利用 Cas9 Ribonucleoproteins 生成人 NK 细胞的研究

该方法可以帮助回答 NK 细胞生物学领域中关于调节效应细胞功能的特定基因和通路的作用和功能的关键问题。与 DNA 依赖性方法相比，该技术的主要优点是成功率高，有助于高效敲除 NK 细胞疗法中最具临床相关性的基因之一。该技术的意义延伸到实体瘤和脑瘤的免疫治疗，这些实体瘤和脑瘤表达 TGF-β 作为免疫逃逸的手段。

对于原代 NK 细胞转导，将每毫升 RPMI 培养基中 5 个新鲜分离的 NK 细胞孵育 3 次 10 次，每个 T75 培养瓶补充 100 IU/毫升 IL2，孵育 4 天，每隔一天和转导前一天更换一次培养基。对于扩增的 NK 细胞转导，在第 0 天用表达辐射膜结合 IL21 的 K562 饲养层细胞以 1：1 的比例刺激原代 NK 细胞，每隔一天和转导前一天更换一次培养基。在电穿孔当天，在一个 T25 培养瓶中填充 8 毫升新鲜培养基，每种实验细胞条件每毫升补充 100 IU IL2，并将培养瓶置于加湿的 37 摄氏度和 5% CO2 培养箱中。

当培养基平衡时，将每 26 μL 转导混合物中每个条件向第六个细胞中加入 3 到 4 乘以 10 的剂量，然后通过离心沉淀细胞。然后在每次洗涤 12 毫升无菌 PBS 中洗涤细胞 3 次，以去除细胞悬液中的所有 FBS。洗涤细胞时，将每个 CRISPR RNA 和 tracrRNA 重悬至 200 微摩尔的最终浓度。

将 2.2 μL 的每种 CRISPR RNA 与每个样品的 1 个 200 μmol 体积的 tracrRNA 混合，并在 95 摄氏度下加热样品 5 分钟。然后让样品冷却至室温，并将 CRISPR RNA/tracrRNA 复合物储存在零下 20 摄氏度直至使用。为了形成核糖核蛋白复合物，将 Cas9 核酸内切酶加入相应的 CRISPR RNA/tracrRNA 复合物中，涡旋 30 至 60 秒，并在室温下孵育所得的 Cas9 核糖核蛋白复合物 15 至 20 分钟。

最后一次洗涤后，从 Nucleofector 溶液 P3 试剂盒中加入全部体积的电穿孔添加剂，并将每个细胞沉淀重悬于 20 μL 的 P3 初级 4D-Nucleofector 溶液中，注意避免气泡。立即将 5 μL 的每种核糖核蛋白复合物添加到适当的细胞悬液中，并向 Cas9 核糖核蛋白复合物细胞混合物中加入 1 μL 的 100 μmol Cas9 电穿孔增强剂。将 26 μL Cas9 核糖核蛋白细胞溶液转移到 Nucleocuvette 试纸条的各个孔中，然后轻轻敲击试纸条以确保样品覆盖每个孔的底部。

然后启动 4D-Nucleofector 系统 EN138 程序。转导结束时，让细胞静置 3 分钟。然后向每个比色皿中加入 80 μL 预平衡的培养基，并在 37 摄氏度孵育时将样品轻轻转移到每个条件下的一个培养瓶中。

培养 48 小时后，根据标准方案，将基因组 DNA 从 5 乘以 10 提取到 5 个转导的细胞中，用于基因缺失筛选。然后用新鲜的膜结合 IL21 表达饲养层细胞以一比一的比例刺激其余转导的细胞，并根据定量 PCR 基因表达分析的标准方案，在共培养 5 天后提取 RNA。流式细胞术分析显示，EN138 程序在现有的 Nucleofector 系统程序中具有最高百分比的细胞活力和转导效率。

例如，使用市售的向导 RNA，在扩增的人 NK 细胞中成功敲除人 HPRT1。此外，含有向导 RNA2、向导 RNA1 加向导 RNA2 和向导 RNA3 的 Cas9 核糖核蛋白表现出成功的 TGF-β 受体两个胞外结构域基因敲除，而单独的向导 RNA1 不会诱导任何 T7E1 可检测的插入缺失。事实上，使用 EN138 程序进行 Cas9 核糖核蛋白电穿孔可导致通过该程序转导的细胞中 TGF-β 受体 2 mRNA 表达降低 60%。

此外，与对照非 TGF-β 处理的转导细胞相比，转导细胞与 TGF-β 和人原代髓母细胞瘤细胞系的共培养不会显着影响 NK 细胞的细胞毒性，面临 Cas9 核糖核蛋白修饰细胞中相应的 TGF-β 受体 2 功能的缺乏在蛋白质水平上。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在五个小时内完成。在尝试此过程时，重要的是要记住设计几种不同的向导 RNA 以找到最佳的基因编辑结果。

在此程序之后，可以执行其他方法，如 DNA 测序或 T7E1 突变测定，以回答有关基因编辑效率或如何确定潜在脱靶基因突变的其他问题。开发后，这项技术为癌症免疫治疗领域的研究人员探索在癌症治疗中使用基因编辑的 NK 细胞的潜力铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何对原代人 NK 细胞进行基因编辑有了很好的了解。

有关此过程后 NK 细胞扩增的更多信息，请参阅我们之前的 Jove 文章。不要忘记，与人类血液打交道可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取普遍的健康和安全预防措施。