基于寡核苷酸的串联 RNA 分离法恢复真核 mRNA-蛋白复合物

本文介绍了一种用于恢复内在形成的 mRNA 蛋白复合物的串联 RNA 分离过程 (跳闸)。具体来说, rna 蛋白复合物在体内交联, polyadenylated rna 与寡核苷酸 (dT) 珠提取物分离, 特殊基因用修饰 RNA 反义寡核苷酸捕获。通过应用免疫印迹分析, 检测到基因的蛋白质。

这种方法可以帮助回答基因表达调控领域的关键问题，例如 RNA 结合蛋白如何在体内组装到特定 RNA 上，从而施加转录后基因调控。这种技术的主要优点是它不需要任何克隆或基因作。它可以适应任何模式生物或亚型。

要设计寡核苷酸，请使用在线工具分析 mRNA 或其片段的二级结构。首先，在空框中输入核苷酸序列，然后在 Basic Options 框中选择最小自由能并避免使用孤立的碱基对。在 Output Options（输出选项）框中，选择交互式 RNA secondary structure plot（交互式 RNA 二级结构图），最后单击 Proceed（继续）按钮。

将弹出一个新窗口，显示目标 mRNA 的二级结构。在目标 mRNA 中选择至少 3 个不同的 21 至 24 个核苷酸长序列，优先位于缺乏广泛二级结构的区域，位于 3 个引物非翻译区。选择胍/胞嘧啶比值接近 50% 且缺乏核苷酸串联重复的区域，以避免可能形成发夹或自退火。

手动设计 2-引物-甲氧基修饰的 RNA 寡核苷酸，在 3-引物上带有生物素部分，这些寡核苷酸与所需靶标 mRNA 内的选定区域完全互补。使用合适的在线工具将 RNA 杂交体的熔解温度调整到 60 到 65 度之间，并具有良好的语言序列复杂性。使用基本局部比对搜索工具搜索与转录组中其他 mRNA 的潜在 ASO 交叉杂交。

选择 Nucleotide BLAST，将序列插入空框中，然后选择感兴趣的生物体。将其余参数保留为默认值，然后单击 BLAST。将 2 μg 报告基因与 20 μL 转染试剂混合，加入细胞中，在 10 cm 组织培养皿中以 70% 汇合度转染 HEK293 细胞。

收获前，将细胞置于 37 摄氏度的培养箱中 48 小时。在收获当天，用血清移液管去除培养基，并用 10 毫升预热于 37 摄氏度的 PBS 快速洗涤细胞两次。接下来，在培养皿中加入 6 毫升 PBS 并置于冰上。

然后在 UV 交联剂中以每平方厘米 100 毫焦耳的浓度将细胞暴露在紫外线下。紫外线照射后，刮掉细胞和 PBS 并转移到 15 毫升试管中。然后在 4 摄氏度下以 250 倍 g 离心细胞 10 分钟。

用移液管去除上清液后，在保持试管在冰上的情况下上下吹打 5 或 6 次，将细胞重悬于 2 毫升预冷的裂解缓冲液中。用移液管将裂解物转移到置于冰上的 5 mL 试管中，超声处理 3 轮，包括 20 秒、10 微米振幅的突发反应，并在冰上冷却 30 秒。将裂解物转移到 2 毫升试管中后，在 4 摄氏度下以 15， 000 倍 g 离心 10 分钟。

收集上清液并转移到新管中。要开始 RNA 分离，请在 500 μL 裂解缓冲液中平衡 1 mg oligo（dT） 偶联磁珠。从旋转器中取出试管，将其放在磁架上，然后取出裂解缓冲液。

将 4 毫克 HEK293 蛋白提取物与 oligo（dT）25 偶联磁珠混合。充分混合样品，然后在 25 摄氏度下孵育 10 分钟。将试管放在磁力架上 10 秒钟，然后去除上清液。

将上清液放在冰上以进行后续几轮恢复。向微珠中加入 500 μL 洗涤缓冲液 A，涡旋 5 秒钟。用磁铁收集磁珠，然后用 500 μL 洗涤缓冲液洗涤磁珠两次 B.To 洗脱 RNA，加入 30 μL 10 毫摩尔 Tris-HCl，并在 80 摄氏度下孵育试管 2 分钟，以 1， 000 RPM 的速度连续振荡。

将试管直接转移到磁力架上，并在 10 秒左右后尽快收集洗脱液，以防止 mRNA 在较低温度下重新结合到磁珠上。然后将重复轮次的洗脱液合并，并储存在零下 80 摄氏度。为了捕获特定的 mRNA，将 30 μL 链霉亲和素偶联的磁珠添加到 1 mL含有 0.1 mg/mL 大肠杆菌转移 RNA 的结合和洗涤缓冲液中。

在室温下在旋转器上平衡 1 小时。一小时后，用 750 μL 结合和洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。涡旋试管，然后去除 B&W 缓冲液，然后重悬于 30 微升缓冲液中并保持在冰上直至使用。

在 100 μL 结合和洗涤缓冲液中稀释先前 poly（A） 分离物中的约 35 μg 总蛋白，然后加入 200 pgol 的适当反义寡核苷酸，并在 70 摄氏度下孵育 5 分钟以促进退火。从设备中取出整个加热块，将其在室温下放置 10 分钟以缓慢冷却。接下来，向样品中加入 30 μL 平衡的链霉亲和素偶联磁珠，然后在 25 摄氏度下将混合物孵育 30 分钟，并在混合器中以 950 rpm 的速度持续摇动。

将试管放在磁力架上，去除上清液，并在 55 摄氏度下用 750 微升预热的结合和洗涤缓冲液洗涤珠子 3 次。加入 20 μL 10 毫摩尔 Tris-HCl，置于 90 摄氏度下，以 950 rpm 的速度持续摇动 10 分钟，以洗脱 RNA。10 分钟后，将试管放入磁力架中，立即收集洗脱液。

这是一种琼脂糖凝胶，用于通过 RT-PCR 检测 mRNA，使用特异性引物捕获 oligo （dT） 和来自 HEK293 细胞提取物的 p27 mRNA 的反义寡核苷酸。还显示了不含反义寡核苷酸的对照。输入泳道显示来自交联细胞的总 RNA。

此外，还显示了与 poly（A） 竞争的结果。此处显示的是 mRNA 结合蛋白的免疫印迹分析，其中抗体检测人抗原 R、未知 RNA 结合蛋白和 β-肌动蛋白（一种阴性对照蛋白）。印迹显示，在用反义寡核苷酸捕获 p27 mRNA 后，在 poly（A）RNA 分离物中成功检测到人抗原 R。

在没有反义寡核苷酸的对照分离株中未检测到人抗原 R。输入泳道显示了交联细胞提取物中的蛋白质，并且还显示了与 poly（A） 竞争的结果。在此程序之后，可以执行其他方法（如质谱法）来系统分析与体内特定 RNA 相互作用的整个蛋白质样品。

重要的是，TRIP 是一种通用方法，可以适应生物体中所有类型的多聚腺苷酸化 RNA，以了解 RNA 蛋白相互作用的动态排列。因此，它可用于研究发育控制或疾病相关的 RNA，并最终可能导致治疗干预的新靶点。