在无细胞微乳液中重建细胞周期振荡 非洲爪蟾 卵母细胞提取物

该方法有助于回答系统生物学领域中的关键问题，例如有丝分裂网络背后的调控机制以及细胞周期钟的动力学特性和功能。该技术的主要优势在于能够生成大量液滴，每个液滴中包含多个细胞周期，从而为我们提供一个用于定量操作和分析的高通量研究框架。实验开始时，弃去动物极与植物极边界不清晰或动物极表面存在不规则白斑的卵母细胞批次。

接下来，从一只雌性青蛙中选取合适的一批卵，并将卵转移至一个600毫升的烧杯中。倒去多余的0.2倍浓度的MMR缓冲液，然后在1倍提取缓冲液中轻轻加入半胱氨酸至卵中。随后，用手剧烈摇动烧杯，以去除卵的胶状外膜。

用总共800毫升的半胱氨酸缓冲液重复此洗涤步骤三次，或直至卵子聚集并沉降到烧杯底部。去除胶状包被后，用1升0.2倍浓度的MMR溶液洗涤卵子四次。使用玻璃移液管吸除并弃去变白的卵子。

将 MMR 缓冲液从烧杯中倒出，向卵中加入 200 毫升钙离子载体溶液。用玻璃移液管轻轻搅拌卵，直至其被激活，然后移除钙离子载体溶液。卵在钙离子载体溶液中停留过久会启动凋亡。

我们将卵子搅拌1.5分钟，并检查激活效率。如果未激活，继续搅拌，并更频繁地检查，直至达到90%的激活率。待卵子沉降至烧杯底部后，再次检查激活效率。

充分激活的卵子动物极约占25%，植物极约占75%。接下来，用含有蛋白酶抑制剂的提取缓冲液，总共50毫升，分两次洗涤卵子。然后，小心地将卵子转移至0.4毫升的扣盖微量离心管中。

将微量离心管在200 ×g下离心60秒，然后在600 ×g下离心30秒，以沉淀收集卵子。每步操作后，使用玻璃巴斯德吸管移除卵子上方多余的缓冲液。随后，在4°C条件下，于15,000 ×g下破碎卵子10分钟。

使用剃刀片切割试管，分离破碎卵子的三层结构，并保留中间层的粗制胞质。然后，将粗制胞质转移至洁净的超速离心管中。每毫升胞质中分别添加10微克的蛋白酶抑制剂和细胞松弛素B。

将粗制细胞质在 15,000 g、4 °C 条件下离心 5 分钟。然后用剃刀片切割离心管，收集中间层的细胞质。将 freshly prepared 提取物置于冰上。

首先，将 securin-mCherry mRNA 加入已制备的提取物中。接着，向提取物与mRNA的混合液中加入 200 微升 2% PFPE-PEG 氟化表面活性剂。使用涡旋混合器生成液滴，并根据需要调整涡旋速度和时间。

然后，目视检查液滴，确保其大小均匀。使用200微升移液器，将漂浮在上层的液滴和等体积的表面活性剂转移至PCR管中。将一根玻璃管浸入液滴层，等待液滴充满玻璃管约75%。

然后，将管子插入表面活性剂层中，并完全充满管子。接着，用矿物油填充玻璃底培养皿。随后，使用精细镊子将充满液滴的管子浸入油中。

使用玻璃移液管清除任何可见的碎屑或泄漏的液滴。为避免液滴移动和泄漏，应将充满液滴的玻璃管小心地浸入矿物油下方。我们可以用平衡力从玻璃管两端同时推动，或者先在玻璃管两端同时添加几滴矿物油。

此后，使用配备电动 xy 载物台的落射荧光显微镜对液滴进行成像。每隔六到九分钟在明场和多个荧光通道中记录延时视频，直至液滴失去活性。采用本方案，成功产生了在无核的简单细胞以及含核的复杂细胞中的有丝分裂振荡。

无细胞核的液滴在92小时内产生了长达30个无衰减的有丝分裂振荡周期。同时，也检测了有丝分裂振荡器驱动下游有丝分裂事件的能力。这种自持的有丝分裂振荡器通过自主改变不同的细胞周期时相，驱动了细胞核形态的变化。

在进行该实验操作时，需注意提取过程的时间控制，因为该步骤对时间敏感，且必须始终将卵和提取物置于冰上。该技术建立后，为系统生物学领域的研究人员探索复杂生物钟特性（如非洲爪蟾中生物钟的可调节性和随机性）的基本原理开辟了道路。