通过下一代16S rRNA扩增子测序对蜱微生物组进行表征

该方法有助于回答媒介传播疾病生态学领域中的关键问题，例如，媒介微生物组在病原体动态中发挥什么作用，以及媒介微生物组的形成机制和变异规律是什么？该技术的主要优势在于能够实现高重复性、高分辨率和高精度的鉴定，使研究者能够准确表征在不同生态和环境条件下媒介微生物组的特征。本方法的可视化演示至关重要，因为微生物组测序的建库步骤学习难度较高，尽管市面上存在多种产品和技术方案，但可供学习这些步骤的资源却十分有限。

按照文本方案所述，首先进行蜱虫采集。为去除蜱虫表面污染物，加入500 µL过氧化氢，涡旋振荡15秒。随后用70%乙醇重复洗涤一次，再用双蒸水洗涤一次。

将蜱虫放入新的PCR管中，使其自然风干。在该管中，使用研钵和研杵机械破坏蜱虫组织。根据商品化DNA提取试剂盒提供的说明，从单个蜱虫中纯化DNA。

洗脱至终体积为100 µL。在提取步骤中建立阴性对照，对于后续区分疑似污染物与真正的载体微生物至关重要。在提取步骤以及后续PCR步骤中采用无菌操作技术，同样必要，以尽量减少16S测序中常见的污染影响。

在27.5微升反应体系中进行扩增子PCR，体系包含1微摩尔浓度的上下游引物各5微升，以及12.5微升市售PCR预混液。同时加入从单个蜱虫中提取的DNA 5微升，其浓度为每微升5纳克。将反应管转移至热循环仪，运行文本方案中列出的程序。

PCR反应完成后，取每份样品4到6微升加样至1.5%琼脂糖凝胶上，以观察PCR产物。在460个碱基对处观察到条带即可确认扩增成功。为每份样品使用新的PCR管，将PCR产物与重蒸水混合，使总体积达到60微升。

对于DNA浓度较低的样本，应进行三份平行扩增子PCR以减少扩增偏差，并将样本合并以实现浓缩。使用前将磁性 beads 升至室温并充分涡旋振荡。向60微升样本中加入48微升磁性 beads，混匀后室温孵育5分钟。

将离心管置于磁力架上静置五分钟，直至溶液变澄清。随后移除上清液。保持离心管在磁力架上，加入500 µL freshly prepared 80% ethanol。

在向所有试管中加入乙醇后，立即用移液器吸出液体，但不要移除磁珠。再重复一次乙醇的加入和移除操作。将试管敞口置于磁力架上，室温干燥5分钟，或直至磁珠表面出现细小裂纹，以去除多余的乙醇。

现在加入 20 µL TE 缓冲液，将样品在室温下置于磁力架外孵育。5 到 10 分钟后，将离心管重新放回磁力架上。待磁珠与液体分离后，将上清液转移至新的离心管中，以获得纯化的 PCR 产物。

通过从商业化的文库索引试剂盒中选择正向引物、反向引物或两者，为每个样本分配唯一的引物组合。为了将双端引物或索引连接到样本上，配制PCR反应体系：包含每种引物各2.5 µL、商业化的PCR预混液12.5 µL、双蒸水5 µL以及纯化后的扩增产物2.5 µL。将试管转移至按照文本方案中详细设定程序运行的PCR仪中。

PCR 完成后，取每份样品 4 到 6 微升上样至 1.5% 琼脂糖凝胶，以观察 PCR 产物。在进行纯化步骤前，应观察到约 550 个碱基对处的条带，以确认扩增成功。为准确量化每份纯化的带条形码产物，需对每个样品和标准品进行三复孔 qPCR 检测，并对每个样品设置三个或更多稀释梯度进行检测。

配制10微升的qPCR反应体系，其中包含6微升qPCR预混液、2微升双蒸水以及2微升样本或标准品。将qPCR板转移至实时PCR仪中，按照文本方案中描述的程序进行运行。完成定量后，通过将所有单个文库等体积加入同一管中，构建合并文库。

将合并的文库和测序对照稀释并变性后，将混合物加载至测序流动池中。加载前应彻底清洗流动池，以获得最佳光学效果。随后将流动池装入测序仪，并进行扩增子序列分析。

此处展示了用于序列数归一化的稀疏曲线。这些曲线表明，将每个样本的序列数稀疏化至2000条足以捕获观测到的操作分类单元的全部多样性。在完成序列读取的稀疏化和质量过滤后，进行α和β多样性分析输出。

此处显示的是自动生成的主坐标分析图，用于描述蜱虫微生物组组成如何因处理方式不同而存在差异。此外，系统会自动为所有样本创建各样本中微生物的可视化图谱（本图中展示的是门水平）。在进行该实验操作时，必须始终注意保持无菌操作，以尽量减少微生物污染对测序数据解读所造成的严重影响。

完成此操作后，可进一步采用组织学染色等其他方法来回答更多问题，例如，所观察到的微生物在载体中的具体位置在哪里？该方法建立后，为分子生态学领域的研究人员探索微生物在载体内的相互作用及其对病原体传播的影响提供了重要途径。