Name: 用石英谐振器研究磷脂结合蛋白附件 a2 与固体支持的脂质层结合动力学的耗散微重法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: 了解利用石英晶体微天平耗散监测技术实时研究Annexin A2与固体支持脂质双分子层的钙依赖性结合动力学。该方法无标记、灵敏且定量，适用于膜蛋白相互作用分析。

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本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）资助，项目编号为 SFB 858/B04、EXC 1003、SFB 1348/A04 和 SFB 1348/A11。

注意：缓冲液应使用 0.22-µm 滤膜过滤，并在真空条件下脱气 1 小时。
1. 脂质体的制备
<ol>
	<li>使用 2 mL 玻璃管。将每种脂质，即 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（POPC）、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（POPS）和胆固醇（Chol），分别溶解于氯仿/甲醇（50:50 v/v）混合溶剂中，配制成澄清的 5 mM 脂质溶液。将 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌醇-4',5'-二磷酸)（PI(4,5)P2）溶解于氯仿/甲醇/水（20:9:1 v/v）混合溶剂中。</li>
	<li>按照所需的摩尔比，将上述溶解的脂质在 10 mL 玻璃管中混合：POPC/POPS（80/20）、POPC/PI(4,5)P2（95/5）、POPC/POPS/Chol（60/20/20）、POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol（60/17/3/20）以及 POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol（37/20/20/3/20）（表 1）。 
	注意：总脂质量最终为 500 µg。</li>
	<li>使用干燥的氮气流蒸发有机溶剂。将脂质混合物置于高真空（冻干）系统中继续抽真空 3 小时，以彻底去除残留溶剂。 
	注意：此步骤将形成一层干燥透明的脂质膜。</li>
	<li>将脂质膜重悬于 1 mL 枸橼酸盐缓冲液（10 mM 三钠枸橼酸，150 mM NaCl，pH 4.6）中。将脂质悬液置于 60 °C 水浴中孵育 30 分钟（该温度比混合物中最高相变温度脂质的相变温度高约 10 °C），每 5 分钟剧烈涡旋振荡一次。 
	注意：此过程将形成大的多层囊泡（MLVs）。保持悬液温度高于相变温度。</li>
	<li>将配备孔径为 50 nm 聚碳酸酯膜的挤出器预热（本实验中为 60 °C），并在高于相变温度（此处为 40–50 °C）条件下预热 30 分钟。</li>
	<li>将 MLV 悬液装入预热的挤出器中，缓慢地使混合物在聚碳酸酯膜上往返通过 31 次，以形成小单层囊泡（SUVs）14。操作过程中保持温度高于相变温度。</li>
	<li>将 SUV 悬液转移至一个 2&#160;mL 塑料反应容器中，并加入枸橼酸盐缓冲液（见步骤 1.4），调节终体积至 2 mL。 
	注意：最终脂质浓度为 250 µg/mL。</li>
</ol>
2. 石英传感器的处理
注意：始终使用镊子操作石英传感器。
<ol>
	<li>将四个插入聚四氟乙烯支架中的传感器在2% SDS溶液中孵育≥30分钟。用超纯水彻底清洗以完全去除SDS，并用干燥的氩气或氮气流吹干。</li>
	<li>使用等离子清洗系统彻底去除任何污染物。将干燥的传感器插入等离子清洗腔室，抽真空后用氧气冲洗3次。开启等离子清洗仪，采用以下工艺参数：压力1×10-4 Torr，高射频（RF）功率，处理时间10分钟。关闭仪器并取出传感器。</li>
</ol>
3. 微量天平操作
注意：使用一个带有四个温度控制流室的微量天平系统，流室为并联配置，连接蠕动泵并设定流速为 80 µL/min。在开放流动模式下，缓冲液从供液储液器泵入接收槽。在循环模式下，接收槽与供液储液器相连，形成闭合回路。温度设定为 20 °C。
<ol>
	<li>使用镊子小心地将经过等离子清洗的传感器插入四个流体腔室中。避免对腔室或管路施加任何压力或扭力，以防发生泄漏。</li>
	<li>以开放式流动模式用柠檬酸盐缓冲液（10 mM 三钠柠檬酸盐，150 mM NaCl，pH 4.6）冲洗系统10分钟。 
	注意：此步骤需精确使用3.2 mL缓冲液，但建议使用过量缓冲液（10 mL）。</li>
	<li>启动程序。使用软件开始记录第一基频（n = 1st）及高次谐波（n = 3rd - 13th）的频率和耗散变化，直至频率和耗散基线稳定（约需40 - 60分钟）。 
	注意：频率噪声水平（峰峰值）应低于0.5 Hz，耗散噪声应低于0.1·10-6，在水溶液中最大漂移为频率1 Hz/h，耗散0.3·10-6/h。</li>
	<li>当基线稳定后，加入柠檬酸盐缓冲液中的SUV悬浮液（2 mL置于小管中）。使用反应容器移除1.5 mL死体积，然后将系统切换至循环流动模式。继续记录频率/耗散变化10分钟。 
	注意：在此期间，囊泡将在SiO2表面铺展并融合，形成连续的双层膜15,16&#160;（见图1、图&#160;2和图&#160;3中的步骤2）。SUV在传感器表面的吸附呈双相性，耗散曲线通常出现频率最小值和最大值。当出现新的稳定频率/耗散基线，并伴随特征性频率偏移（取决于脂质组成）在26 - 29 Hz范围内（见表1），表明表面已形成连续双层膜。</li>
	<li>当SLB稳定后（见步骤3.4），在开放式流动模式下，用运行缓冲液（10 mM HEPES，150 mM NaCl，pH 7.4）平衡系统40分钟，缓冲液中含所需浓度的Ca2+（根据实验需求，CaCl2浓度范围为50 µM至1 mM）。</li>
	<li>将蛋白（此处为AnxA2）加入含Ca2+的运行缓冲液中（见步骤3.5）。以循环流动模式加入蛋白，直至达到平衡稳态（见图&#160;1、图2和图3中的步骤3）。 
	注意：蛋白浓度范围可在1至400 nM之间。蛋白吸附会导致频率发生浓度依赖性偏移，反映吸附质量（蛋白）的变化。</li>
	<li>在开放式流动模式下，使用含5 mM EGTA的运行缓冲液螯合Ca2+离子，使结合的蛋白解离（见图1和图&#160;2中的步骤4）。 
	注意：频率和耗散恢复至SLB基线水平，表明蛋白结合完全可逆。可通过重复结合-解离循环，比较不同浓度或不同蛋白的结合特性。</li>
</ol>
4. 微量天平清洁
注意：每次测量后执行最低限度的清洁程序。
<ol>
	<li>以连续开放流动模式用 50 mL 去离子水（ddH2O）再生微量天平系统，将管路从水容器中取出，并让系统运行至干燥。</li>
	<li>小心取出晶体传感器，并使用聚四氟乙烯支架，用 2% SDS 溶液清洗（参见步骤 2.1）。</li>
	<li>干燥传感器安装位置处流路模块内部可见部分。 
	注意：在完成 10 次测量系列后，应执行一次强化清洗程序。</li>
	<li>在连续开放流动（管路）模式下，使用 2% SDS 溶液（50 mL）在 40 °C（通过软件设置）条件下清洗系统，流速设为 20 µL/min，以延长洗涤剂与系统的接触时间。</li>
	<li>以 160 µL/min 的流速，在连续开放流动模式下用 250 mL 去离子水（ddH2O）冲洗系统。 
	注意：使用 4 个月后，应根据制造商手册执行一次全面清洗程序。</li>
</ol>

<ol><li>Simons, K., Toomre, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11413487">Lipid rafts and signal transduction.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-41 (2000).</li>
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<li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+push+and+internal+pull+forces+recruit+curvature-sensing+N-BAR+domain+proteins+to+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane.</a> Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).</li>
<li>Fehon, R. G., McClatchey, A. I., Bretscher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organizing+the+cell+cortex%3A+the+role+of+ERM+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organizing the cell cortex: the role of ERM proteins.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (4), 276-287 (2010).</li>
<li>Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+supported+membranes+doped+with+PIP2%3A+influence+of+ionic+strength+and+pH+on+bilayer+formation+and+membrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Solid supported membranes doped with PIP2: influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization.</a> Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).</li>
<li>Bianco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+crystal+microbalance+as+cell-based+biosensor+to+detect+and+study+cytoskeletal+alterations+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Quartz crystal microbalance as cell-based biosensor to detect and study cytoskeletal alterations and dynamics.</a> Biotechnology Journal. , 1700699(2018).</li>
<li>Chen, J. Y., Penn, L. S., Xi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quartz+crystal+microbalance%3A+Sensing+cell-substrate+adhesion+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Quartz crystal microbalance: Sensing cell-substrate adhesion and beyond.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 593-602 (2018).</li>
<li>Bragazzi, N. L., et al. Quartz-Crystal Microbalance (QCM) for Public Health: An Overview of Its Applications. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1876162315000486">Advances in Protein Chemistry and Structural Biology</a>. Donev, R., et al. 101, Academic Press. 149-211 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

为了以定性和定量的方式回答细胞膜结构-功能关系方面的问题，细胞生物学极大地受益于基于成熟且广泛应用技术的生物物理方法，其中包括原子力显微镜（AFM）、表面等离子体共振（SPR）以及本文所采用的QCM-D技术。我们在先前的研究中已证实，膜联蛋白以依赖Ca2+的方式高亲和力地结合到固定的膜上。我们采用第七次谐频的频率和耗散变化（Δf7），因为这在检测灵敏度与振荡稳定性之间达到了最佳平衡。
该技术还可对膜蛋白相互作用进行定量描述。AnxA2 与膜的结合表现出由保守的膜联蛋白核心结构域介导的正协同性，并依赖胆固醇的存在。AnxA2 和 AnxA8 的定量数据已在其他文献中详细报道6,8。
本方案中有多个关键步骤。脂质体应立即使用，否则小囊泡可能会融合成更大的囊泡，表面张力降低，从而抑制脂双层的形成。测量过程中需保持恒定温度。温度的任何微小偏差都会导致频率和耗散值发生不可忽略的偏移。避免产生气泡，否则系统将不稳定，无法建立基线。
Sauerbrey方程能够将观测到的频率变化直接转换为质量变化，因此被广泛使用。然而，共振频率变化与增加质量之间呈线性相关这一假设，仅适用于在传感器表面形成刚性且均匀薄膜的组分。对于具有黏弹性的吸附物，如含水丰富的蛋白质膜、含水的脂质层，甚至吸附的细胞，Sauerbrey方程不再适用。此时需要采用更复杂的数学模型。因此，同时监测频率和耗散的变化极为重要。为在测量过程中检测结构变化，需监测ΔD 与 Δf 比值可进行作图，直线表明无构象变化。
该技术的一个主要优势是可使用种类极为广泛的材料作为基底。此外，这是一种可靠且直接的方法，可用于研究多种大分子相互作用，因为表面涂层薄膜（如支持性脂双层，SLB）的正确形成以及后续的蛋白质-脂质相互作用均可在线实时监测。
该方案可应用于其他膜相互作用蛋白，例如BAR结构域蛋白19、在膜-细胞骨架连接中发挥重要作用的ERM（ezrin、radixin和moesin）蛋白家族20,21,22，或含有C2结构域或PH结构域的蛋白。此外，已有大量成功应用该技术研究生物材料的报道，从而确立了QCM作为一种非常适合研究更复杂的高分子组装体甚至细胞相互作用的实验平台23,24。

细胞膜是高度动态且复杂的结构。膜脂质的复合混合物与外周或/和整合性膜蛋白共同组装形成微区。这些膜微区在时空上的协调组织参与了关键的生理过程1膜微区动力学由膜脂质之间的相互作用以及外周膜蛋白识别并结合微区中富集脂质的能力共同驱动。蛋白质被招募至特定脂质通常通过以下方式实现 通过 脂质识别模块，例如pleckstrin同源结构域（PH结构域）或C2结构域2,3利用模型膜进行的生物物理分析方法对于在分子水平上理解这些过程的基本原理至关重要。
膜联蛋白是一类多基因大家族，以其在 Ca2+ 调控下结合带负电荷的膜脂（主要是磷脂酰丝氨酸（PS））的能力而著称2。膜联蛋白家族的第二个特征是存在一段保守的结构单元，即膜联蛋白重复序列，该序列重复出现四次或八次，并含有 Ca2+ 和磷脂结合位点4。依赖 Ca2+ 的脂质相互作用使膜联蛋白能够精确感知并将 Ca2+ 介导的信号传递至靶膜。与此一致的是，膜联蛋白能够在细胞膜和/或人工膜系统中诱导形成富含胆固醇、磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）和 PS 的微区5。本实验方案描述了一种利用石英晶体微天平耗散（QCM-D）技术分析膜联蛋白与膜相互作用的方法6,7,8。
该微量天平的基本组件是一个作为传感表面的振荡晶体。分子吸附和/或结合到传感表面会导致共振频率（f）下降，其下降程度与质量增加成正比。如果表面被均匀的薄膜覆盖，额外物质的结合可能会影响该层的结构完整性，这种粘弹性变化（能量耗散因子 D）可被进一步监测。这是一种广泛用于研究蛋白质与脂双层相互作用的技术。在此方法中，脂质体被吸附到适当包被的传感表面。在基于二氧化硅的材料上更有利于形成脂双层9,10，因为脂质体在其他亲水性表面（如经紫外-臭氧处理后氧化的金11&#160;、TiO212 或 Al2O313）上通常不会破裂。融合脂质体的破裂会释放出水相，从而引起质量和耗散的特征性变化。通过脂质体融合生成固相支撑的双层膜（SLB）方法简单且稳定，可用于构建模拟细胞膜的复杂模型。
耗散型石英晶体微天平是一种无标记且高灵敏度的技术。其主要优势在于可将任何能形成足够薄薄膜的材料涂覆于表面，从而在多个研究领域中具有广泛的应用前景。蛋白质与膜之间的相互作用可被实时观测，结果可直接进行分析。同一传感器表面可在后续测量中重复使用（在按照本方案所述进行 минималь 清洁后），从而实现精确的内部对照以及不同分析物之间的可比性。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Merck</td><td>017-013-00-2</td><td>99%</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Roth</td><td>4432.1</td><td>99%</td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A0878</td><td>99%</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1069</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3493</td><td></td></tr><tr><td>PiP&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Avanti&amp;nbsp;</td><td>850155P</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti&amp;nbsp;</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>POPS</td><td>Avanti&amp;nbsp;</td><td>840034P</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>183</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸三钠</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Extruder Liposofast</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qsense E4 分析仪</td><td>Qsense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QSense Dfind</td><td>Qsense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IPC 4 型泵</td><td>Ismatec</td><td>ISM 930</td><td></td></tr><tr><td>QSX 303 SiO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 二氧化硅 50nm</td><td>Qsense</td><td>QSX 303</td><td></td></tr><tr><td>PC 膜 0.05&amp;mu;m</td><td>Avanti polar lipids</td><td>610003</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro</td><td>OriginLab Corporation</td><td></td><td>第 8 和第 9 版</td></tr></tbody></table>

利用石英振荡器通过耗散型微重力测定法研究磷脂结合蛋白annexin a2与固相支撑脂双层的结合动力学

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

耗散型石英晶体微天平技术是一种简单且无需标记的方法，可同时测量传感器表面吸附或固定化物质的质量摄取量及其黏弹性特性，从而实现对蛋白质与固相支持表面（如脂双层）相互作用的实时、高灵敏度检测。膜联蛋白是一类高度保守的磷脂结合蛋白，可逆地与带负电荷的磷脂头部基团相互作用 通过 钙离子的配位作用。本文描述了一种用于定量分析膜联蛋白A2（AnxA2）与石英传感器表面制备的平面脂双层结合的实验方案。该方案经过优化，可获得稳定且可重复的实验数据，并包含详细的分步操作说明。本方法可适用于其他膜结合蛋白及不同组成的脂双层体系。

共振频率的降低（Δf）与吸附质量（Δm）之间呈线性关系，该关系由Sauerbrey方程定义。17
<img alt="频率变化公式 Δf=-Cf(Δm/A)，与质量灵敏度相关；公式示意图。" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1">
其中，f 为共振频率，Cf 是一个常数，取决于特定石英的几何和物理特性以及共振频率，A 为传感器的表面积。
在大多数应用中，吸附层并非完全刚性，而是具有粘弹性。石英传感器振荡因此产生的衰减被称为耗散（D）。所监测到的耗散变化（ΔD）与结合物质的粘弹性特性相关联18 其定义如下8.
<img alt="阻尼系数方程（D = E_耗散 / 2πE_储存），静态平衡，公式示意图。" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2">
其中，Edissipated 表示在一个振荡周期内损失的能量，Estored 表示自由振荡传感器的总能量。
为了分析和量化结合参数，通过将平衡频率偏移（ΔΔfe）对蛋白质浓度作图，得到频率等温线。ΔΔfe 定义为
<img alt="静态平衡公式 ΔΔfe=[(Δft2−Δftt)]；用于物理分析的数学表达式。" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 3">
此处，Δft1 代表蛋白质吸附的开始以及Δft2 平衡状态。可通过使用Langmuir方程的Hill级数展开进行非线性曲线拟合，如下所示6,8.
<img alt="蛋白质结合方程；说明蛋白质-配体相互作用动力学的公式；教学示意图。" src="/files/ftp_upload/58224/58224eq4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 4">
其中，ΔΔfmax 表示蛋白质浓度达到最大（饱和）结合时的 ΔΔfe，Kd 表示蛋白质/膜复合物的表观解离常数，n 为 Hill 系数。
Hill 系数（n）描述了结合的协同性。当 n = 1 时，Hill 吸附模型即为简单的 Langmuir 等温线（所有结合位点相同，且各分子相互独立地结合到脂双层上）。若 n ≠ 1，则已结合的配体将改变膜对其他配体的结合亲和力，使其升高（n > 1，正协同性）或降低（n < 1，负协同性）。
图1 展示了我们实验室用于测量Ca期间共振和频率变化的实验流程示意图2+依赖性结合及AnxA2向液相中脂质双层的释放。展示了一个典型的记录结果 图2. 图2A 显示频率曲线的记录 图2B 显示了耗散值的变化。在加入脂质体后，频率出现显著下降（图2A [步骤1]) 表明其发生吸附。由于缓冲液填充的囊泡并非刚性，而是具有黏弹性，耗散随之增加（图2B [步骤1]。随后，融合的囊泡破裂，囊泡内缓冲液的同步释放导致吸附质量下降，直至达到稳定平台期（图2A [步骤2]。需要注意的是，囊泡的加入会导致较大的耗散偏移，而由于SLB双层膜具有刚性且均匀的特性，其引起的偏移则小得多（图2B [步骤 2]。第 3 步在 图 2A 和 2B 记录了AnxA2与脂质的结合，这会增加质量，表现为明显的频率偏移，但并未干扰双分子层结构，因为耗散仅发生微小变化。当Ca2+ 通过螯合剂 EGTA 去除图 1 和 图 2 [步骤4]，AnxA2从脂膜上解离。频率以及耗散记录恢复至仅含双层膜时的水平（比较步骤2和步骤4中的 图 2A 和 2B)，表明AnxA2的结合完全依赖于Ca2+ 且脂质膜保持完整。
AnxA2与大多数膜联蛋白一样，依赖于带负电荷的脂质（如PS）。当脂质双分子层中不存在POPS时，这一依赖性表现得尤为明显。图3). 图3A 显示频率曲线的记录 图3B 显示耗散偏移。注意频率偏移至 -25 Hz 的稳定基线，而耗散未发生改变（图3B [步骤2]），表明形成了正常的双层膜结构。然而，频率未发生改变（图3A）或耗散（图3B在存在 Ca 的情况下加入 AnxA2 后观察到）2+ (图 3A 和 3B [步骤 3]) 或 EGTA (图 3A 和 3B [步骤4]，因为AnxA2无法与脂质膜相互作用。
<img alt="钙离子、EGTA存在下的脂质双层融合过程；用于膜研究的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1： 实验流程的示意图模型。该流程展示了囊泡吸附到亲水性传感器表面（步骤1）、囊泡融合/破裂形成支撑脂质双层（SLB）（步骤2）、AnxA2的Ca2+依赖性吸附（步骤3）以及EGTA依赖性解吸附（步骤4）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="频率和耗散随时间变化，该图显示光谱实验中的动态过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：典型记录结果。 本图显示（A）第7级泛音共振频率随时间的变化监测，以及（B）测量过程中石英传感器的耗散偏移。脂质体的加入导致频率基线迅速下降，而耗散基线则上升（步骤1）。基线的稳定表明双层膜的形成（步骤2）。在Ca2+存在下，AnxA2（200 nM）吸附至含POPS的脂质双层，增加了质量但耗散未发生显著变化，表明脂膜结构未受扰动（步骤3）。随后通过EGTA螯合Ca2+，频率基线恢复，表明蛋白质完全脱附（步骤4）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示光学吸收和发射分析中 Δf 和 ΔD 随时间变化的光谱图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58224/58224fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3： 阴性对照实验，证明在无POPS存在时AnxA2不与SLB结合。 这些图示展示了脂质体的加入及SLB的形成过程（步骤1和2）。加入AnxA2（步骤3；200 nM，含Ca2+）或EGTA（步骤4）后，(A) 频率或 (B) 耗散均未出现明显变化。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58224/58224fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<table fo:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>组分</td>
			<td>形成SLB后的ΔΔF/Hz</td>
			<td>形成SLB后的ΔΔD*10-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC/POPS 
			(80 : 20)</td>
			<td>26.3 ± 0.2</td>
			<td>0.26 ± 0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC/PI(4,5)P2 
			(95 : 5)</td>
			<td>26.5 ± 0.5</td>
			<td>0.31 ± 0.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC/POPS/Chol 
			(60 : 20 : 20)</td>
			<td>29.2 ± 0.2</td>
			<td>0.45 ± 0.09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol 
			(60 : 17 : 3 : 20)</td>
			<td>29.6 ± 0.6</td>
			<td>0.43 ± 0.10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>POPC/DOPC/POPS/PI(4,5)P2/Chol 
			(37 : 20 : 20 : 3 : 20)</td>
			<td>29.4 ± 0.4</td>
			<td>0.39 ± 0.14</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：SLB的脂质组成及形成数据7。

本文介绍了一种实验方案，可通过同时测量膜联蛋白A2蛋白的质量摄取量及其粘弹性特性，来确定无标记磷脂结合蛋白膜联蛋白A2与固定在固相支持膜上的双层脂膜（SLB）之间的结合亲和力及相互作用模式。

利用石英振荡器通过耗散型微重力测定法研究磷脂结合蛋白Annexin A2与固相支撑脂双层的结合动力学

耗散型石英晶体微天平技术是一种简单且无需标记的检测方法，可同时测量质量摄取和粘弹性……

该方法可用于研究蛋白质与脂质膜之间的作用方向。在本例中，可利用该方法分析钙离子依赖性的膜联蛋白与带负电荷的磷脂之间的结合。该技术的主要优势在于无需标记、灵敏度高、具有定量性，并且能够实时观察相互作用过程。从而实现对真实结果的直接分析。该技术还可应用于其他体系，例如更复杂的微分子组装体甚至细胞之间的相互作用。使用文中实验方案所述的清晰的5 mM脂质溶液。将溶解的脂质按所需摩尔比例在10毫升玻璃试管中混合。使用干燥的氮气流蒸发有机溶剂。将脂质混合物置于高真空冷冻干燥系统中三小时，以去除溶剂的任何残留痕迹。现在，将脂质膜重悬于1毫升柠檬酸盐缓冲液中。将脂质悬液置于水浴中，在60°C下孵育30分钟，每5分钟剧烈涡旋振荡一次。该温度比混合物中熔点最高脂质的相变温度高出约10°C。同时，将配备有孔径为50纳米聚碳酸酯膜的挤出器预热至相变温度以上30分钟。将多层囊泡悬浮液加入预热的挤出器中。缓慢地将混合物通过聚碳酸酯膜挤出31次，以形成小单层囊泡（SUVs）。保持温度高于相变温度。将 SUV 悬液转移至一个 2 毫升的塑料反应容器中，并加入柠檬酸盐缓冲液，使最终体积达到 2 毫升。将插入聚四氟乙烯支架中的四个传感器置于 2% SDS 溶液中孵育至少 30 分钟。然后用超纯水彻底清洗，以完全去除SDS，并使用干燥的氩气或氮气流吹干。使用等离子清洗系统彻底去除任何污染物。具体操作为：将干燥的传感器放入等离子清洗腔室，抽真空后用氧气冲洗三次。然后，打开等离子清洗机。使用真空、高射频功率，处理时间为10分钟。清洗程序结束后，关闭设备并取出传感器。使用镊子小心地将经过等离子清洗的传感器插入四个流体室中。避免对流体室和管路施加任何压力或扭转，以防发生泄漏。在开放流模式下用柠檬酸盐缓冲液冲洗系统10分钟。启动程序。使用软件开始记录基频及各高次谐波的频率和耗散变化，直至频率和耗散基线稳定。当基线稳定后，在柠檬酸盐缓冲液中加入SUV悬液。使用反应容器，移除1.5毫升的死体积，然后在循环流动模式下关闭系统。再记录10分钟的频率耗散变化。当SLB稳定后，在开放流动模式下用含有所需钙离子浓度的运行缓冲液平衡系统40分钟。将蛋白质加入含有钙的运行缓冲液中。以循环流动模式上样蛋白质，直至达到平衡稳态。随后，在开放流动模式下，于运行缓冲液中加入5毫摩尔的EGTA螯合钙离子，使已结合的蛋白质解离。以连续开放流动模式，用 50 毫升双蒸水再生微量天平系统。将管路从水容器中取出，让系统运行至干燥。小心取出晶体传感器，并使用聚四氟乙烯支架，用 2% SDS 溶液清洗。 干燥传感器放置位置处流路模块内部的可见部分。图中显示的是频率曲线和耗散变化的记录。加入脂质体后频率显著下降，表明脂质体已被吸附；由于缓冲液填充的囊泡并非刚性结构，而是具有粘弹性，因此耗散值上升。随后，融合的囊泡发生破裂。囊泡内缓冲液的同步释放导致吸附质量下降，直至达到稳定平台期。膜联蛋白A2与脂质的结合增加了质量，这通过明显的频率偏移得以体现；但该结合并未干扰双层结构，因为耗散值仅发生微小变化。当螯合剂 EGTA 去除钙离子后，膜联蛋白 A2 会从脂质膜上解离。频率和耗散信号的变化恢复至仅存在双层脂膜时的水平，表明膜联蛋白 A2 的结合完全依赖于钙离子，且脂质膜保持完整。此处展示了一个典型的阴性对照实验结果。当不存在磷脂酰丝氨酸时，在钙离子存在下加入膜联蛋白A2后，频率和耗散均无明显变化。进行该操作时，必须确保双层膜的正确形成。脂质体应立即使用，否则小囊泡会融合成更大的囊泡，表面张力降低，可能导致基线不稳定。通过该实验步骤，可对膜蛋白相互作用进行定量描述，从而回答其他问题，例如协同性结合与非协同性结合之间的差异。

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