Name: 胎盘硫酸软骨素 A (plCSA) 靶向脂质高分子纳米粒的合成与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 学习合成胎盘硫酸软骨素A靶向脂质高分子纳米粒的方法，用于肿瘤和胎盘滋养层细胞的靶向药物递送。该技术简单可重复，为癌症和胎盘疾病治疗提供新工具。

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本研究由国家重点研发计划（2016YFC1000402）、国家自然科学基金（81571445 和 81771617）、广东省自然科学基金（2016A030313178）以及深圳市基础研究基金（JCYJ20170413165233512）资助，资助对象均为 X.F.。

1. 储备液的配制
<ol>
	<li>通过将 4 mL 无水乙醇用 100 mL 超纯水稀释，配制 4% 乙醇水溶液。将该溶液储存于 4 °C。 
	注意：超纯水是指不含细菌、颗粒物、离子或核酸酶等污染物的水。本实验所用超纯水来自电阻率为 18.2 mΩ·cm 的水净化系统，表明其阴离子污染水平较低。</li>
	<li>将 20 mg 大豆卵磷脂溶解于 20 mL 4% 乙醇水溶液中，配制 1 mg/mL 大豆卵磷脂储备液。将大豆卵磷脂储备液储存于 4 °C。</li>
	<li>将 100 mg DSPE-PEG-COOH 溶解于 4 mL 4% 乙醇水溶液中，配制 25 mg/mL DSPE-PEG (2000)-COOH 储备液。将储备液储存于 -20 °C。</li>
	<li>将 50 mg DOX 溶解于 5 mL 超纯水中，配制 10 mg/mL DOX 储备液。将 DOX 储备液避光储存于 4 °C。</li>
	<li>将 20 mg PLGA 溶解于 10 mL 乙腈中，配制 2 mg/mL PLGA 储备液。将 PLGA 储备液储存于 4 °C。 
	警告：乙腈易燃且有毒。操作时应在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备，如实验服、护目镜和乳胶手套。</li>
	<li>将 2.17 g 2-(吗啉代)乙磺酸（MES，pH 6.0）溶解于 100 mL 超纯水中，配制 0.1 M MES（pH 6.0）储备液。将储备液储存于 4 °C。</li>
</ol>
2. DNPs 的合成
注意：为避免多柔比星（DOX）发生光化学降解，所有操作均在避光条件下进行。 
纳米颗粒采用先前报道的一步超声法合成11,13,14。
<ol>
	<li>向一个无菌的10 mL离心管中加入3 mL含4%乙醇的水溶液。然后，向该3 mL含4%乙醇的水溶液中加入90 µg大豆卵磷脂储备液、210 µg DSPE-PEG-COOH储备液和750 µg DOX储备液。</li>
	<li>将离心管置于冰浴中，并将冰浴放置在超声处理器上。</li>
	<li>使用1 mL注射器，将2 mg PLGA储备液逐滴加入离心管中（每滴间隔4–6秒）。同时，使用超声处理器以20 kHz频率和30%输出振幅对管内溶液超声处理5分钟，以合成DNPs。 
	注意：为合成粒径小且均一的颗粒，PLGA溶液滴加速度需缓慢，并避免产生气泡。</li>
	<li>使用离心过滤装置（截留分子量10 kDa），用0.1 M MES缓冲液（pH 6.0）对上述溶液洗涤3次，以纯化DNPs。每次在4 °C、1000 × g条件下离心3分钟。最终应剩余约1 mL溶于MES缓冲液的纳米颗粒。 
	注意：本步骤可作为实验流程中的合理暂停点。若不用于肽偶联，可用PBS缓冲液（pH 7.4）替代MES缓冲液进行纯化，纯化后的DNPs可在避光条件下于4°C保存。</li>
</ol>
3. 肽与DNPs的偶联
<ol>
	<li>酯活化
	<ol>
		<li>向1 mL DNPs中加入0.4 mg EDC（终浓度为2 mM）。</li>
		<li>向反应体系中加入0.24 mg NHS（终浓度为2 mM）。 
		注意：为便于准确加入EDC和NHS的量，可现配现用，即将试剂溶解后立即使用。</li>
		<li>充分混匀反应组分，置于摇床上，室温避光反应30分钟至1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胺反应
	<ol>
		<li>使用PBS（20×，pH 7.4）将缓冲液pH调至7.2–7.5。</li>
		<li>向反应溶液中加入0.5 mg plCSA靶向肽（plCSA-BP，EDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKC）。 
		注意：加入前，先将肽溶解于20%乙腈中。若肽不易溶解，可在水浴超声仪中进行超声处理以助溶解。</li>
		<li>充分混匀溶液后，置于摇床上，4 °C避光反应过夜。</li>
		<li>将偶联产物溶液转移至透析袋（截留分子量3,500 Da）中，用PBS（pH 7.4）缓冲液在室温下避光透析24小时，以透析并纯化plCSA-DNPs。 
		注意：也可按照步骤2.4的方法进行纯化以获得plCSA-DNPs。</li>
		<li>用于细胞培养实验时，将重悬溶液通过0.22 µm无菌注射式滤器过滤，以去除可能的沉淀物。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 靶向plCSA的脂质-聚合物纳米颗粒的表征
<ol>
	<li>使用动态光散射（DLS）测量纳米颗粒的流体动力学尺寸
	<ol>
		<li>用超纯水稀释纳米颗粒（50倍稀释）。根据DLS或zeta电位仪的说明书，将500 µL样品加入比色皿中。 
		注意：zeta电位和DLS所用比色皿可能因仪器规格不同而有所差异。</li>
		<li>测量完成后，记录颗粒直径、多分散指数（PDI）和zeta电位。对4次重复测量的结果取平均值，并计算标准偏差。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>透射电子显微镜（TEM）观察 
	注意：采用负染法通过透射电子显微镜（TEM）观察纳米颗粒的形貌。24
	<ol>
		<li>用超纯水稀释纳米颗粒（400倍稀释）。取20 µL样品滴加到TEM载网上，静置5分钟。</li>
		<li>加入100 µL 2%（w/v）磷钨酸溶液，静置2分钟，然后用滤纸吸去液滴。</li>
		<li>在室温下干燥TEM载网。</li>
		<li>将TEM加速电压设为80 kV，将图像放大至100,000×以观察纳米颗粒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>包封率（EE）和载药量（LE）的测定
	<ol>
		<li>标准曲线的制备。将DOX溶于超纯水中，配制五种不同浓度的DOX溶液：1 µg/mL、5 µg/mL、10 µg/mL、50 µg/mL和100 µg/mL。使用紫外-可见分光光度计在480 nm处测定各DOX溶液的吸光度。根据DOX浓度绘制标准曲线。</li>
		<li>取25 µL纳米颗粒溶液，用500 µL超纯水稀释。使用紫外-可见分光光度计在480 nm处测定吸光度。根据标准曲线计算药物浓度。</li>
		<li>使用以下公式计算载药量（LE）： 
		LE = （纳米颗粒中药物含量 / 材料总重量）× 100%。</li>
		<li>使用以下公式计算包封率（EE）： 
		EE = （纳米颗粒中药物含量 / 加入的药物总量）× 100%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用二辛可宁酸（BCA）法测定偶联效率25,26,27
	<ol>
		<li>将25 µL标准肽溶液（表1）或plCSA-DNPs溶液分别重复加入微孔板孔中。每孔加入200 µL工作试剂，在板式振荡器上充分混匀30秒。</li>
		<li>覆盖微孔板，在37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>使用酶标仪在562 nm处测定吸光度。利用所绘制的标准曲线计算plCSA-DNPs中plCSA的浓度。</li>
		<li>使用以下公式计算偶联效率： 
		偶联效率 = （纳米颗粒中肽的含量 / 加入的肽总量）× 100%。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>样品瓶</td>
			<td>稀释剂体积 (μL)</td>
			<td>肽溶液体积及来源 (μL)</td>
			<td>最终肽浓度 (μg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A</td>
			<td>0</td>
			<td>300 来自原液</td>
			<td>1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B</td>
			<td>250</td>
			<td>250 来自样品瓶 A 的稀释液</td>
			<td>500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C</td>
			<td>250</td>
			<td>250 来自样品瓶 B 的稀释液</td>
			<td>250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D</td>
			<td>250</td>
			<td>250 来自样品瓶 C 的稀释液</td>
			<td>125</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E</td>
			<td>300</td>
			<td>200 来自样品瓶 D 的稀释液</td>
			<td>50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F</td>
			<td>250</td>
			<td>250 来自样品瓶 E 的稀释液</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G</td>
			<td>400</td>
			<td>100 来自样品瓶 F 的稀释液</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H</td>
			<td>500</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 标准肽段的制备
5. 荧光显微镜评估靶向plCSA的纳米颗粒在绒毛膜癌（JEG3）细胞中的摄取
<ol>
	<li>将细胞以每孔1.0×104个细胞接种于无菌的12孔板中，每孔加入含1%青霉素/链霉素和10%胎牛血清（FBS）的完全DMEM/F12培养基（cDMEM/F12）。在37 °C、5% CO2及湿润条件下培养细胞至60%融合度。</li>
	<li>吸除培养基，每孔加入1 mL冷的新鲜低血清培养基（含5% FBS）以及DNPs或plCSA-DNPs（相当于5 µg DOX）。</li>
	<li>将细胞与纳米颗粒混合物在4 °C孵育1小时。</li>
	<li>孵育结束后，吸除培养基，用PBS洗涤细胞三次。然后每孔加入1 mL新鲜cDMEM/F12，于37 °C孵育30分钟。</li>
	<li>吸除cDMEM/F12，再用PBS洗涤细胞三次。</li>
	<li>加入2 mL冷的4%多聚甲醛（PFA），室温固定细胞15分钟。</li>
	<li>去除PFA溶液，用2 mL PBS洗涤一次。加入含DAPI（1 µg/mL）的1 mL PBS进行细胞核染色，室温孵育10分钟。</li>
	<li>吸去PBS，再用PBS洗涤细胞三次。</li>
	<li>加入封片剂，使用荧光显微镜分别通过绿色通道和蓝色通道观察DOX和细胞核的荧光信号。</li>
</ol>

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<li>Koren, E., Apte, A., Sawant, R. R., Grunwald, J., Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+TAT+peptide+in+drug+delivery+systems%3A+proteolytic+stability+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating TAT peptide in drug delivery systems: proteolytic stability requirements.</a> Drug Delivery. 18 (5), 377-384 (2011).</li>
<li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+ocular+delivery+to+laser-induced+choroidal+neovascularization+by+dual+internalizing+RGD+and+TAT+peptide-modified+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Topical ocular delivery to laser-induced choroidal neovascularization by dual internalizing RGD and TAT peptide-modified nanoparticles.</a> International Journal of Nanomedicine. 12, 1353-1368 (2017).</li>
</ol>

X.F. 和 B.Z. 是中国科学院深圳先进技术研究院（SIAT）提交的专利 PCT/CN2017/108646 和 201710906587.6 的发明人，该专利涉及靶向 plCSA 的纳米颗粒合成方法及其应用。其他作者声明无潜在利益冲突。

本方案提供了一种高效且可重复的合成plCSA-BP偶联脂质-聚合物纳米颗粒的方法。采用一步超声法制备脂质-聚合物纳米颗粒，具有快速、可重复的优点，且不同于需要加热、涡旋或蒸发等步骤的传统纳米沉淀法。因此，该方法显著缩短了合成时间。此外，本方案中使用的EDC/NHS生物偶联技术是将多肽和抗体与纳米颗粒偶联的常用且便捷的方法。因此，将一步超声法与EDC/NHS生物偶联技术相结合，用于合成靶向plCSA的脂质-聚合物纳米颗粒，具备向临床应用放大的潜力。
某些步骤对于成功合成和表征plCSA-DNPs至关重要。首先，卵磷脂、PLGA和DSPE-PEG-COOH的相对浓度决定了脂质-聚合物纳米颗粒的粒径和多分散性。当卵磷脂浓度固定时，DSPE-PEG-COOH浓度越高，纳米颗粒的多分散性越低，粒径越小13,15，但随之导致药物包封率（LE）下降。当PLGA浓度固定时，增加卵磷脂替代DSPE-PEG-COOH的比例，会导致纳米颗粒的多分散性升高、粒径增大<sup class="...

一种有效的癌症治疗方法能够在最小化全身毒性的前提下缩小并消除肿瘤。因此，选择性靶向肿瘤是探索成功治疗手段的关键。纳米颗粒为癌症治疗提供了广阔前景，而具有不同功能基团的分子组装体可提高药物疗效并减少相关副作用1,2。此外，纳米颗粒系统主要通过被动靶向和主动靶向机制到达目标肿瘤3。
被动靶向利用纳米颗粒的固有特性以及增强的渗透性和滞留效应（EPR效应）来实现向肿瘤细胞的递送。阳离子脂质体已在临床应用中成功用于将多种抗癌药物递送至肿瘤4,5,6。尽管具有潜在的有效抗癌治疗效果，但被动靶向纳米颗粒仍存在两个主要局限性：肿瘤区域药物浓度较低，以及无法区分肿瘤细胞与正常组织7。
主动靶向策略利用抗原-抗体、配体-受体及其他分子识别相互作用，将药物特异性地递送至肿瘤组织8。糖胺聚糖胎盘软骨素硫酸A（plCSA）在大多数癌细胞和胎盘滋养层细胞上广泛表达。此外，疟原虫蛋白VAR2CSA可特异性结合plCSA9,10。因此，VAR2CSA可作为靶向人类癌细胞的工具。然而，当VAR2CSA与纳米颗粒偶联时，其全长蛋白可能限制纳米颗粒进入肿瘤细胞的穿透能力。近期，我们发现了一种来源于疟原虫蛋白VAR2CSA的plCSA结合肽（plCSA-BP）。plCSA-BP偶联的脂质-聚合物纳米颗粒可快速结合绒毛膜癌细胞，并显著增强阿霉素（DOX）在体内的抗癌活性in vivo11；这些颗粒还可特异性结合胎盘滋养层细胞，有望作为药物靶向递送至胎盘的工具12。
脂质-聚合物纳米颗粒由脂质单层外壳和疏水性聚合物内核组成，是一种新型的药物递送载体。这类纳米颗粒结合了脂质体和聚合物纳米载体的优点，例如可控的粒径、高生物相容性、持续的药物释放、高载药效率（LE）以及优异的稳定性13。在本研究中，我们采用一步超声法合成脂质-聚合物纳米颗粒。该方法快速、便捷，适用于规模化制备，已被本课题组11,14及其他研究团队15,16,17,18广泛用于制备脂质-聚合物纳米颗粒。
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）是一种常用的碳二亚胺类交联剂，用于连接含有氨基和羧酸根的生物分子19。除了EDC之外，N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠盐（NHS）是表面修饰和纳米颗粒偶联反应中最常见的偶联试剂20,21。NHS能够减少副反应的发生，提高酯中间体的稳定性和产率22,23。
本文介绍了一种合成靶向plCSA的脂质-聚合物纳米颗粒的实验方案。首先，描述了负载阿霉素（DOX）的脂质-聚合物纳米颗粒（DNPs）的一步超声合成法。随后，介绍了采用EDC/NHS生物偶联技术制备plCSA-BP偶联脂质-聚合物纳米颗粒的方法。该生物偶联技术也可用于将其他抗体和多肽偶联到纳米颗粒上。最后，阐述了用于表征靶向plCSA的脂质-聚合物纳米颗粒的理化性质及体外检测方法。我们认为，这类靶向plCSA的脂质-聚合物纳米颗粒有望成为将药物靶向递送至大多数人类癌症的有效系统，也可用于将治疗载荷靶向递送至胎盘以治疗胎盘相关疾病。

<table><tbody><tr><td>plCSA 肽</td><td>Shanghai GL Biochem</td><td>573518</td><td>用于多肽合成</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>10009218</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>大豆卵磷脂</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>441601</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880125</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>阿霉素</td><td>JKChemical</td><td>113424</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>上海凌峰</td><td>1008621</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>PLGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719897</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>超声波处理器</td><td>Sonics</td><td>VCX130</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>离心过滤器（截留分子量 10 kDa）</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>用于纳米颗粒纯化</td></tr><tr><td>离心机</td><td>Sigma</td><td>3-18KS</td><td>用于纳米颗粒纯化</td></tr><tr><td>2-[吗啉代]乙磺酸（MES）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>用于多肽偶联</td></tr><tr><td>1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3450</td><td>用于多肽偶联</td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td>用于多肽偶联</td></tr><tr><td>透析袋</td><td>Spectrum</td><td>132592T</td><td>用于纳米颗粒纯化</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>10 mL 聚丙烯离心管</td><td>Aladdin</td><td>S-025</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>15 mL 聚丙烯离心管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td>用于多种应用</td></tr><tr><td>0.22 &amp;mu;m 无菌注射器滤器</td><td>Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td>用于纳米颗粒纯化</td></tr><tr><td>1 ml 聚丙烯注射器</td><td>BD</td><td>328421</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>马尔文粒度分析仪</td><td>Malvern</td><td>Nano ZS</td><td>用于粒径分析</td></tr><tr><td>磷钨酸</td><td></td><td></td><td>用于透射电镜（TEM）</td></tr><tr><td>透射电镜载网</td><td>EMCN</td><td>BZ10024a</td><td>用于透射电镜（TEM）</td></tr><tr><td>紫外-可见分光光度计</td><td>Leagene</td><td>DZ0035</td><td>用于透射电镜（TEM）</td></tr><tr><td>透射&lt;br/&gt; 电子显微镜</td><td>JEOL</td><td>JEM-100CXII</td><td>用于粒径分析</td></tr><tr><td>BCA 试剂 A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23228</td><td>用于 BCA 检测</td></tr><tr><td>BCA 试剂 B</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23224</td><td>用于 BCA 检测</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Corning</td><td>3599</td><td>用于 BCA 检测</td></tr><tr><td>酶标仪</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan&amp;trade; GO</td><td>用于 BCA 检测</td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>JEG3 细胞</td><td>中国科学院细胞库</td><td>TCHu195</td><td>人胎盘来源</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Hyclone</td><td>SH30272.01</td><td>无酚红</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>GIBCO</td><td>10100</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>GIBCO</td><td>15070063</td><td>用于细胞培养</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>OLYMPUS</td><td>CKK53</td><td>用于细胞摄取实验</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>上海凌峰</td><td>1372021</td><td>用于细胞摄取实验</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>生工生物</td><td>A606584</td><td>用于细胞摄取实验</td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Life</td><td>P36961</td><td>用于细胞摄取实验</td></tr></tbody></table>

靶向胎盘硫酸软骨素a（plcsa）的脂质-聚合物纳米颗粒的合成与表征

Synthesis and Characterization of Placental Chondroitin Sulfate A (plCSA)-Targeting Lipid-Polymer Nanoparticles

一种有效的癌症治疗方法能够在最小化全身毒性的前提下缩小并消除肿瘤。主动靶向的纳米颗粒为癌症治疗提供了有前景的策略。糖胺聚糖胎盘软骨素硫酸A（plCSA）在多种癌细胞和胎盘滋养层细胞上表达，而疟原虫蛋白VAR2CSA能够特异性地与plCSA结合。已有研究报道，来源于疟原虫蛋白VAR2CSA的胎盘软骨素硫酸A结合肽（plCSA-BP）也可特异性结合癌细胞和胎盘滋养层细胞上的plCSA。因此，plCSA-BP偶联的纳米颗粒可作为靶向药物递送至人类癌症及胎盘滋养层细胞的工具。在本实验方案中，我们描述了一种合成载有多柔比星的plCSA-BP偶联脂质-聚合物纳米颗粒（plCSA-DNPs）的方法；该方法包括单一超声步骤和生物偶联技术。此外，还介绍了多种对plCSA-DNPs进行表征的方法，包括测定其理化性质以及在胎盘绒毛膜癌（JEG3）细胞中的细胞摄取情况。

在此方案中，PLGA、DSPE-PEG-COOH 和大豆卵磷脂分别为代表性的聚合物、脂质-PEG-COOH 偶联物和脂质。靶向 plCSA 的脂质-聚合物纳米颗粒的合成 通过 一种单步超声处理方法和EDC/NHS技术被展示于 图1首先，在超声条件下，大豆卵磷脂、PLGA 和 DSPE-PEG-COOH 自组装形成具有核-壳结构的 DNPs。其中，核由 PLGA 及包载的 DOX 构成，壳由 DSPE-PEG-COOH 组成，大豆卵磷脂单层位于壳与核的界面处。随后，暴露在 DNP 表面的 -COOH 基团与 -NH2 肽的组别 通过 采用EDC/NHS法合成plCSA-DNPs。
本实验方案制备的DNPs直径为82.3 ± 4.7 nm，与plCSA-BP偶联后，初级DNPs的直径增至109.3 ± 5.9 nm（<strong clas...

本文介绍了一种胎盘硫酸软骨素A结合肽（plCSA-BP）偶联脂质-聚合物纳米颗粒的合成方案。 通过 单步超声处理与生物偶联技术。这些颗粒构成了一种新型工具，可用于将治疗药物靶向递送至大多数人类肿瘤及胎盘滋养层细胞，以治疗癌症和胎盘相关疾病。

靶向胎盘硫酸软骨素A（plCSA）的脂质-聚合物纳米颗粒的合成与表征

一种有效的癌症治疗方法能够在最小化全身毒性的同时缩小并消除肿瘤。主动靶向的纳米颗粒提供了一种有前景的……

该方法有助于回答药物递送领域中的关键问题，例如将治疗药物靶向递送至人体癌症组织和胎盘滋养层细胞。该技术的主要优势在于，它是一种简单且可重复的合成方法，可用于制备与其他颗粒偶联的多肽。首先，向一个无菌的10毫升离心管中加入3毫米的4%乙醇。然后，加入90微克大豆卵磷脂储备液、210微克DSPE-PEG-羧酸储备液和750微克DOX储备液。使用1毫升注射器移取2毫克PLGA储备液。将离心管置于冰浴中的超声处理器上，超声处理2分钟。然后，将PLGA储备溶液逐滴加入离心管中。为纯化DNPs，使用离心过滤器用0.1摩尔MES缓冲液洗涤溶液。随后，在4摄氏度下以1000 ×g离心3分钟。开始酯活化时，将 0.4 毫克 EDC 加入 1 毫升 DNPs 中。然后向反应体系中加入 0.24 毫克 NHS。随后，在避光条件下室温反应最多 1 小时。此后，充分混匀反应组分，并将反应体系置于摇床中。为启动胺反应，使用 PBS 将缓冲液的 pH 从 7.2 提高至 7.5。然后，向反应溶液中加入 0.5 毫克的 pICSA 靶向肽。充分混匀溶液后置于摇床上。然后在4 °C避光条件下过夜反应。次日，用透析袋装入偶联溶液。在室温下避光条件下，用 PBS 缓冲液纯化 pICSA DNPs 24 小时。根据文本方案培养细胞后，移除培养基，并加入 1 毫升含 5% FBS 的新鲜冷培养基以及 pICSA DNPs 或 DNPs。然后，在 4°C 条件下孵育细胞与纳米颗粒混合物 1 小时。此后，移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞三次。然后加入 1 毫升新鲜培养基，在 37 摄氏度下将细胞孵育 30 分钟。之后，移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞三次。然后，加入2 mL冷的4% PFA，在室温下孵育10分钟。去除PFA，用2 mL PBS洗涤细胞。接着，加入含DAPI的1 mL PBS用于细胞核染色。将混合物在室温下孵育10分钟。最后，加入封片剂，并使用荧光显微镜观察荧光。采用本方案，成功制备了DNPs并将其与pICSA BP偶联。偶联后，初级DNPs的直径增加至约109纳米。DNPs 和 pICSA DNPs 的透射电镜图像显示，颗粒分散良好，通常呈球形形态。纳米颗粒的泽塔电位为 -20.1 和 -29.9 毫伏，表明纳米颗粒具有高度稳定性。JEG3 细胞摄取实验表明，pICSA DNPs 在 30 分钟内即与 JEG3 细胞结合。因此，pICSA BP 能够高效地偶联到表面。在进行此操作时，需要注意在加入 PLGA 之前，先对混合物进行 1 至 2 分钟的超声处理。完成此步骤后，可采用本研究中的方法（如 HPLC 测定）更准确地确定偶联效率。该技术问世后，为生殖生物学领域的研究人员探索妊娠并发症中胎盘靶向治疗的可能性开辟了道路。

synthesis-characterization-placental-chondroitin-sulfate-plcsa

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

胎盘硫酸软骨素 A (plCSA) 靶向脂质高分子纳米粒的合成与表征

本文介绍了一种利用嵌段共聚物合成聚合物纳米颗粒的纳米沉淀方法。我们将讨论嵌段共聚物的合成、纳米沉淀技术及其潜在应用。...

通过纳米沉淀法制备双嵌段聚合物纳米颗粒

我们描述了使用维生素E-TPGS作为乳化剂制备和表征由聚（乳酸-共-乙醇酸）组成的纳米颗粒和微粒的方法。通过改变乳化剂浓度等配方参数，可制备出平均直径在220 nm至 1.98...

单乳液或双乳液法结合维生素E-TPGS制备PLGA纳米颗粒

本实验方案的目的是将干细胞归巢因子 SDF-1α 负载至硫酸葡聚糖-壳聚糖纳米颗粒中。对所得颗粒的粒径、Zeta 电位，以及其中 SDF-1α 的含量、活性和 体外...

SDF-1α-壳聚糖-硫酸葡聚糖纳米颗粒的制备与表征

本研究描述了一种合成超小生物相容性纳米颗粒群体的方法，以及若干 体外 用于评估其细胞相互作用的方法。...

用于细胞内靶向应用的固体脂质纳米颗粒（SLNs）

一种由含海藻酸盐微粒的聚(N-异丙基丙烯酰胺)-接枝-硫酸软骨素（PNIPAAm-g-CS）组成的可注射组织工程支架被制备出来。其黏附强度、溶胀性能及 体外...

用于组织工程的含海藻酸盐微粒的热致凝胶化聚(N-异丙基丙烯酰胺)-接枝-硫酸软骨素复合材料的合成

利用液晶纳米颗粒（LCNP）纳米载体作为载体，将疏水性货物可控地递送至活细胞的质膜。...

靶向液相晶体纳米颗粒载体包封疏水性货物的质膜递送

本文介绍了一种调节共价交联纳米颗粒尺寸和交联密度的方法，这些纳米颗粒由含有侧链官能团的线性聚酯制备而成。通过调控合成参数（聚合物分子量、侧链官能团引入程度以及交联剂当量），可获得适用于药物递送应用的所需纳米颗粒尺寸和交联密度。...

纳米海绵在尺寸和交联密度上的可调性

我们介绍一种利用三种方法评估靶向胎盘药物递送安全性和有效性的系统：体内成像用于监测纳米颗粒的聚集，高频超声用于监测胎盘和胎儿发育，高效液相色谱法（HPLC）用于定量组织中的药物递送量。...

综合评估胎盘靶向药物递送的有效性与安全性的三种互补方法

本文描述了将法卡林二醇包载于脂质包被的74...

人骨髓间充质干细胞对含法尔卡林二醇的新型脂质包被纳米颗粒的摄取

本方案描述了可注射型超分子聚合物-纳米颗粒（PNP）水凝胶生物材料的合成与配制方法。同时展示了这些材料在药物递送、生物制药稳定化以及细胞包封与递送中的应用。...

可注射的超分子聚合物-纳米粒子水凝胶在细胞与药物递送中的应用

学习合成胎盘硫酸软骨素A靶向脂质高分子纳米粒的方法，用于肿瘤和胎盘滋养层细胞的靶向药物递送。该技术简单可重复，为癌症和胎盘疾病治疗提供新工具。

靶向胎盘硫酸软骨素A（plCSA）的脂质-聚合物纳米颗粒的合成与表征

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