动态粘附法在炎症性肠病抗粘连治疗功能分析中的作用

这种方法可以帮助回答基本免疫生物学和炎症性肠病研究有关免疫细胞的粘附级联，需要到周围器官的关键问题。该技术的主要优点是，它是在流条件下细胞粘附的上下文中回答功能问题的一种方便而直接的方法。虽然该方法是为探索炎症性肠病中细胞细胞性抗蛋白抗体的机理而开发的，但可以对其进行修改，以分析其他炎症性疾病环境中的类似问题。

首先用小剪刀将一块橡胶管一侧拉伸，以便将长方形毛细管插入约 0.5 厘米的管子中。然后用石蜡膜密封连接。用20微升的息片覆盖毛细管，用塑料石蜡薄膜密封未连接到管子的一侧，在37摄氏度下至少孵育一小时。

在孵化结束时，取出塑料石蜡膜，让液体从毛细管中浸泡到纸巾上，以清空管子。然后在37摄氏度下用20微升的阻滞溶液阻断毛细管至少一小时。去除涂层后，直接对毛细管施加阻尼非常重要，以避免毛细管干燥，因为这可能损害编码蛋白的功能。

当毛细管被阻塞时，从50毫升管中加入18毫升的抗凝全身血液，用PBS稀释血液到总体积为35毫升。在血液溶液下10毫升密度梯度介质，通过密度梯度离心分离外周血单核血细胞。在分离结束时，将外周血单核细胞从密度梯度介质的界面转移到新的50毫升管。

使用新鲜的 PBS 使管子中的总体积达到 50 毫升。离心后，将颗粒重新在 10 毫升新鲜 PBS 中重新供应，根据制造商的说明，用合适的细胞跟踪染料对细胞进行计数和染色。在染色孵育结束时，通过离心收集细胞，并在每毫升完全RPMI中等浓度的1.5倍至6个细胞中重新下粒。

然后将一毫升的细胞播种到48孔板的井中，因为有条件。并在37摄氏度下将适当体积的抗内黄蛋白抗体加入到适当的井中，进行一小时的孵育。接下来使用P1000移液器多次重新给细胞，然后再将细胞转移到单独的两毫升管中。

用一毫升 PBS 冲洗每口井，将洗涤液池在适当的两毫升管中。计数后，通过离心对细胞进行颗粒，并在适当的粘附缓冲量中重新悬浮细胞，获得每毫升悬浮液的10至第6个细胞的1.5倍。然后将适当的氯化锰体积添加到每个管中，达到一毫摩尔的最终浓度。

当细胞准备就绪时，打开显微镜并选择适当的过滤器和激光器、目标和采集模式。从毛细管尖端取下塑料石蜡膜，用剪刀拉伸一块五厘米的橡胶管，使毛细管连接到较小的管子上。用塑料石蜡膜密封毛细管和管之间的连接。

将毛细管安装在固定托盘上。将托盘放在显微镜的托盘支架上，使毛细管对焦。并将橡胶管插入近位泵的相应槽中。

将管的未连接端放入包含细胞悬浮液的第一个样品管中。将毛细管另一侧的短管插入15毫升管中，收集流量。让管子以每分钟 500 微升的流量填充，直到细胞悬浮液几乎到达毛细管。

然后让毛细管以每分钟 100 微升的流速填充。当毛细管充满细胞时，将流速调整为每分钟10微升，并每两秒钟沿地址涂层墙内缓慢移动的细胞的时差图像，共三分钟。一旦细胞悬浮液到达毛细管内部，就避免流量中断至关重要，因为这将导致静态整流地址相互作用，从而可能使测量偏置。

在丢弃之前，通过显微镜的目镜流过整个毛细管，以确保屏幕上观察到的部分具有代表性。将油管从泵中释放，让剩余的液体回两毫升管中。然后断开毛细管和管子与固定托盘的连接，并像刚才演示的一样对下一个毛细管进行成像。

要评估时间间隔记录，请打开相应分析软件中的第一个序列，然后将第一个和最后三个图像导出为 TIFF 文件。打开 ImageJ 中的三个开始图像，然后选择图像、类型和 32 位以将图像转换为 32 位。然后选择图像、颜色和合并通道将图像合并到一个图像中，并将复合图像转换为 RGB 以保存为 TIFF 文件。

以相同方式转换最后三个图像后，计算开头和结尾复合图像中可见的白单元格。并从结束图像中的白细胞数中减去开始图像中的白细胞数。涂有 ICAM-1、VCAM-1、MAdCAM-1 的毛细管灌注，但与人类 PBMC 的 Isotype Fc 嵌合不上，当存在三个地址之一时，会导致明显的粘附。

相比之下，使用中和抗体抑制蛋白对丁相互作用通常会导致动态粘附的显著减少，而当添加等型控制抗体时，这种粘附力是不存在的。此外，与未经治疗的人类细胞相比，使用特异性化疗治疗CD4人类T细胞可增加粘附性。在尝试此程序时，重要的是要记住，各种因素有助于体内的动态细胞粘附，而这种分析不能完全概括。

但是，可以调整检测方法，以解决非常复杂的问题。为了解决测试细胞类型的差分粘附行为的其他问题，还可以对标有不同细胞跟踪染料的不同细胞类型进行竞争性粘附测定。在开发后，该技术使我们能够探索用于治疗炎症性肠病的不同抗内黄蛋白抗体的作用。