质</td>
			<td>分子量 (kD)</td>
			<td>平均谱图计数</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTA_MOUSE</td>
			<td>42</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACTB_MOUSE</td>
			<td>42</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLPX_MOUSE</td>
			<td>69</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DHSA_MOUSE</td>
			<td>73</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FOLR2_MOUSE</td>
			<td>29</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GBLP_MOUSE</td>
			<td>35</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALBU_MOUSE</td>
			<td>66</td>
			<td>6.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBA_MOUSE</td>
			<td>15</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBB1_MOUSE</td>
			<td>16</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MIB1_MOUSE</td>
			<td>110</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MUP17_MOUSE</td>
			<td>21</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PERI_MOUSE</td>
			<td>54</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAS4_MOUSE</td>
			<td>17</td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPTB1_MOUSE</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIME_MOUSE</td>
			<td>54</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VTDB_MOUSE</td>
			<td>53</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：从小鼠鲍曼腔穿刺液中鉴定出的蛋白质列表（共3只小鼠）。
补充视频 1：在将移液管定位至肾小囊腔后采集的 z 轴层析图像进行体积渲染，显示移液管尖端位于肾小囊腔内并与毛细血管簇相贴。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58206/0128a-3dview03162018-3.avi">请点击此处下载该文件。</a>

我们介绍了利用双光子显微镜将微吸管置入小鼠肾小囊尿腔的技术，结合了肾脏生理学中的两项基础技术。相比传统显微镜，双光子显微镜克服了肾微穿刺生理学研究中的关键局限性。

肾脏微穿刺和肾脏双光子成像技术是肾生理学中的开创性方法。然而，微穿刺技术受限于对传统……的依赖

该技术有助于解答关于单个肾单位生理学的关键问题，包括系统性蛋白质和代谢物的肾小球滤过率及其对肾小管生理学的贡献。这种微穿刺技术的主要优势在于，它能够使所有小鼠的肾小囊腔和皮质肾单位均可被触及。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该方法需要正确执行各项制备步骤。在确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，将眼药膏涂抹于眼睛，并使用胶带固定20至25克成年小鼠的四肢。使用脱毛膏去除动物左侧全部毛发，通过脾脏在脾脏背侧和尾侧的皮肤表面定位左肾。在皮肤上做一个0.5厘米的切口，随后在腹膜上做一个稍小的切口，切口大小以刚好能将肾脏推出为宜。轻轻施压将肾脏推出，并在组织周围放置一个聚硅氧烷肾脏稳定模具。将肾脏与垫片对齐，使肾脏最外侧表面超出稳定器约一毫米，然后用氰基丙烯酸酯粘合剂将肾脏固定在模具上。将头部固定板粘在稳定器模具上，再将头部固定板安装到底板的安装杆上。接下来，用1%琼脂糖溶液填充聚硅氧烷支撑体中的孔，并在模具上方放置一个10毫米的盖玻片，直至琼脂糖凝固。用胶水将盖玻片密封至头板，并用牙科水泥在盖玻片周围形成一圈密封环。然后，经眼后静脉注射100至150微升FITC-葡聚糖，并迅速将小鼠和固定板转移至双光子显微镜载物台上。手动聚焦于肾脏表面后，切换至非扫描式双光子模式，探索成像视野以定位目标肾小球，该肾小球应位于盖玻片下方超过30微米、且距离肾脏侧包膜小于400微米处。记录目标肾小球的横向和垂直距离，然后记录该肾小球的x、y和z轴载物台坐标。最后，将物镜焦点向上提升约一毫米进入水柱中，同时保持载物台的 x 和 y 坐标不变。将移液器尖端插入水柱，并打开 DAPI 激发光。在 x 和 y 方向上移动移液器，使其尖端到达荧光最强的位置。这将是物镜的中心位置。将x激发设置更改为红色荧光蛋白，并通过目镜观察移液管，以便在目镜视野中精确定位中心。切换回双光子模式，在实时双光子视野下找到移液管，并将管尖精确置于图像中心，此位置即为配准位置。然后保存移液管的图像，并记录载物台和微移液管控制器的坐标。在不移动 y 轴和 z 轴的情况下，沿 x 轴将移液管从水柱中移出，将移液管 z 轴移动至目标肾小球的 z 坐标以及肾脏边缘位置。记录载物台的 x 坐标，并根据与注册时载物台 x 坐标的偏移量，计算出对应肾脏边缘的移液管 x 坐标。增加载物台的 x 值，将载物台向移液管方向移动，直到肾脏边缘位于屏幕左侧较远处，但仍保持可见。迅速将移液管推进至距离肾脏边缘约 100 微米的位置，该位置由移液管 X 刚刚计算得出。提高红色增益，并在实时双光子成像下缓慢推进移液管尖端接近肾脏边缘，同时监测红色像素直方图。缓慢沿x轴推动移液器至目标肾小球的x轴位置，同时密切关注载物台的x轴读数。到达肾小球后，使用z轴层扫记录位置。移液器就位后，设置微量泵在两分钟内注入100纳升全氟十氢萘。为确保移液管通畅，并减少移液管在进入过程中堵塞造成的干扰。在过滤四到六分钟后，将微泵设置为以每分钟最多50纳升的速率吸液，总量可达300纳升。这个位置接近表面的肾小球因位于肾包膜下20微米处，成像效果良好。然而，肾小球距离表面过近，无法进行显微注射，因为移液管会触碰到盖玻片。这些肾小球的位置最为理想，其外侧边缘位于右侧250微米处，并且由于距离包膜70微米的深度导致折射，显得不够清晰。这两个因素共同使得肾小球易于接近。在此典型的肾脏入路图像中，通过 z 轴层叠扫描获得的平均强度投影及正交视图显示移液管尖端位于鲍曼氏腔内，注意移液管尖端处出现的红色光谱伪影，这是由于量子点在尖端圆锥段排列后产生极强荧光所致。此处，移液管定位至鲍曼氏腔后采集的 z 轴层叠扫描数据生成的体渲染图像，显示移液管尖端位于该腔隙内并与毛细血管簇相贴。若使用开口过大的移液管，可能导致肾包膜破裂，引起包膜下出血，并使血液进入移液管腔内。利用该方法，已从每种蛋白质至少两个独特的肽段中鉴定出17种蛋白质，主要为低分子量蛋白质。结合该方法，还可采用质谱分析、离子敏感电极测量和荧光抗体注射等其他方法，以探讨管腔溶质在肾小管和肾小球生理学中的作用。

micropuncture-bowman-s-space-mice-facilitated-2-photon

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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经瞳孔双光子活体小鼠视网膜成像

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