Name: 从人胚胎干细胞中提取合适的视网膜色素上皮组织的工程移植 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: 学习利用人羊膜支架培养人多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞，构建适合移植的视网膜组织。该方法为视网膜疾病治疗和组织工程研究提供了标准化方案。

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作者感谢 Jérôme Larghero 和 Valérie Vanneaux（法国巴黎圣路易医院）在建立本文所述方法过程中提供的帮助。
本工作获得了法国国家研究局（ANR）[GPiPS：ANR-2010-RFCS005；SightREPAIR：ANR-16-CE17-008-02]、法国医学研究基金会[Fondation pour la Recherche Médicale，生物工程计划 - DBS20140930777]以及LABEX REVIVE[ANR-10-LABX-73]对Olivier Goureau和Christelle Monville的资助。同时获得NeurATRIS——神经科学领域生物治疗的转化研究基础设施（“未来投资”项目）[ANR-11-INBS-0011]，以及INGESTEM——多能性与分化干细胞工程的国家级基础设施（“未来投资”项目）[ANR-11-INBS-000]对Christelle Monville的资助。Karim Ben M'Barek获得了DIM Stempole和LABEX REVIVE[ANR-10-LABX-73]提供的博士后奖学金支持。I-Stem隶属于由法国肌病协会（AFM）- Téléthon支持的罕见病生物治疗研究所。

本方案中使用的所有人类材料均按照欧盟法规进行使用。本研究中使用的人类胚胎干细胞系来源于一个独特的胚胎。捐赠该胚胎的夫妇已充分知情，并同意进行匿名捐赠。该胚胎经由Roslin Cells公司（英国）建立了符合临床级标准的人类胚胎干细胞系，并完成了细胞库建立、质量鉴定和相关文件记录。人羊膜细胞（hAMs）是在签署知情同意书同意捐赠胎盘的产妇进行剖宫产手术期间，按照医院指南（APHP，圣路易医院）在无菌条件下获取的。
1. 培养基与试剂的制备
<ol>
	<li>RPE细胞培养基的制备
	<ol>
		<li>配制RPE细胞培养基时，将4%血清替代物（终体积500 mL时为20 mL）、1,000倍稀释的2-巯基乙醇（终体积500 mL时为500 µL）和1% Eagle′s最低必需培养基（MEM）非必需氨基酸溶液（终体积500 mL时为5 mL）加入高糖Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，终体积500 mL时为475 mL）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转运/保存培养基的制备
	<ol>
		<li>制备转运/保存培养基时，向500 mL终体积的培养基中加入1%的青霉素-链霉素溶液（5 mL）。2-独立培养基（最终体积500 mL，使用495 mL），4 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>热蛋白酶的重悬
	<ol>
		<li>蛋白酶溶液的配制
		<ol>
			<li>将储存于 -20 °C 的嗜热菌蛋白酶粉末在室温下解冻，以配制其储备液。</li>
			<li>由于酶活性在不同批次间可能存在差异，应根据所用批次热蛋白酶粉末随附的分析证书计算该活性。将 &#34;活性中性蛋白酶计算值 = ANPC&#34; （见分析证书）乘以181（即酪氨酸的分子量）。所得结果对应于所提供的嗜热菌蛋白酶粉末的总酶活性（U/瓶）。</li>
			<li>通过将每瓶总酶活性（U/瓶）除以200（U/mL）计算所需水量，用该体积的水配制200 U/mL的储备液。</li>
			<li>用移液器反复吹打加入的水以溶解酶。涡旋振荡溶液30秒，检查粉末是否已完全悬浮。可能需要进一步吹打以确保完全溶解。</li>
			<li>将储备液分装后于 -20 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>嗜热菌蛋白酶工作液的配制 
		注意：热蛋白酶溶液必须在人羊膜处理当天配制。
		<ol>
			<li>在200 U/mL浓度下储存于-20 °C的嗜热菌蛋白酶储备液中，将其分装物解冻。用磷酸盐缓冲液（PBS）将储备液稀释200倍，以获得终酶活性为1 U/mL的工作液。每处理1–4片人羊膜（hAM）组织片，需准备40 mL工作液。</li>
			<li>使用前，将嗜热菌蛋白酶溶液经0.2 µm滤膜过滤。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>明胶的重悬
	<ol>
		<li>20% 明胶溶液的制备与包埋 
		注意：20% 明胶溶液和凝块可提前 1 周配制备用。
		<ol>
			<li>将 CO 预热2-独立培养基置于42 °C水浴中30分钟（最长1小时）。在50 mL离心管中，将10 g明胶加入40 mL预热的CO₂2-不含血清的培养基中涡旋混匀。</li>
			<li>在 42 °C 下溶解明胶 30–60 分钟。每 10 分钟涡旋振荡一次，以使溶液均匀。</li>
			<li>待溶液混匀后，向四个6 cm培养皿中各加入4 mL 20%明胶溶液。避免产生气泡。用塑料封口膜覆盖培养皿以作保护，于4 °C静置使其凝固。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>8% 明胶溶液的制备 
		注意：8% 明胶溶液可提前一天配制，并于 4 °C 保存。
		<ol>
			<li>将 CO 预热2-独立培养基升温至 42 °C，持续 30 分钟（最长 1 小时）。在 50 mL 离心管中，将 4 g 明胶加入 46 mL 温热的 CO2-不含血清的培养基中涡旋混匀。</li>
			<li>将明胶在 42 °C 下溶解 30–60 分钟。若当天使用，需在管口覆盖一层塑料石蜡膜，并置于 37 °C 水浴中保存；若需后续使用，则在 4 °C 下储存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人羊膜的嗜热菌蛋白酶处理
<ol>
	<li>人羊膜清洗
	<ol>
		<li>将人羊膜（hAM）以小片形式（约 30 mm × 30 mm）固定在尼龙支架上，置于 PBS 中并保持在 4 °C，或以冷冻状态提供。若为冷冻状态，需在 37 °C 培养箱中解冻 30 分钟。</li>
		<li>清洗羊膜：
		<ol>
			<li>将 1–4 片羊膜放入一个含有 80 mL PBS 的 250 mL 瓶中。根据需要使用多个瓶子。</li>
			<li>将每个瓶子置于摇床中以高速振荡 5 分钟，弃去 PBS。加入 80 mL PBS，重复一次。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>嗜热菌蛋白酶处理
	<ol>
		<li>每瓶含羊膜的瓶子（每瓶含 1–4 片羊膜；每次最多处理 3 瓶）加入 40 mL 嗜热菌蛋白酶工作液（1 U/mL）。</li>
		<li>将瓶子在 450 rpm 条件下振荡 5 分钟，然后涡旋 30 秒。重复一次。</li>
		<li>弃去嗜热菌蛋白酶溶液，加入 80 mL PBS。</li>
		<li>将瓶子在 450 rpm 条件下振荡 5 分钟，弃去 PBS，再加入 80 mL PBS。重复此洗涤步骤 3 次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在培养插件上固定人羊膜
<ol>
	<li>使用能够触及瓶底的长柄无菌镊子，逐个取出人羊膜（hAM），并将每张人羊膜转移至含有10 mL PBS的10 cm培养皿中。</li>
	<li>在另一个含有10 mL PBS的10 cm培养皿中，将其中一张羊膜放置于尼龙网朝下的位置。松开用于固定羊膜至尼龙网的四个夹子中的两个。</li>
	<li>将培养插件的小环插入尼龙网与羊膜之间。</li>
	<li>确保羊膜完全覆盖小环。将培养插件的上半部分夹在羊膜上方，使人羊膜的基底膜朝上位于培养插件内部。随后取下剩余的两个夹子。</li>
	<li>如有必要，用无菌剪刀剪去培养插件外多余的羊膜组织。用镊子将固定在培养插件中的羊膜转移至12孔板中，加入PBS，并将板置于37 °C、5% CO2的培养箱中保存。</li>
	<li>对其他羊膜重复上述操作（从步骤3.2至3.5）。</li>
</ol>
4. 视网膜色素上皮细胞在人羊膜上的解冻与接种
<ol>
	<li>视网膜色素上皮细胞的解冻
	<ol>
		<li>视网膜色素上皮细胞库以每支冻存管100万个细胞的数量在液氮中冻存。根据需要解冻相应数量的冻存管（每张膜接种35万个细胞）。</li>
		<li>每支冻存管准备一个15 mL离心管，内含3 mL RPE培养基。冻存管解冻后，将细胞转移至各离心管中。对其他冻存管重复此操作。</li>
		<li>混匀（用移液器上下吹打数次，使细胞在RPE培养基中重悬），取10 µL细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，加入10 µL台盼蓝染液。取15 µL该混合液加入细胞计数板，在显微镜下用4倍物镜计数活细胞数量（未被染成蓝色的细胞）。对其他冻存管重复此操作。</li>
		<li>同时，将15 mL离心管在110 × g 条件下离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于培养基中，调整细胞密度为700,000个细胞/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将视网膜色素上皮细胞接种至人羊膜上
	<ol>
		<li>从培养箱中取出含有羊膜的12孔板。</li>
		<li>吸除PBS。在培养插件中央加入500 µL步骤4.1.4中制备的细胞悬液。在培养插件外侧（即孔内）加入1 mL RPE培养基。对其他羊膜重复此操作。</li>
		<li>将含有羊膜的12孔板放回培养箱中继续培养。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 人羊膜上视网膜色素上皮细胞培养的维持
<ol>
	<li>每周更换两次培养基，通常在周一和周五，持续至培养的第30天或更长时间。</li>
	<li>吸去每个孔中培养插件内部和外部的培养基，并更换为新鲜培养基（培养插件外部加入1 mL，内部加入500 µL）。将培养板置于37 °C、5% CO2的培养箱中。</li>
</ol>
6. 视网膜色素上皮移植片的制备
注意：培养至第30天时，组织即可用于移植。
<ol>
	<li>将8%明胶溶液在37 °C水浴中预热30分钟。用预冷的CO₂2-不含血清的培养基（4 °C）</li>
	<li>将20%明胶块放入振动切片机中。
	<ol>
		<li>从冰箱中取出含有20%明胶块的6 cm培养皿。使用手术刀切出一块5 cm × 5 cm的明胶块。将明胶块的上表面用氰基丙烯酸酯胶水或其等效粘合剂粘附至支撑物上。</li>
		<li>在振动切片机中安装新刀片。</li>
		<li>调节模块的高度，直至其与剃刀刀片处于同一水平。</li>
		<li>用新鲜的CO₂饱和溶液填充支撑物周围的浴槽2-独立培养基中，4 °C 下用振动切片机以中等速度切割组织块，直至切面均匀平整。将位置设为 0。</li>
		<li>吸干明胶块周围的培养基，直至完全干燥，然后从37 °C培养箱中取出含有组织的12孔培养板。</li>
		<li>使用镊子小心地将培养插件在明胶块上打开。用剪刀剪去所有不含细胞的膜部分（即未进行细胞培养的环外部分）。吸除所有残留培养基。</li>
		<li>加入1 mL 37 °C的液体8%明胶溶液以覆盖膜。小心去除多余液体。静置5–8分钟，使明胶凝固。</li>
		<li>加入新鲜的CO2-独立的介质（4 °C）加入浴槽中，直至覆盖膜。</li>
		<li>使用振动切片机在 -100 µm 位置以中等速度进行切割，同时注意观察组织块的状态。切片结束时，需小心保持组织的方向性。</li>
		<li>用手术刀切去一个角以确定切片的方向。</li>
		<li>用刮勺收集嵌入明胶中的膜，置于盛有保存液的6孔板中，于4 °C保存，直至移植到受体眼内。</li>
		<li>移植时，在手术显微镜下根据受体眼球大小调整移植物尺寸（大鼠为1–3 mm，10–15 mm）2 用于非人灵长类动物）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Dunn, K. C., Aotaki-Keen, A. E., Putkey, F. R., Hjelmeland, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARPE-19%2C+a+human+retinal+pigment+epithelial+cell+line+with+differentiated+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">ARPE-19, a human retinal pigment epithelial cell line with differentiated properties.</a> Experimental Eye Research. 62 (2), 155-169 (1996).</li>
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</ol>

Olivier Goureau 是关于从人类多能干细胞生成视网膜细胞的待批准专利的发明人。其他作者无任何利益冲突需要披露。

我们描述了一种在生物支架上培养视网膜色素上皮（RPE）细胞的方法，并介绍了其在动物模型中移植前的制备步骤。该方案中的一个关键步骤是在整个操作过程中始终保持羊膜（hAM）的方向性，直至将其包埋入明胶中。实际上，需去除膜上的天然上皮层，使其基底膜暴露9。RPE细胞必须接种于该暴露的基底膜表面。在进行明胶包埋准备时，至关重要的是所有试剂均需在规定温度下操作。因为明胶在4 °C时呈固态，而在体温（37 °C）时呈液态9。若未严格控制温度，明胶可能在不期望的步骤中提前凝固或液化。
已提出多种生物支架，例如Descemet膜25或人羊膜（hAMs）26。特别是来自剖宫产手术获取的人羊膜27，已被证明在视网膜下腔具有良好的耐受性，仅引起轻微炎症反应，并可减少脉络膜新生血管形成26。该膜能够成功支持人视网膜色素上皮...

视网膜色素上皮（RPE）对其紧密关联的光感受器的存活和稳态至关重要1。多种病理状态会改变其功能和/或存活能力，包括视网膜色素变性（RP）和年龄相关性黄斑变性（AMD）。
视网膜色素变性（RP）是一组影响光感受器细胞或视网膜色素上皮（RPE）细胞功能或同时影响这两类细胞的遗传性单基因突变疾病2,3。据估计，仅影响RPE细胞的突变约占RP病例的5%2。年龄相关性黄斑变性（AMD）是另一种以RPE层发生改变为特征的疾病，最终导致中心视力丧失。AMD由遗传和环境因素的复杂相互作用引起，主要影响老年人群4,5,6。根据预测，到2020年全球将有1.96亿患者受到AMD影响7。目前这些疾病尚无有效治愈手段，其中一种被提出的治疗策略是移植新的RPE细胞，以替代已死亡或功能丧失的原有RPE细胞8。
最终移植产品的制剂形式至关重要，以确保最佳的功能效果。以细胞悬液形式注射的视网膜色素上皮（RPE）细胞，尽管是一种简便且直接的递送方法，但其存活率、整合能力及功能表现仍令人担忧。9,10,11,12,13科学家们目前正在开发更复杂的配方以递送工程化视网膜组织9,13,14,15,16在此背景下，我们开发了一种原创方法以生成 体外 可用于移植的RPE组织9.
本方案中使用源自人类胚胎干细胞（ES 细胞）的视网膜色素上皮（RPE）细胞库。然而，也可采用其他来源的 RPE 细胞库（如人诱导性多能干细胞、原代 RPE 细胞， 等等。）并采用不同方法进行分化的细胞也适用于本方案。该方案包括使用细胞因子和/或小分子的定向分化方案。17,18,19,20,21,22.
为了进行移植，工程化组织应在支架上制备。近年来，已开发出多种基于聚合物或生物来源基质的支架13,23,24。本文所使用的生物基质为人羊膜（hAM），但也可采用其他基质，如去细胞的布鲁赫膜。本方法的优势在于使用了一种更接近视网膜色素上皮（RPE）天然微环境的生物支架。
人胚胎干细胞分化的RPE细胞需培养至少4周，以完全形成鹅卵石状单层结构。在此阶段，所获得的上皮组织具有功能性和极性9。最后，由于该组织容易皱缩，需将其包埋于一层薄的水凝胶载体中，以增强其刚性和弹性，并在注射过程中提供保护。该产品随后在4 °C保存，直至移植使用。

<table><tbody><tr><td>无菌生物安全柜</td><td>TechGen International</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>用于抽吸的液体废液处理系统</td><td>Vacuubrand</td><td>BVC 21</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;控制的37&amp;nbsp;&amp;deg;C细胞培养箱</td><td>Thermo Electron Corporation</td><td>BVC 21 NT</td><td></td></tr><tr><td>200&amp;nbsp;&amp;micro;L移液器：P200</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;mL移液器：P1000</td><td>Gilson</td><td>F144566</td><td></td></tr><tr><td>移液辅助器</td><td>Drummond</td><td>75001</td><td></td></tr><tr><td>4&amp;nbsp;&amp;deg;C冰箱</td><td>Liebherr</td><td>不适用</td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>WPI</td><td>501758</td><td></td></tr><tr><td>镊子（×2）</td><td>WPI</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Grant subaqua pro</td><td>SUB6</td><td></td></tr><tr><td>精密天平</td><td>Sartorius</td><td>CP225D</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorff</td><td>5804</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Olympus</td><td>SC30</td><td></td></tr><tr><td>水平往复摇床</td><td>IKA-WERKE</td><td>IKA MTS 214D</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>VWR</td><td>LAB DANCER S40</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>WPI</td><td>500351</td><td></td></tr><tr><td>塑料石蜡膜</td><td>VWR</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>0.200 &amp;micro;m一次性针头滤器</td><td>SARTORIUS</td><td>16532</td><td></td></tr><tr><td>50 mL无针头注射器</td><td>Dutscher</td><td>50012</td><td></td></tr><tr><td>250 mL瓶</td><td>Dutscher</td><td>28024</td><td></td></tr><tr><td>15 mL无菌Falcon管</td><td>Dutscher</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>50 mL无菌Falcon管</td><td>Dutscher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>培养插件</td><td>Scaffdex</td><td>C00001N</td><td></td></tr><tr><td>60&amp;nbsp;mm细胞培养皿：B6</td><td>Dutscher</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>12孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>6孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水</td><td>Castorama</td><td>3178040670105</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1×（500&amp;nbsp;mL）</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>嗜热菌蛋白酶</td><td>Roche</td><td>5339880001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖，含GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>61965-026</td><td></td></tr><tr><td>KSR CTS（KnockOut SR XenoFree CTS）</td><td>Invitrogen</td><td>12618-013</td><td></td></tr><tr><td>MEM-NEAA（100×）</td><td>Invitrogen</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇（50&amp;nbsp;mM）</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;非依赖性培养基</td><td>GIBCO</td><td>18045-054</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>MERCK</td><td>104078</td><td></td></tr><tr><td>人羊膜</td><td>巴黎圣路易医院组织库（法国巴黎）</td><td>不适用</td><td></td></tr></tbody></table>

由人胚胎干细胞衍生的适用于移植的视网膜色素上皮组织的构建

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

眼部的多种病理状况会影响视网膜色素上皮（RPE）的功能和/或存活。这些疾病包括某些类型的视网膜色素变性（RP）和年龄相关性黄斑变性（AMD）。细胞治疗是目前提出用于治疗这些疾病最有前景的治疗策略之一，并已在人体中获得初步的积极结果。然而，移植物的制备方法对其在体内的功能效果具有显著影响。in vivo研究表明，以细胞悬液形式移植的RPE细胞，其功能表现低于以视网膜组织形式移植的相同细胞。本文介绍一种简单且可重复的RPE组织工程方法及其用于in vivo移植的制备流程。由人多能干细胞衍生的RPE细胞被接种于一种生物载体——人羊膜（hAM）上。与人工支架相比，该载体的优势在于其具有接近布鲁赫膜（Bruch's membrane）的基底膜结构，而内源性RPE细胞正是附着于布鲁赫膜上。然而，hAM的操作较为困难，因此我们开发了多种策略以实现其在体外的正确培养及用于in vivo移植前的适当处理。

人羊膜（hAM）含有上皮层，在接种视网膜色素上皮（RPE）细胞前应将其去除。通过在振荡条件下使用嗜热菌蛋白酶（thermolysin）对膜进行酶处理。为避免丢失膜的方向性（上皮层位于一侧），需将膜固定在支撑物上，支撑物的材质可能因供应商而异（图1A）。在此步骤中检查膜与支撑物之间的粘附情况，必要时添加夹子固定。将膜固定于培养插件时，操作应轻柔，避免在膜上产生孔洞，并保持其极性，使基底膜面朝上（图1B）。当细胞接种到膜上时，若存在孔洞，细胞可能从孔洞中逸出，导致最终细胞浓度降低。可通过显微镜观察，或向培养插件内加入磷酸盐缓冲液（PBS）并检查是否有渗漏，来判断是否存在孔洞。任何有孔洞的膜均应弃用。
在培养插件固定后，通过相差显微镜评估膜上是否存在残留细胞（图1C 和 1D</strong...

我们描述了一种构建视网膜组织的方法，该组织由人多能干细胞分化而来的视网膜色素上皮细胞组成，并将其培养于人羊膜上，进而制备用于动物模型移植的移植物。

眼部的多种病理状况会影响视网膜色素上皮（RPE）的功能和/或存活。这些疾病包括某些类型的……

该方法有助于回答有关眼睛自我修复的关键问题，例如特异性设计的生物工程组织在体内的疗效如何。通过该技术，我们提供了一种制备和塑形视网膜组织的方法，以及在动物模型中对组织进行眼内植入前处理的策略。首先，清洗一至四片尺寸为30×30 mm的人羊膜（hAM）组织。在250 ml瓶中，将尼龙支架用80 ml PBS在摇床上以高速振荡洗涤两次，每次5分钟。第二次洗涤后，向每个瓶中加入40 ml工作浓度的嗜热菌蛋白酶（Thermolysin）溶液，在450 rpm条件下振荡处理两次，每次5分钟，随后涡旋振荡30秒。完成第二次嗜热菌蛋白酶处理后，按照上述方法再用80 ml PBS洗涤两次。然后，使用长柄无菌镊子将人羊膜（hAMs）逐个转移至含有10 ml PBS的10 cm培养皿中。接着，将一张羊膜（尼龙面朝下）放入另一盛有PBS的10 cm培养皿中，并松开固定羊膜与尼龙布的四个夹子中的两个。将培养插件的小环插入尼龙布与羊膜之间，确保羊膜完全覆盖小环。将培养插件的第二部分夹到膜的顶部，使hAM的基底膜朝上，然后取下最后两个夹子。根据需要使用无菌剪刀修剪培养插件外的多余膜组织。再用镊子将膜转移至含有PBS的12孔板中的一个孔内，在37°C和5%CO2条件下保存。接种前，将含有3ml RPE培养基和1×10⁶个RPE细胞的冻存管在15ml锥形管中预热，每管对应一支冻存管。细胞解冻后，用移液器吹打使每管中的细胞成为单细胞悬液，并通过台盼蓝染色排除法计数活细胞数量。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于新鲜RPE培养基中，调整细胞浓度至7×10⁵个细胞/毫升。接下来，吸去已准备好的12孔板中每孔的PBS，向每个培养插件的中心加入500 µL细胞，向每孔底部加入1 mL RPE培养基。然后将该培养板放回细胞培养箱中培养30天，每周更换培养基两次，直至培养结束。在培养第30天时，将8%明胶溶液置于37°C水浴中预热30分钟。将4°C的CO2非依赖性培养基注入振动切片机的内腔。使用手术刀从4°C保存的20%明胶块上切取一块5 cm × 5 cm的组织块。使用适当的粘合剂将该组织块的上表面固定在支撑物上。将新刀片放入振动切片机中。调整样品块，使其与剃须刀片处于同一水平位置，并用新鲜的4℃ CO2非依赖性培养基填充样品托周围的浴槽。以中等速度切割样品块，直至其被均匀切割且前端表面平滑，然后将位置设为零。然后吸去明胶周围的培养基，直至明胶完全干燥。用镊子小心地将接种了视网膜色素上皮（RPE）的培养插件打开并置于组织块上方。用剪刀切除插入环外的所有膜，吸除残留培养基的全部体积。加入最多 1 ml 的 8% 液体明胶溶液至膜表面，直至完全覆盖。小心去除多余的明胶。五到八分钟后，向浴槽中加入新鲜的 4°C CO2 独立培养基，直至覆盖已凝固的膜。将振切片机设置在100微米位置，以中等速度切割膜组织，注意保

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

从人胚胎干细胞中提取合适的视网膜色素上皮组织的工程移植

由干细胞衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞可用于多种应用，包括针对视网膜变性的细胞治疗、疾病建模以及药物研究。本文介绍一种简单且可重复地从干细胞分化获得RPE细胞的实验方案。...

高效诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞

本文以多媒体形式展示了一种被学术界广泛认可的在大鼠和小鼠中进行视网膜下腔注射RPE细胞悬液的实验方案。该方法可用于评估移植的RPE细胞在视网膜变性动物模型中的挽救潜力、安全性以及存活能力。...

在啮齿类动物中进行视网膜下注射以递送悬浮的视网膜色素上皮细胞

本报告的目的是描述利用不同大小的拟胚体从诱导多能干细胞（iPS细胞）分化获得视网膜色素上皮（RPE）的实验方案。...

通过不同大小的拟胚体从诱导性多能干细胞（iPS细胞）中分化视网膜色素上皮细胞（RPE）

视网膜下注射已广泛应用于年龄相关性黄斑变性干细胞替代治疗的临床前研究。在本可视化文章中，我们描述了一种经巩膜途径向大鼠眼内递送细胞的、风险更低、可重复且精确改良的视网膜下注射技术。...

开发一种优化的大鼠眼经巩膜视网膜下人视网膜色素上皮细胞移植方案

本方案描述了如何从多能干细胞诱导生成视网膜色素上皮细胞（RPE）。该方法通过联合使用生长因子和小分子化合物，在14天内将干细胞定向分化为未成熟RPE，并在三个月后获得成熟且具有功能的RPE细胞。...

人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的快速定向分化

关键词：视网膜色素上皮细胞，人胚胎干细胞，诱导性多能干细胞，定向分化，干细胞分化，眼发育，细胞治疗

视网膜色素上皮细胞可作为干性年龄相关性黄斑变性晚期的细胞替代疗法。本方案描述了地理样萎缩的大眼模型的建立，以及将人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植至该疾病模型的视网膜下腔的过程。...

地理萎缩大眼模型中人胚胎干细胞来源的视网膜色素上皮细胞的视网膜下移植

关键词：人胚胎干细胞，视网膜色素上皮细胞，地理萎缩，视网膜下移植，大眼模型

本文介绍了一种将人多能干细胞（hPSC）来源的视网膜组织移植到大型动物模型视网膜下腔的外科手术技术。...

在猫科大型动物模型中进行人胚胎干细胞来源视网膜组织的视网膜下移植

本文介绍了一种从多种哺乳动物（小鼠、大鼠、兔、猪和牛）中分离并转染原代虹膜和视网膜色素上皮细胞的实验方案。该方法非常适用于在多种实验条件下开展眼部基因治疗的研究，可用于可转化至人类的离体 分析以及 在体研究。...

分离、培养及遗传改造哺乳动物原代色素上皮细胞用于非病毒基因治疗

非人灵长类动物（NHP）由于其在解剖结构和遗传上的相似性，是研究人类视网膜细胞治疗的理想模型。本文描述了一种在NHP眼球中进行黄斑下视网膜色素上皮细胞移植的方法，以及预防与黄斑操作相关的术中并发症的策略。...

退行性视网膜疾病非人灵长类动物模型中的视网膜色素上皮移植

本方案介绍了一种经瞳孔视觉引导的经巩膜入路，可安全、精确地向患有或不患有视网膜变性的受体小鼠递送视网膜下细胞移植物，且手术并发症发生率较低。...

视网膜变性小鼠模型中经瞳孔引导的经巩膜下视网膜下移植术

我们描述了一种详细的方案，用于制备经冷冻保存后的hESC来源的视光感受器前体细胞，并将其移植到rd10小鼠的视网膜下腔。...

视网膜下移植人胚胎干细胞来源的光感受器前体细胞至 rd10 小鼠

学习利用人羊膜支架培养人多能干细胞来源的视网膜色素上皮细胞，构建适合移植的视网膜组织。该方法为视网膜疾病治疗和组织工程研究提供了标准化方案。

由人胚胎干细胞衍生的适用于移植的视网膜色素上皮组织的构建

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