用石英谐振器研究磷脂结合蛋白附件 a2 与固体支持的脂质层结合动力学的耗散微重法
2018年11月1日
在这里, 我们提出了一个实验协议, 可用于确定结合亲和力和模式的相互作用, 无标签磷脂结合蛋白 a2 与固定化固体支持的双层 (slb) 同时测量蛋白质附件 a2 的质量吸收和粘弹性特性。
该方法有助于研究脂质膜蛋白的方向。在我们的案例中，使用它来分析附件素与负磷脂的钙依赖结合。该技术的主要优点是，它无标签，敏感，定量，并可以实时观察到相互作用。
因此，可以直接分析实际结果。此技术也可以应用于其他系统，例如更复杂的微分子组件甚至细胞的相互作用。使用文本协议中描述的透明五毫摩尔脂质溶液。
将溶解的脂质在所需的摩尔比中组合在 10 毫升玻璃管中。使用干流氮蒸发有机溶剂。将脂质混合物留在高真空冻干系统中三小时，以去除溶剂的任何残留痕迹。
现在，将脂质膜重新在一毫升柠檬酸盐缓冲液中。在水浴中，在60摄氏度下孵育脂悬浮液30分钟，每五分钟用力旋转一次。该温度比混合物中熔脂的最高相变温度高出约 10 摄氏度。
同时，将装有直径50纳米孔径的聚碳酸酯膜预热，在过渡温度以上加热30分钟。将多层囊泡悬浮液装入预热挤出机中。轻轻通过聚碳酸酯膜31次，形成小单酰气囊或SUV。
保持温度高于过渡温度。将SUV悬浮液转移到两毫升塑料反应容器中，并加入柠檬酸盐缓冲液，将最终体积达到两毫升。在 2%SDS 溶液中孵育四个插入聚四氟乙烯支架的传感器至少 30 分钟。
然后用超纯水广泛清洗，以完全去除SDS，并使用干砷或氮气流进行尝试。使用等离子清洁系统完全清除任何污染物。为此，请将干传感器插入等离子清洗室中，排空室，然后用氧气冲洗三次。
然后，打开等离子清洁剂。使用真空、高射频功率和 10 分钟的处理时间。清洁运行后，关闭机器并拿出传感器。
使用钳子小心地将等离子清洁传感器停靠到四个流量室中。避免对可能导致泄漏的腔室和管子施加任何压力或躯干。在开放流模式下用柠檬酸盐缓冲器冲洗系统 10 分钟。
启动程序。开始使用软件记录第一个基本音调和音调的频率和耗散的任何变化，直到频率和耗散基线稳定。当基线稳定时，在柠檬酸盐缓冲液中应用 SUV 悬架。
使用反应容器，取出1.5毫升的死体积，然后在循环流模式下关闭系统。将频率耗散班再记录 10 分钟。当 SLB 稳定时，在开放流动模式下以所需的钙浓度平衡系统，使用运行缓冲液进行 40 分钟。
将蛋白质加入含有钙的运行缓冲液。在循环流模式下执行蛋白质的应用，直到达到平衡稳定状态。现在，在开放流动模式下的运行缓冲液中，通过将钙离子与五毫摩尔EGTA分离，分离结合的蛋白质。
在连续开放流模式下，使用 50 毫升双蒸馏水再生微平衡系统。从水容器中拆下管子，让系统运行干燥。小心地拆下晶体传感器，并使用聚四氟乙烯支架用 2%SDS 溶液清洁。
干燥放置传感器的流量模块内部的可见部分。此处显示，记录频率曲线和耗散位移位。增加脂质体后频率的显著下降，表明其吸收，因为缓冲填充的囊泡不是刚性的，而是粘弹性的，耗散增加。
随后，煤囊破裂。囊泡内缓冲液的伴随释放会降低吸附质量，直到达到稳定的高原。附件A2与脂质的结合增加了清晰频率变化所见的质量，但不会干扰二层结构，如耗散的唯一小变化所示。
当钙离子被溷合剂（EGTA）去除时，附件A2与脂质膜分离。频率和耗散记录转移到与双层显示的水平只表示附件A2结合是完全取决于钙离子和脂质膜保持不变。此处显示了一个具有代表性的负对控制实验。
当磷酸盐缺乏时，在钙离子存在的情况下添加附件A2后，频率或耗散没有明显变化。在尝试此过程时，确保正确的双层形成非常重要。立即使用脂质体，否则小囊泡会融合成较大的囊泡，表面张力较小，可能导致基线不稳定。
按照这个程序，可以执行膜蛋白相互作用的定量描述，以回答其他问题，如合作与非合作结合。
概述
本文介绍了一种确定伴钙蛋白A2与固体支持双层的结合亲和力和相互作用模式的协议。该方法允许实时观察蛋白质与脂质膜的相互作用。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 生物物理学
背景
- 伴钙蛋白A2是一种磷脂结合蛋白。
- 了解其与脂质膜的相互作用对细胞过程至关重要。
- 该研究集中于钙依赖性结合负电荷的磷脂。
- 该方法无标记，可进行灵敏、定量的测量。
研究目的
- 分析伴钙蛋白A2与固体支持的脂质双层的结合相互作用。
- 为研究人员提供详细的实验协议。
- 展示该方法在其他复杂系统中的适用性。
所用方法
- 固体支持的脂质双层（SLB）的制备。
- 使用石英晶体微天平测量质量吸收和粘弹性特性。
- 实时监测频率和耗散变化。
- 钙离子螯合研究蛋白质解离。
主要结果
- 伴钙蛋白A2与脂质的结合依赖于钙。
- 频率变化指示蛋白质结合时的质量变化。
- 在相互作用过程中维持稳定的双层结构。
- 负控实验确认结合的特异性。
结论
- 该协议提供了膜蛋白相互作用的定量描述。
- 实时分析允许对结合机制进行详细的洞察。
- 该方法可以适用于研究其他蛋白质-脂质相互作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
This label-free, real-time technique enables quantitative assessment of protein-lipid binding dynamics, supporting target validation in membrane-associated pathways. By measuring mass and viscoelastic changes, it provides mechanistic insights into calcium-dependent interactions critical for de-risking early-stage targets. The method supports predictive confidence in screening campaigns by delivering reproducible, quantitative data on binding affinity and specificity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving phospholipid-binding proteins like annexin A2.
- Operational Value: Provides label-free, quantitative measurement of binding kinetics and calcium dependence.
- Predictive Value: Supports target de-risking by confirming specific, reversible interactions with lipid bilayers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates robust, reproducible data for assay standardization in membrane protein screening.
- Operational Value: Enables real-time monitoring of binding events, facilitating hit confirmation and SAR development.
- Scalability: Compatible with diverse lipid compositions and protein targets, supporting platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by maintaining native-like lipid environments.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed effects stem from specific binding or nonspecific adsorption.
- Biomarker Alignment: Supports evaluation of target engagement in disease-relevant systems when linked to functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement assessment to lead optimization, particularly for peripherally acting or membrane-modulating therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying calcium-dependent binding to anionic lipids.
- Screening: Delivers quantitative frequency and dissipation shifts as primary readouts for compound or mutant evaluation.
- Analytics: Enables comparison of binding affinity, stoichiometry, and reversibility across conditions.
- Translational Research: Maintains structural integrity of lipid bilayers, supporting extrapolation to cellular contexts.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other membrane-binding proteins and lipid systems, promoting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein-lipid interaction studies.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized SLB formation and real-time monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target specificity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated binding mechanisms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid vesicle preparation and quartz crystal microbalance operation.
- Depends on access to extrusion equipment, plasma cleaners, and fluidic flow systems.
- Necessitates cross-team standardization of buffer conditions, calcium concentrations, and regeneration protocols.
- Adaptation to different models requires validation of lipid composition and protein stability under assay conditions.
- Practical limitations include sensitivity to vesicle aggregation and baseline drift if SLB formation is suboptimal.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Lipid Vesicle Preparation and Handling the Quartz Sensors
3:03
Microbalance Operation and Cleaning
5:17
Results: Changes in Frequency and Dissipation during Bilayer formation and the Reversible Ca2+-Dependent Interaction of Annexin A2 with the Lipid Bilayer
6:36
Conclusion
