综合评估胎盘靶向药物递送的有效性与安全性的三种互补方法

该方法有助于解答纳米医学领域中关于负载药物的纳米颗粒递送至母体和胎儿后的有效性和安全性等关键问题。该技术的主要优势在于能够对递送至胎盘的药物量进行精确的生化测定。该技术的应用意义在于治疗由胎盘介导的妊娠并发症，因为确保药物递送能够精确定位于胎盘至关重要。

该方法的可视化演示至关重要，因为掌握高频超声评估胚胎发育技术需要耐心和经验。进行静脉纳米颗粒注射时，将妊娠14.5天且尾静脉已扩张的小鼠转移至固定装置中，并用酒精棉片清洁尾部。然后将28号胰岛素注射器的针尖插入扩张的尾静脉，以均匀压力在5到10秒内缓慢推动活塞，将纳米颗粒注入尾静脉。

注射后30分钟，将麻醉的孕鼠以仰卧位放入活体荧光成像系统的成像室中。选择二维荧光模式，并设置适合吲哚菁绿荧光信号成像的摄影参数，将曝光设为自动，激发波长和发射波长分别设为710和820纳米。随后对动物进行成像，并将孕鼠放回笼中。

注射后48小时，使用Graefe镊子、Graefe组织镊和解剖剪收集胎鼠和胎盘，并对所获取的组织进行成像，成像方法如前所述对整只动物的操作。为进行高频超声评估胚胎发育情况，在注射纳米颗粒24小时后，将麻醉的妊娠母鼠仰卧位固定于预热至37至42摄氏度的超声成像平台上，并将40兆赫兹探头安装至机械臂上。随后调整探头位置，以获得胎鼠和胎盘的纵向图像，并确保感兴趣区域位于焦点范围内。

进行B型成像和分析时，选择B型模式，将探头下移至腹部，直至胎儿和胎盘清晰可见。点击扫描/冻结以开始和停止成像，点击 cine 存储以保存动态序列，点击帧存储以保存单帧图像。然后点击测量，以分析孕囊长度、胎儿顶臀长、双顶径、腹围、胎盘直径和胎盘厚度。

进行脉冲波多普勒成像与分析时，使用相同的扫描切面，首先点击“Color”，然后选择“Pulse Wave”，并将取样容积框置于脐动脉的中心。点击“Scan/Freeze”开始成像，再点击“Cine Store”以采集脐动脉图像。随后点击“Measure”以计算脐动脉的峰值流速。

进行彩色多普勒模式成像与分析时，使用相同的扫描切面，点击“Color”（彩色），并调整探头位置以获得如图所示的胎儿心脏图像。然后点击“Measure”（测量）以计算所存储动态图像序列中的胎儿心率。对于高效液相色谱（HPLC）分析，首先如图所示，向妊娠14.5天的小鼠单次注射纳米颗粒。

24小时后，用50毫升冰冻的0.9%生理盐水对怀孕动物的心脏灌注10分钟，以清除任何未结合的纳米颗粒，并收集胎鼠和胎盘，于-80摄氏度保存。分析当天，向每份200毫克的组织样品中加入500微升新配制的匀浆液，以最大速度匀浆两次，每次解离30秒。第二次匀浆后，离心样品，并将上清液通过0.45微米注射器滤膜过滤至高效液相色谱（HPLC）样品瓶中。

将样品瓶放入自动进样器样品盘中准备进样，并开启高效液相色谱脱气装置以去除系统中的空气。接着，打开流动相流速，用流动相平衡色谱柱30分钟，以降低基线噪声，并将色谱柱温度设定为25摄氏度。然后在30分钟内以每分钟1毫升的流速进样20微升样品体积，点击“运行方法”开始分析。

运行完成后，手动将流动相更换为HPLC级乙腈，并运行乙腈约15分钟以保护系统。活体成像显示，在胎盘硫酸软骨素结合的荧光标记纳米颗粒注射后30分钟，子宫组织中出现强烈的吲哚菁绿信号，而未结合的纳米颗粒主要定位于肝脏和脾脏区域。注射后48小时，在注射了胎盘硫酸软骨素结合纳米颗粒的动物胎盘中可观察到荧光信号，而在胎儿体内未检测到任何信号。

高频超声监测注射了与硫酸软骨素结合的荧光标记纳米颗粒的动物，显示出关键胎儿及胎盘发育标志物显著减少。有趣的是，使用甲氨蝶呤结合的纳米颗粒处理也轻微损害了胎儿和胎盘的发育，表明纳米颗粒可能通过增强的通透性和滞留效应，提高了甲氨蝶呤向胎盘的递送效率。通过高效液相色谱法（HPLC）测定甲氨蝶呤浓度，结果显示在注射甲氨蝶呤结合纳米颗粒的小鼠胎盘中，甲氨蝶呤的保留时间为七分钟。

注射后24小时，甲氨蝶呤结合纳米颗粒注射组的胎盘甲氨蝶呤水平显著低于胎盘软骨素硫酸和甲氨蝶呤结合纳米颗粒组，且在后者的胎儿中未检测到甲氨蝶呤。在注射胎盘软骨素硫酸和甲氨蝶呤结合纳米颗粒48小时后，仍可在胎盘中检测到甲氨蝶呤，表明胎盘软骨素硫酸和甲氨蝶呤结合纳米颗粒无法穿过胎盘，从而最大限度地减少对胎儿的潜在不良影响。在进行该操作时，需注意胎盘大约在胚胎第9.5天开始形成，因此体内成像实验最好在胚胎第10.5天或之后进行。

完成此操作后，可进行免疫荧光染色和分析等其他方法，以进一步探究纳米颗粒在胎盘内的定位问题。该技术建立后，为生殖医学领域的研究人员探索妊娠并发症中靶向胎盘治疗的可能性奠定了基础。