利用双光子显微镜实现小鼠肾小囊腔的微穿刺

该技术有助于解答关于单个肾单位生理学的关键问题，包括系统性蛋白质和代谢物的肾小球滤过率及其对肾小管生理学的贡献。这种微穿刺技术的主要优势在于，它能够使所有小鼠的肾小囊腔和皮质肾单位均可被触及。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该方法需要正确执行各项制备步骤。

在确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，将眼药膏涂抹于眼睛，并使用胶带固定20至25克成年小鼠的四肢。使用脱毛膏去除动物左侧全部毛发，通过脾脏在脾脏背侧和尾侧的皮肤表面定位左肾。在皮肤上做一个0.5厘米的切口，随后在腹膜上做一个稍小的切口，切口大小以刚好能将肾脏推出为宜。

轻轻施压将肾脏推出，并在组织周围放置一个聚硅氧烷肾脏稳定模具。将肾脏与垫片对齐，使肾脏最外侧表面超出稳定器约一毫米，然后用氰基丙烯酸酯粘合剂将肾脏固定在模具上。将头部固定板粘在稳定器模具上，再将头部固定板安装到底板的安装杆上。

接下来，用1%琼脂糖溶液填充聚硅氧烷支撑体中的孔，并在模具上方放置一个10毫米的盖玻片，直至琼脂糖凝固。用胶水将盖玻片密封至头板，并用牙科水泥在盖玻片周围形成一圈密封环。然后，经眼后静脉注射100至150微升FITC-葡聚糖，并迅速将小鼠和固定板转移至双光子显微镜载物台上。

手动聚焦于肾脏表面后，切换至非扫描式双光子模式，探索成像视野以定位目标肾小球，该肾小球应位于盖玻片下方超过30微米、且距离肾脏侧包膜小于400微米处。记录目标肾小球的横向和垂直距离，然后记录该肾小球的x、y和z轴载物台坐标。

最后，将物镜焦点向上提升约一毫米进入水柱中，同时保持载物台的 x 和 y 坐标不变。将移液器尖端插入水柱，并打开 DAPI 激发光。在 x 和 y 方向上移动移液器，使其尖端到达荧光最强的位置。

这将是物镜的中心位置。将x激发设置更改为红色荧光蛋白，并通过目镜观察移液管，以便在目镜视野中精确定位中心。切换回双光子模式，在实时双光子视野下找到移液管，并将管尖精确置于图像中心，此位置即为配准位置。

然后保存移液管的图像，并记录载物台和微移液管控制器的坐标。在不移动 y 轴和 z 轴的情况下，沿 x 轴将移液管从水柱中移出，将移液管 z 轴移动至目标肾小球的 z 坐标以及肾脏边缘位置。记录载物台的 x 坐标，并根据与注册时载物台 x 坐标的偏移量，计算出对应肾脏边缘的移液管 x 坐标。

增加载物台的 x 值，将载物台向移液管方向移动，直到肾脏边缘位于屏幕左侧较远处，但仍保持可见。迅速将移液管推进至距离肾脏边缘约 100 微米的位置，该位置由移液管 X 刚刚计算得出。提高红色增益，并在实时双光子成像下缓慢推进移液管尖端接近肾脏边缘，同时监测红色像素直方图。

缓慢沿x轴推动移液器至目标肾小球的x轴位置，同时密切关注载物台的x轴读数。到达肾小球后，使用z轴层扫记录位置。移液器就位后，设置微量泵在两分钟内注入100纳升全氟十氢萘。

为确保移液管通畅，并减少移液管在进入过程中堵塞造成的干扰。在过滤四到六分钟后，将微泵设置为以每分钟最多50纳升的速率吸液，总量可达300纳升。这个位置接近表面的肾小球因位于肾包膜下20微米处，成像效果良好。

然而，肾小球距离表面过近，无法进行显微注射，因为移液管会触碰到盖玻片。这些肾小球的位置最为理想，其外侧边缘位于右侧250微米处，并且由于距离包膜70微米的深度导致折射，显得不够清晰。这两个因素共同使得肾小球易于接近。

在此典型的肾脏入路图像中，通过 z 轴层叠扫描获得的平均强度投影及正交视图显示移液管尖端位于鲍曼氏腔内，注意移液管尖端处出现的红色光谱伪影，这是由于量子点在尖端圆锥段排列后产生极强荧光所致。此处，移液管定位至鲍曼氏腔后采集的 z 轴层叠扫描数据生成的体渲染图像，显示移液管尖端位于该腔隙内并与毛细血管簇相贴。若使用开口过大的移液管，可能导致肾包膜破裂，引起包膜下出血，并使血液进入移液管腔内。

利用该方法，已从每种蛋白质至少两个独特的肽段中鉴定出17种蛋白质，主要为低分子量蛋白质。结合该方法，还可采用质谱分析、离子敏感电极测量和荧光抗体注射等其他方法，以探讨管腔溶质在肾小管和肾小球生理学中的作用。