Name: 用三种互补方法综合评价胎盘靶向药物的有效性和安全性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学习使用活体成像、高频超声和高效液相色谱三种互补方法，在妊娠小鼠模型中综合评价胎盘靶向纳米药物的有效性与安全性，为胎盘介导的妊娠并发症治疗提供精准递送策略。

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本工作获得了国家自然科学基金（81771617）和广东省自然科学基金（2016A030313178）对 X.F. 的资助；深圳市基础研究基金（JCYJ20170413165233512）对 X.F. 的资助；以及尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发育研究所 &amp;#38; 美国国立卫生研究院人类发展研究所资助编号 R01HD088549（本内容由作者全权负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点）至 N.N.

所有小鼠实验均严格遵循中国科学院深圳先进技术研究院动物护理和使用委员会批准的方案（SIAT-IRB-160520-YYS-FXJ-A0232）。
1. 靶向胎盘硫酸软骨素A的脂质-聚合物纳米颗粒的合成
<ol>
	<li>按照文献中详细描述的方法，合成载有MTX和ICG的脂质-聚合物纳米颗粒（分别为MNPs和INPs）以及plCSA-BP偶联的纳米颗粒（plCSA-MNPs和plCSA-INPs）18。</li>
</ol>
2. 体内 荧光成像
<ol>
	<li>孕鼠的准备
	<ol>
		<li>将雌性CD-1小鼠（8–12周龄）与同品系的可育雄鼠按1:2的比例（雄:雌）于下午放入同一笼中，次日清晨检查阴道栓。若观察到阴道栓，则将该小鼠定义为胚胎发育第0.5天（E0.5）。</li>
		<li>将怀孕小鼠单独饲养于无病原体动物房中，保持14小时光照/10小时黑暗的循环条件，并自由摄食和饮水，直至E14.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纳米颗粒的静脉注射
	<ol>
		<li>操作前，通过0.22 μm注射器滤器过滤对纳米颗粒进行灭菌。在E11.5时称量孕鼠体重，以确定纳米颗粒注射的剂量和体积。 
		注意：纳米颗粒注射体积应小于孕鼠体重的1%（体积/体重）。例如，25 g小鼠的纳米颗粒注射体积应小于0.25 mL。</li>
		<li>为扩张尾静脉，使用加热垫对尾部加热5–10分钟。</li>
		<li>注射前，用28号胰岛素注射器吸取INPs或plCSA-INPs。</li>
		<li>将孕鼠转移至固定装置中，使其固定并暴露尾静脉。用酒精棉片清洁尾部，随后将注射器刺入尾静脉。在5–10秒内以均匀压力缓慢注射INPs或plCSA-INPs（ICG等效剂量为5 mg/kg）。 
		注意：若尾部出现水疱，应立即停止注射，此现象表明针头未进入静脉。不同小鼠之间不得共用注射器，以最大限度减少疾病传播和交叉污染。</li>
		<li>记录注射时间。同时，对注射部位施加轻柔压力直至出血停止，通常需要30–60秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活体成像
	<ol>
		<li>注射后30分钟，使用活体荧光成像系统对孕鼠进行成像。</li>
		<li>在麻醉机的诱导室中，以1.0 L/min的氧气流速和2–4%异氟烷对孕鼠进行麻醉，并通过观察其呼吸是否缓慢且规律来确认麻醉完全。随后将小鼠转移至成像室，将其保持仰卧位放置于成像腔内。</li>
		<li>将鼻罩覆盖于口鼻处，以1.0 L/min的氧气流速供给1–2%异氟烷，维持麻醉状态。</li>
		<li>选择2D荧光和摄影参数以采集ICG荧光信号。将曝光模式设为自动，激发/发射波长设为710/820 nm。</li>
		<li>成像结束后，关闭异氟烷气流以终止麻醉，并小心将孕鼠放回饲养笼中。</li>
		<li>在纳米颗粒注射后48小时，使用异氟烷麻醉孕鼠，随后通过颈椎脱臼法处死母鼠。使用Graefe镊、Graefe组织镊和解剖剪收集胎鼠和胎盘。</li>
		<li>将胎盘和胎鼠放入成像腔中，按照步骤2.3.4所述方法进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 胚胎发育的高频超声评估
<ol>
	<li>动物模型
	<ol>
		<li>按照步骤 2.1 所述获取并准备怀孕小鼠。</li>
		<li>在 E6.5 天使用高频超声（HFUS）对怀孕小鼠进行成像（见方案 3.2 和 3.3.3）。首先在 E6.5 天通过可视化胚胎确认妊娠，然后将怀孕小鼠随机分为三组：MNP 组、plCSA-MNP 组和磷酸盐缓冲盐水（PBS）组。</li>
		<li>从 E6.5 天开始，每隔一天通过尾静脉向怀孕小鼠注射 PBS、MNPs 或 plCSA-MNPs（相当于 1 mg/kg MTX），具体操作见步骤 2.2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像前准备
	<ol>
		<li>在注射纳米颗粒 24 小时后，使用 HFUS 成像系统对怀孕小鼠进行成像。</li>
		<li>按照步骤 2.3.2 所述对怀孕小鼠进行麻醉。打开成像平台的集成温控系统，并将平台预热至 37–42 °C。用胶带将怀孕小鼠固定在平台上，保持仰卧位。</li>
		<li>将连接至麻醉机的鼻罩覆盖在小鼠口鼻部。使用 2% 异氟烷，氧气流速为 1.0 L/min，以维持稳定的麻醉状态。</li>
		<li>使用脱毛膏对腹部进行化学脱毛。用浸水纱布彻底擦除残留的脱毛膏，然后在腹部涂抹超声耦合凝胶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像操作流程
	<ol>
		<li>将 40 MHz 探头安装至机械臂上。</li>
		<li>调整探头位置，使胎儿和胎盘的纵向图像显示在焦点区域内。</li>
		<li>B 模式成像与分析 
		注：参见 视频 1。
		<ol>
			<li>点击 B 模式 按钮，将探头缓慢下移至腹部，直至显示胎儿和胎盘图像。按下 扫描/冻结 按钮以开始或停止成像，按下 动态存储 按钮保存动态图像序列，按下 帧存储 按钮保存单帧图像。</li>
			<li>点击 测量 按钮，分析孕囊长度（GS）、胎儿顶臀长（CRL）、双顶径（BPD）、腹围（AC）、胎盘直径（PD）和胎盘厚度（PT）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PW 多普勒成像与分析 
		注：参见 视频 1。
		<ol>
			<li>在相同扫描切面上，点击 PW 按钮，将取样容积框置于脐动脉中央，按下 扫描/冻结 按钮开始成像。点击 动态存储 按钮采集脐动脉图像。</li>
			<li>点击 测量 按钮，计算脐动脉峰值流速（UA）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>彩色多普勒模式成像与分析
		<ol>
			<li>在相同扫描切面上，点击 彩色 按钮，调整探头位置以获得胎儿心脏图像。按下 扫描/冻结 按钮开始成像，按下 动态存储 按钮采集图像。</li>
			<li>点击 测量 按钮，计算胎儿心率（HR）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 高效液相色谱分析
<ol>
	<li>组织准备
	<ol>
		<li>在妊娠晚期（例如，E14.5）按照步骤3.1.3所述方法，对怀孕小鼠单次注射MNPs或plCSA-MNPs（相当于1 mg/kg MTX剂量）。 </li>
		<li>24小时后，通过腹腔注射240 μg/克体重的戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉。通过足部夹捏测试确认无反应，以确保小鼠已完全麻醉。 </li>
		<li>用75%乙醇喷洒胸部区域。按照先前详细描述的方法19,20进行心脏灌流（剪开右心房，从左心室灌流），使用50 mL冰冻的0.9%生理盐水持续灌流10分钟，以清除未结合的纳米颗粒。 </li>
		<li>处死母鼠。使用格拉夫镊子、解剖剪和格拉夫组织镊进行剖宫产，取出胎儿和胎盘，并将组织在分析前储存于-80 °C。 </li>
		<li>配制匀浆液（10%高氯酸），并置于冰上保存。每份样品取约200 mg组织，加入500 μL匀浆液。使用匀浆器以全速匀浆30秒，重复该操作两次。 </li>
		<li>在4 °C条件下以14,000 ×g离心20分钟。将上清液（约300 μL）通过0.45 μm注射器滤膜过滤，转移至HPLC小瓶中。将样品小瓶放入自动进样器托盘中待进样。 </li>
	</ol>
	</li>
	<li>标准品制备
	<ol>
		<li>配制流动相溶液：40 mM磷酸氢二钾（pH 4.5）与乙腈（88:12, v/v）。将溶液通过0.45 μm孔径的注射器滤膜过滤后，转移至洁净的HPLC储液瓶中。 
		注意：使用0.1 M磷酸调节pH值。每次使用前需超声振荡15分钟以脱气。 </li>
		<li>称取10 mg MTX置于1.5 mL离心管中，加入1 mL 1 M氢氧化钠。 </li>
		<li>高速涡旋振荡直至MTX完全溶解。 
		注意：此为初级储备液，可在-20 °C保存数月。 </li>
		<li>为制备次级MTX储备液（500 μg/mL），取50 μL初级储备液加入950 μL流动相中稀释。 
		注意：使用前置于冰上保存，且需每日新鲜配制。使用流动相配制标准品至关重要，以避免样品进样后因不同溶液混合而产生额外峰。 </li>
		<li>进一步稀释以制备标准品（表1）。标准品应置于冰上保存，并每日新鲜配制。实验样品应与标准品系列同时运行。 </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>编号</td>
			<td>终浓度 (μg/mL)</td>
			<td>500 μg/mL 标准品, μL</td>
			<td>流动相(μL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1</td>
			<td>999</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>998</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3</td>
			<td>2.5</td>
			<td>5</td>
			<td>995</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>980</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
			<td>950</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6</td>
			<td>50</td>
			<td>100</td>
			<td>900</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>100</td>
			<td>200</td>
			<td>800</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1. 甲氨蝶呤标准曲线的制备。 甲氨蝶呤标准溶液的终浓度范围为0.5–100 μg/mL。
<ol start="3">
	<li>HPLC 仪器与操作参数 
	注意：样品在配备溶剂泵、紫外分光光度检测器（313 nm）和 C18 色谱柱（250×4.6 mm，5 μm 粒径）的 HPLC 系统上进行分析。
	<ol>
		<li>开启 HPLC 脱气装置，以去除系统中的空气。开启流动相流速，用流动相平衡色谱柱 30 分钟，以降低基线噪声。</li>
		<li>将色谱柱温度设置为 25 °C，以 1 mL/min 的流速进样 20 μL 样品体积，并点击 运行方法 开始分析。</li>
		<li>运行结束后，手动将流动相更换为 HPLC 级乙腈，继续运行约 15 分钟以保护系统。 
		注意：若未在推荐的运行时间后执行此步骤，可能导致色谱柱损坏。</li>
		<li>进行定量分析时，使用 HPLC 系统软件计算目标标准甲氨蝶呤（MTX）峰的峰面积。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rodger, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Association+of+Factor+V+Leiden+and+Prothrombin+Gene+Mutation+and+Placenta-Mediated+Pregnancy+Complications%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-analysis+of+Prospective+Cohort+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Association of Factor V Leiden and Prothrombin Gene Mutation and Placenta-Mediated Pregnancy Complications: A Systematic Review and Meta-analysis of Prospective Cohort Studies.</a> PLOS Medicine. 7 (6), e1000292(2010).</li>
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<li>Paul, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+delivery+to+the+human+and+mouse+uterus+using+immunoliposomes+targeted+to+the+oxytocin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Obstetrics+and+Gynecology%22%5BJournal%5D)">Drug delivery to the human and mouse uterus using immunoliposomes targeted to the oxytocin receptor.</a> American Journal of Obstetrics and Gynecology. 216 (3), e281-e283 (2017).</li>
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<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+doxorubicin+by+CSA-binding+nanoparticles+for+choriocarcinoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of doxorubicin by CSA-binding nanoparticles for choriocarcinoma treatment.</a> Drug Delivery. 25 (1), 461-471 (2018).</li>
<li>Jenkins, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+imaging+%28BLI%29+to+improve+and+refine+traditional+murine+models+of+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent imaging (BLI) to improve and refine traditional murine models of tumor growth and metastasis.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 20 (8), 733-744 (2003).</li>
<li>Keelan, J. A., Leong, J. W., Ho, D., Iyer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+and+safety+considerations+of+nanoparticle-mediated+drug+delivery+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Therapeutic and safety considerations of nanoparticle-mediated drug delivery in pregnancy.</a> Nanomedicine. 10 (14), 2229-2247 (2015).</li>
</ol>

X.F. 和 B.Z. 是中国科学院深圳先进技术研究院提交的专利申请 PCT/CN2017/108646 的发明人，该专利申请涵盖一种胎盘特异性药物递送方法及其应用。其他所有作者声明不存在利益冲突。

在本文中，我们提出了一种三方法体系，用于确定plCSA-BP引导的纳米颗粒是否为将药物靶向递送至胎盘的有效工具。体内成像技术通过监测红外荧光ICG信号，证实了plCSA-BP具有胎盘靶向特异性。利用高频超声（HFUS）和高效液相色谱法（HPLC），我们证明了与plCSA-BP偶联的纳米颗粒能够将甲氨蝶呤（MTX）高效递送至胎盘细胞，而不会递送至胎儿。
在 在体内 荧光成像实验中，妊娠小鼠的孕龄至关重要。胎盘大约在E9.5开始形成21此外，考虑到成像仪的分辨率， 体内 成像实验应在E10.5之后进行。根据本方案在E11.5注射plCSA-INP后，在所述条件下成像仪未检测到荧光信号，这可能是由于皮肤和内脏组织阻碍了信号传递所致22为克服这一局限，可增加注射剂量或收集更多胎盘和胎儿样本 离体 必须使用成像技术。
高频超声成像的关键步骤之一是使用合适的换能器以获得高质...

胎盘介导的妊娠并发症，包括子痫前期、妊娠丢失、胎盘早剥和小于胎龄儿（SGA），较为常见，并导致显著的胎儿和孕产妇发病率和死亡率1,2,3，而目前仅有极少数药物被证实对治疗妊娠相关疾病有效4,5。在现代药物治疗中，开发更具选择性和安全性的靶向胎盘药物递送策略仍面临挑战。
近年来，多项研究聚焦于通过用肽或抗体包被纳米颗粒作为靶向胎盘的工具，实现药物向子宫胎盘组织的靶向递送。这些工具包括抗表皮生长因子受体（EGFR）6抗体、肿瘤归巢肽（CGKRK和iRGD）7、胎盘靶向肽8、胎盘血管靶向肽9以及抗催产素受体抗体10。
在此，我们证明了一种合成的胎盘硫酸软骨素A结合肽（plCSA-BP）可用于将纳米颗粒及其药物有效载荷靶向递送至胎盘11。plCSA-BP引导的纳米颗粒与已报道的子宫胎盘靶向方法相辅相成，因其可靶向胎盘滋养层细胞。
作为一种非侵入性方法， 体内 成像技术已被用于监测小鼠胎盘特异性基因表达12，且吲哚菁绿（ICG）已广泛用于通过荧光成像系统追踪纳米颗粒13,14,15因此，我们通过静脉注射负载吲哚菁绿（ICG）的plCSA-BP偶联纳米颗粒（plCSA-INPs），利用荧光成像仪观察plCSA-INPs在妊娠小鼠体内的分布情况。随后，我们将负载甲氨蝶呤（MTX）的plCSA-NPs通过静脉注射给予妊娠小鼠。高频超声（HFUS）是另一种无创、实时的成像工具。16,17 用于监测小鼠胎儿和胎盘的发育情况。最后，我们采用高效液相色谱法（HPLC）定量分析甲氨蝶呤（MTX）在胎盘和胎儿中的分布。
在本实验方案中，我们详细描述了用于评估由plCSA-BP引导的纳米载体实现胎盘靶向药物递送效率的三种方法体系。

<table><tbody><tr><td>CD-1 小鼠</td><td>Beijing Vital River</td><td>201</td><td>雌性（8–12 周龄）</td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>BD</td><td>328421</td><td>用于静脉注射</td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>10009218</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>大豆卵磷脂</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>441601</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>DSPE-PEG-COOH</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880125</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>PLGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719897</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>超声波处理器</td><td>Sonics</td><td>VCX130</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>甲氨蝶呤（MTX）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900324</td><td>用于纳米颗粒合成</td></tr><tr><td>吲哚菁绿（ICG）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1340009</td><td>用于活体成像</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30028.01</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 光谱成像仪</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>用于活体成像</td></tr><tr><td>超声耦合剂</td><td>Guanggong</td><td>ZC4252418</td><td>用于超声成像</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Lunan Pharmaceutical</td><td>I0040</td><td>用于维持麻醉</td></tr><tr><td>脱毛膏</td><td>Nair</td><td>TMG001</td><td>用于去除毛发</td></tr><tr><td>40 MHz 探头</td><td>VisualSonics</td><td>MS550S</td><td>用于超声成像</td></tr><tr><td>高频超声成像系统</td><td>VisualSonics</td><td>Vevo2100</td><td>用于超声成像</td></tr><tr><td>戊氨基脲（Avertin）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Mindray</td><td>SK-500III</td><td>用于心脏灌注</td></tr><tr><td>0.9% 生理盐水溶液</td><td>Meilunbio</td><td>MA0083</td><td>用于心脏灌注</td></tr><tr><td>1.5 mL 聚丙烯管</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>-80 &amp;deg;C 冰箱</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88600V</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Cence</td><td>H1650R</td><td></td></tr><tr><td>高氯酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>311421</td><td>用于蛋白质沉淀</td></tr><tr><td>组织匀浆器</td><td>SCIENTZ</td><td>SCIENTZ-48</td><td>用于组织匀浆</td></tr><tr><td>注射器滤器（0.45 &amp;mu;m）</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS01</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>10019763</td><td>用于溶解 MTX</td></tr><tr><td>HPLC 小瓶</td><td>Waters</td><td>670650620</td><td>用于 HPLC</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sinopharm Chemical</td><td>20032117</td><td>用于 HPLC</td></tr><tr><td>乙腈</td><td>JKchemical</td><td>932537</td><td>用于 HPLC</td></tr><tr><td>C18 色谱柱</td><td>Waters</td><td>186003966</td><td>用于 HPLC</td></tr><tr><td>HPLC 系统</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>用于 HPLC</td></tr></tbody></table>

综合评估胎盘靶向药物递送的有效性与安全性的三种互补方法

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

目前尚无针对胎盘相关妊娠并发症的有效治疗方法，而开发能够将药物靶向递送至胎盘、同时尽量减少对胎儿和母体副作用的策略仍面临挑战。靶向纳米颗粒载体为治疗胎盘疾病提供了新的机遇。我们近期证明，一种合成的胎盘硫酸软骨素A结合肽（plCSA-BP）可用于引导纳米颗粒将药物递送至胎盘。在本实验方案中，我们详细描述了一种评估plCSA-BP介导药物向胎盘递送效率的系统，该系统联合使用三种独立方法：体内成像、高频超声（HFUS）和高效液相色谱法（HPLC）。通过体内成像技术，可在活体动物胎盘中观察到plCSA-BP引导的纳米颗粒；而HFUS和HPLC结果表明，与plCSA-BP偶联的纳米颗粒能够高效且特异性地将甲氨蝶呤递送至胎盘。因此，这三种方法的联合应用可作为实现药物靶向递送至胎盘的有效工具，并有助于开发多种妊娠并发症的新型治疗策略。

在本研究中，将负载MTX（plCSA-MNPs）或ICG（plCSA-INPs）的plCSA-BP偶联纳米颗粒经尾静脉注射入妊娠小鼠体内。体内成像显示，注射plCSA-INPs后30分钟，子宫区域出现强烈的ICG信号。INPs主要分布于肝脏和脾脏区域（图1A）。注射plCSA-INPs 48小时后，处死妊娠小鼠，发现ICG信号仅存在于胎盘中，而在胎儿中未检测到任何信号（图1B）。
随后，我们采用高频超声（HFUS）监测静脉注射纳米颗粒后胚胎的发育情况。生物测量指标包括孕囊长度（GS）、胎儿顶臀长（CRL）、双顶径（BPD）、腹围（AC）、胎盘直径（PD）、胎盘厚度（PT）、脐动脉峰值流速（UA）和胎儿心率（HR）（视频 1）。不同孕龄测得的形态学参数列于表 2</st...

我们介绍一种利用三种方法评估靶向胎盘药物递送安全性和有效性的系统：体内成像用于监测纳米颗粒的聚集，高频超声用于监测胎盘和胎儿发育，高效液相色谱法（HPLC）用于定量组织中的药物递送量。

目前尚无针对胎盘相关妊娠并发症的有效治疗方法，且尚缺乏将药物靶向递送至胎盘的策略。

该方法有助于解答纳米医学领域中关于负载药物的纳米颗粒递送至母体和胎儿后的有效性和安全性等关键问题。该技术的主要优势在于能够对递送至胎盘的药物量进行精确的生化测定。该技术的应用意义在于治疗由胎盘介导的妊娠并发症，因为确保药物递送能够精确定位于胎盘至关重要。该方法的可视化演示至关重要，因为掌握高频超声评估胚胎发育技术需要耐心和经验。进行静脉纳米颗粒注射时，将妊娠14.5天且尾静脉已扩张的小鼠转移至固定装置中，并用酒精棉片清洁尾部。然后将28号胰岛素注射器的针尖插入扩张的尾静脉，以均匀压力在5到10秒内缓慢推动活塞，将纳米颗粒注入尾静脉。注射后30分钟，将麻醉的孕鼠以仰卧位放入活体荧光成像系统的成像室中。选择二维荧光模式，并设置适合吲哚菁绿荧光信号成像的摄影参数，将曝光设为自动，激发波长和发射波长分别设为710和820纳米。随后对动物进行成像，并将孕鼠放回笼中。注射后48小时，使用Graefe镊子、Graefe组织镊和解剖剪收集胎鼠和胎盘，并对所获取的组织进行成像，成像方法如前所述对整只动物的操作。为进行高频超声评估胚胎发育情况，在注射纳米颗粒24小时后，将麻醉的妊娠母鼠仰卧位固定于预热至37至42摄氏度的超声成像平台上，并将40兆赫兹探头安装至机械臂上。随后调整探头位置，以获得胎鼠和胎盘的纵向图像，并确保感兴趣区域位于焦点范围内。进行B型成像和分析时，选择B型模式，将探头下移至腹部，直至胎儿和胎盘清晰可见。点击扫描/冻结以开始和停止成像，点击 cine 存储以保存动态序列，点击帧存储以保存单帧图像。然后点击测量，以分析孕囊长度、胎儿顶臀长、双顶径、腹围、胎盘直径和胎盘厚度。进行脉冲波多普勒成像与分析时，使用相同的扫描切面，首先点击“Color”，然后选择“Pulse Wave”，并将取样容积框置于脐动脉的中心。点击“Scan/Freeze”开始成像，再点击“Cine Store”以采集脐动脉图像。随后点击“Measure”以计算脐动脉的峰值流速。进行彩色多普勒模式成像与分析时，使用相同的扫描切面，点击“Color”（彩色），并调整探头位置以获得如图所示的胎儿心脏图像。然后点击“Measure”（测量）以计算所存储动态图像序列中的胎儿心率。对于高效液相色谱（HPLC）分析，首先如图所示，向妊娠14.5天的小鼠单次注射纳米颗粒。24小时后，用50毫升冰冻的0.9%生理盐水对怀孕动物的心脏灌注10分钟，以清除任何未结合的纳米颗粒，并收集胎鼠和胎盘，于-80摄氏度保存。分析当天，向每份200毫克的组织样品中加入500微升新配制的匀浆液，以最大速度匀浆两次，每次解离30秒。第二次匀浆后，离心样品，并将上清液通过0.45微米注射器滤膜过滤至高效液相色谱（HPLC）样品瓶中。将样品瓶放入自动进样器样品盘中准备进样，并开启高效液相色谱脱气装置以去除系统中的空气。接着，打开流动相

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用三种互补方法综合评价胎盘靶向药物的有效性和安全性

双胎输血综合征和双胎贫血-红细胞增多序列征是围产期医学中两种可能具有毁灭性后果的疾病。这两种疾病均仅发生于单绒毛膜双胎，其病因是通过胎盘血管吻合支的血流不平衡所致。我们提供一种简单方案，通过出生后向胎盘血管注射彩色染料，以准确评估血管吻合支的存在情况。...

使用彩色染料对单绒毛膜胎盘中的血管吻合进行准确而简单的评估

利用胎盘评估外源性物质和纳米材料转运速率的方法 离体 人胎盘灌注模型

离体全器官成像是一种快速确定组织内或不同处理组之间荧光标记化合物相对浓度的方法。相比之下，定量荧光组织学虽然更为耗时，但能够对标记分子的组织绝对含量进行定量分析。...

使用 离体 全器官成像与定量组织组织学分析用于确定荧光标记分子的生物分布

我们介绍了一种在足月时研究人类胎盘生理学的详细方法。in...

四血管采样法在人类胎盘生理学整合研究中的应用 在体 内

本研究介绍了一种可逆组织透明化、免疫染色、三维成像及分析人胎盘绒毛样本中血管网络的实验方案，样本体积约为 1 - 2...

三维重建与分析免疫标记并透明化处理的人类胎盘小叶血管网络

本文介绍了一种胎盘硫酸软骨素A结合肽（plCSA-BP）偶联脂质-聚合物纳米颗粒的合成方案。 通过...

靶向胎盘硫酸软骨素A（plCSA）的脂质-聚合物纳米颗粒的合成与表征

本文提供了一种通过比色板法分离并评估胎盘来源的自然杀伤细胞毒功能的详细方法。选用子宫灌注压降低的大鼠胎盘缺血模型，以展示通过抗体介导的方法分离并评估自然杀伤细胞毒功能的过程。...

基于培养板的细胞毒性检测法用于评估大鼠胎盘自然杀伤细胞的杀伤功能

本文介绍了一种离体母胎血管灌注方案，可用于将待测物质注入母体血管系统，以评估外源性颗粒或药理学物质通过胎盘的转运情况，同时研究胎盘生理功能的变化。...

啮齿类动物胎盘的离体灌注

本文介绍了一种时间特异性方法，可有效调控小鼠胎盘中关键的发育通路...

小鼠 体内 胎盘靶向CRISPR操作

本方案旨在评估在低氧条件下培养胎盘外植体（模拟子痫前期的某一特征）所分离出的小细胞外囊泡（sEVs）是否会破坏非妊娠成年雌性小鼠的血脑屏障。...

缺氧人胎盘来源的小细胞外囊泡破坏小鼠血脑屏障

学习使用活体成像、高频超声和高效液相色谱三种互补方法，在妊娠小鼠模型中综合评价胎盘靶向纳米药物的有效性与安全性，为胎盘介导的妊娠并发症治疗提供精准递送策略。

综合评估胎盘靶向药物递送的有效性与安全性的三种互补方法

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