由人胚胎干细胞衍生的适用于移植的视网膜色素上皮组织的构建

该方法有助于回答有关眼睛自我修复的关键问题，例如特异性设计的生物工程组织在体内的疗效如何。通过该技术，我们提供了一种制备和塑形视网膜组织的方法，以及在动物模型中对组织进行眼内植入前处理的策略。首先，清洗一至四片尺寸为30×30 mm的人羊膜（hAM）组织。

在250 ml瓶中，将尼龙支架用80 ml PBS在摇床上以高速振荡洗涤两次，每次5分钟。第二次洗涤后，向每个瓶中加入40 ml工作浓度的嗜热菌蛋白酶（Thermolysin）溶液，在450 rpm条件下振荡处理两次，每次5分钟，随后涡旋振荡30秒。完成第二次嗜热菌蛋白酶处理后，按照上述方法再用80 ml PBS洗涤两次。

然后，使用长柄无菌镊子将人羊膜（hAMs）逐个转移至含有10 ml PBS的10 cm培养皿中。接着，将一张羊膜（尼龙面朝下）放入另一盛有PBS的10 cm培养皿中，并松开固定羊膜与尼龙布的四个夹子中的两个。将培养插件的小环插入尼龙布与羊膜之间，确保羊膜完全覆盖小环。

将培养插件的第二部分夹到膜的顶部，使hAM的基底膜朝上，然后取下最后两个夹子。根据需要使用无菌剪刀修剪培养插件外的多余膜组织。再用镊子将膜转移至含有PBS的12孔板中的一个孔内，在37°C和5%CO2条件下保存。

接种前，将含有3ml RPE培养基和1×10⁶个RPE细胞的冻存管在15ml锥形管中预热，每管对应一支冻存管。细胞解冻后，用移液器吹打使每管中的细胞成为单细胞悬液，并通过台盼蓝染色排除法计数活细胞数量。通过离心收集细胞，并将沉淀重悬于新鲜RPE培养基中，调整细胞浓度至7×10⁵个细胞/毫升。

接下来，吸去已准备好的12孔板中每孔的PBS，向每个培养插件的中心加入500 µL细胞，向每孔底部加入1 mL RPE培养基。然后将该培养板放回细胞培养箱中培养30天，每周更换培养基两次，直至培养结束。在培养第30天时，将8%明胶溶液置于37°C水浴中预热30分钟。

将4°C的CO2非依赖性培养基注入振动切片机的内腔。使用手术刀从4°C保存的20%明胶块上切取一块5 cm × 5 cm的组织块。使用适当的粘合剂将该组织块的上表面固定在支撑物上。

将新刀片放入振动切片机中。调整样品块，使其与剃须刀片处于同一水平位置，并用新鲜的4℃ CO2非依赖性培养基填充样品托周围的浴槽。以中等速度切割样品块，直至其被均匀切割且前端表面平滑，然后将位置设为零。

然后吸去明胶周围的培养基，直至明胶完全干燥。用镊子小心地将接种了视网膜色素上皮（RPE）的培养插件打开并置于组织块上方。用剪刀切除插入环外的所有膜，吸除残留培养基的全部体积。

加入最多 1 ml 的 8% 液体明胶溶液至膜表面，直至完全覆盖。小心去除多余的明胶。五到八分钟后，向浴槽中加入新鲜的 4°C CO2 独立培养基，直至覆盖已凝固的膜。

将振切片机设置在100微米位置，以中等速度切割膜组织，注意保持组织的方向性。用解剖刀切去组织片的一角，以便识别切片的方向。使用刮勺将明胶包埋的膜组织转移至六孔板中的一个孔内，孔中已加入4°C的保存液。

由于切割角部前组织片可能发生自由移动，其方向可能会颠倒。因此，在切片完成后应立即固定其位置。随后可在手术显微镜下根据受体眼球的大小调整移植片的尺寸，再进行移植。

通常在培养插件上固定后，膜表面仍残留少量死细胞，但这些细胞会在更换培养基时被清除。当无细胞残留时，在更高倍镜下可观察到基底膜的纤维结构，表明热蛋白酶处理时间已优化。随着视网膜上皮细胞的成熟，其在显微镜下更易观察，在三周时形成完整的鹅卵石样单层结构。

四周后，上皮组织已发育成熟，可进行移植准备。进行该操作时，需注意明胶的状态受温度影响，因此务必严格遵循推荐的温度条件。

该技术建立后，为干细胞治疗领域的研究人员探索视网膜色素变性动物模型中生物工程组织的治疗潜力铺平了道路。尽管该方法可用于在支架上制备组织以进行后续移植，但它也可应用于包含光感受器层的更复杂系统。通常，初学者在操作过程中会遇到困难，主要原因是人羊膜非常薄且易于折叠，难以处理。

该方法的可视化演示至关重要，因为人羊膜固定和明胶包埋步骤难以掌握，且需要特定的操作手法。