可视化培养小鼠神经元中轴突生长锥的塌陷及早期淀粉样蛋白β效应

该方法有助于解答阿尔茨海默病研究领域中的关键问题，特别是与生长锥塌陷相关的早期事件。该技术的主要优势在于能够对经β-淀粉样蛋白处理后的轴突生长锥进行即时的可视化观察与分析。首先，使用显微剪刀将胚胎第14天小鼠新鲜分离的大脑皮层在无抗生素的神经元培养基中剪碎。

收集组织，于87G离心3分钟。离心后，弃去上清液，在沉淀中加入2毫升0.05%胰蛋白酶。于37摄氏度孵育15分钟，每隔5分钟轻敲混匀。

孵育15分钟后，加入4毫升培养基A以中和胰蛋白酶，并通过轻敲混匀。随后在178 × g条件下离心组织3分钟。弃去上清液后，加入DNA酶和大豆胰蛋白酶抑制剂溶液，在37 °C孵育15分钟，每5分钟混匀一次，操作同前。

当孵育时间结束后，加入4毫升A培养基，混匀后按之前步骤进行离心。去除上清液后，再加入4毫升A培养基，用抛光的巴斯德移液管反复吹打组织，直至观察不到组织碎片为止。接着，用孔径为70微米的滤网过滤吹打后的组织悬液。

过滤后，使用血细胞计数板对细胞进行计数并计算细胞密度。将 0.8 × 10⁴ 个细胞悬于培养基 A 中，加入八孔培养板的每个孔内。然后在 37 °C、含 10% CO₂ 的湿润环境中孵育。

培养4小时后，将培养基更换为B培养基。采用该方法获得的神经元纯度约为75%。至少在实验开始前一周进行以下准备：打开一管新配制的市售全长Aβ42，用无菌蒸馏水溶解内容物，配制成0.5毫摩尔浓度的溶液。在37摄氏度下孵育7天，以诱导其聚集并产生毒性。将聚集后的Aβ1-42分装成小份，于-80摄氏度保存，直至使用。

在神经元培养的第四天，按照先前所示方法，向各孔中加入100微升含0.5微摩尔聚集态Aβ1-42或对照溶液的B培养基，处理1小时。处理1小时后，移除培养基，并立即在37摄氏度的加热板上用含4%蔗糖的4%多聚甲醛PBS溶液固定神经元1小时。固定步骤至关重要，因为维持生长锥的形态对本实验方案极为关键。

固定后，用 PBS 洗涤神经元三次。然后移去腔室，用水溶性封片剂封片。在 4 °C 条件下干燥封片剂 2 至 4 天。

使用倒置显微镜上的20倍干镜物镜拍摄每个孔的完整区域。捕获并分析每个孔中的全部区域对于避免主观性至关重要。将处于第三或第四阶段的每个神经元的最长神经突分类为轴突。

缺乏片状伪足或丝状伪足少于三条的轴突生长锥被视为塌陷的生长锥。此处显示的是孵育前的Aβ1-42寡聚体，在37摄氏度下孵育七天后发生聚集。经聚集态Aβ1-42处理后，使用针对Aβ毒性寡聚体的抗体进行免疫染色，在Aβ1-42处理的神经元中可见红色阳性信号，而在载体处理的神经元中则无阳性染色。

在培养四天后分析了Aβ 1-42处理所诱导的早期现象。通过轴突标志物tau-1（红色显示）的阳性免疫染色和树突标志物MAP-2（绿色显示）的阴性免疫染色，确认了所识别的轴突。经一小时溶剂处理后，生长锥已展开板状伪足并形成多个丝状伪足。

这些被鉴定为健康的生长锥。相反，经 Aβ 1-42 处理一小时后，生长锥出现收缩，且未形成片状伪足或丝状伪足。这些被鉴定为塌陷的生长锥。

在进行该实验操作时，重要的是要记住，需在37摄氏度条件下使用4% PFA和4%蔗糖固定细胞，以最大限度地优化此固定方案。按照本方案，还可进一步开展其他实验方法，如活细胞成像和基因转染，以回答更多科学问题，例如轴突生长锥在何时以及如何发生塌陷，以及塌陷后的生长锥如何恢复。