使用自显影金属染色法定位并半定量鲸类组织中的银

该方法有助于解答环境毒理学领域中关于重金属在生物系统内亚器官分布及其浓度的关键问题。此技术的主要优势在于，银增强法（AMG）是一种易于使用且成本低廉的方法学，可作为研究组织中重金属的有力辅助手段。我们采用海豚和鲸鱼的组织来演示该实验方案。

然而，我们认为该方案也可应用于多种动物物种。本次操作演示将由本机构的临床医生 Shun Theng 与 Wen-Ta Li 共同完成。首先，采集来自搁浅鲸类动物的配对肝组织和肾组织用于 AMG 分析，并用 10 倍体积的 10% 中性缓冲福尔马林固定组织，固定时间为 24 至 48 小时。

接下来，使用一次性不锈钢切片刀将福尔马林固定的肝和肾组织修整为长2厘米、宽1厘米、厚3毫米的组织块，并将同一供体的肝和肾组织块放入同一个标记好的包埋盒中。将组织块放入组织处理机中，依次经过梯度乙醇和二甲苯浸润进行脱水，随后分别进行1小时和2小时的石蜡浸润。在完成2小时石蜡浸润后，将组织转移至钢制组织学模具底部，并用新鲜熔化的石蜡包埋已脱水的组织样本。

将福尔马林固定、石蜡包埋的组织块置于冷台上冷却，直至石蜡完全凝固，在切片机上修块至暴露组织表面。将样品在负20摄氏度下冷却10分钟，用切片机切取5微米厚的组织切片。使用镊子和刷子在切片形成时将其带状物轻轻拾起，漂浮于45摄氏度的双蒸水浴表面，待其充分展开后，分别转移至载玻片上。

然后，将切片置于60摄氏度的切片加热板上放置一小时。接着，将切片放入切片架中，并在三个不同的染色缸中依次用200至250毫升的纯非二甲苯试剂进行脱蜡，孵育时间分别为8分钟、5分钟和3分钟。将脱蜡后的样本在不同染色缸的梯度乙醇溶液中水化，随后用双蒸水冲洗。

用含5%Triton X-100的PBS缓冲液冲洗切片一次，再用PBS单独冲洗数次，最后用新鲜的双蒸水冲洗一次，每次冲洗时间为30秒。最后一次冲洗后，在避光、室温条件下，每份样本加入300 µL混合好的银增强试剂盒溶液，孵育时间不超过15分钟。孵育结束后，用双蒸水洗涤载玻片，并在每张载玻片上加入300 µL苏木精溶液进行复染，复染时间为10秒。

用流动的自来水冲洗载玻片，干燥后用封片剂封片。然后，在光学显微镜40倍物镜下，对每张组织切片随机采集10张组织学图像。

为了分析样本的自显影金属染色（autometallography，AMG）阳性情况，使用合适的图像分析软件打开图像，选择“图像”→“类型”→“RGB 合成”，将第一幅图像拆分为红、蓝、绿三个颜色通道。在蓝色通道中，选择“图像”→“调整”→“阈值”，以测量每张图像中 AMG 阳性信号所占的面积百分比，并根据细胞核或红细胞中是否存在假阳性区域，手动调整每张图像的阈值截断值。点击“分析”→“设置测量”，勾选“面积分数”，以确保记录面积分数。

单击“分析”和“测量”，以在结果窗口的“阳性百分比面积”列中显示每张组织学图像的阳性百分比面积。为了评估电感耦合等离子体质谱法结果与AMG阳性值之间的相关性，请打开相应的绘图软件。创建一个新的项目文件，并选择XY图和相关性分析。

输入电感耦合等离子体质谱和AMG分析的结果，选择分析和相关性，通过皮尔逊相关性分析评估两种分析结果之间的关联强度。在参数、非线性回归窗口中，在拟合页面选择不同的回归模型，在比较页面选择比较方法。包括额外平方和F检验以及赤池信息准则。

根据比较方法的结果，在鲸类组织学银染色分析中选择一个相对合适的回归模型，并利用该分析方法估算银浓度未知的鲸类肝脏和肾脏组织中的银含量。AMG阳性信号包括大小不一、呈棕至黑色的颗粒，分布于肝细胞和库普弗细胞的细胞质中，以及部分近端肾小管管腔和基底膜中偶见的无定形、金黄色至棕色的AMG阳性信号。电感耦合等离子体质谱法的检测结果与所分析肝脏及肾脏组织中的AMG阳性值之间存在正相关关系，根据额外平方和F检验和赤池信息准则，优选通过原点的线性回归模型。

在进行该操作时，需要注意AMG方法是一种辅助方法，必须与其他特定方法（如ICPMS）结合使用，以监测组织中重金属的实际成分。