Name: 无细胞爪卵萃取物微乳液细胞周期振荡的重建 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 了解利用非洲爪蟾卵提取物微乳液重建体外有丝分裂振荡的方法。该技术为系统生物学研究细胞周期调控机制提供了高通量分析框架。

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感谢Madeleine Lu构建securin-mCherry质粒，感谢Lap Man Lee&#160;、Kenneth Ho和Allen P Liu&#160;在液滴生成方面的讨论，感谢Jeremy B. Chang和James E. Ferrell Jr提供GFP-NLS质粒。本研究得到美国国家科学基金会（早期职业奖#1553031）、美国国立卫生研究院（MIRA #GM119688）以及斯隆研究奖学金的支持。

本文所述所有方法均已获得密歇根大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 细胞周期重建与检测所需材料的准备
<ol>
	<li>利用Gibson组装克隆法构建securin-mCherry质粒DNA及mRNA纯化
	<ol>
		<li>通过聚合酶链式反应（PCR）和凝胶纯化制备三个DNA片段，包括pMTB2载体骨架、securin和mCherry21,22。</li>
		<li>使用荧光分光光度计测定各片段浓度。将100 ng的载体骨架与securin和mCherry插入片段按1:1:1的分子比例混合，并加入去离子水使反应总体积调整至5 µL。</li>
		<li>配制6 mL的5×等温组装反应缓冲液，包含3 mL的1 M Tris-HCl（pH 7.5）、300 µL的1 M MgCl2、600 µL的10 mM dNTP、300 µL的1 M DTT、1.5 g PEG-8000和20 mg NAD23。</li>
		<li>将混合后的DNA片段加入15 µL的1×等温组装反应缓冲液中。在PCR反应管中于50 °C孵育15分钟。</li>
		<li>制备0.8%琼脂糖凝胶，以10 V/cm的电压电泳，验证这些片段的退火效率。</li>
		<li>纯化构建好的质粒并用15 µL无RNase的水洗脱。取1 µL纯化的质粒DNA转化至50 µL DH5α感受态E. coli细胞24中以备后续使用。</li>
		<li>从DH5α感受态E. coli细胞中提取并纯化securin-mCherry质粒DNA。</li>
		<li>将线性化的securin-mCherry质粒DNA转录为mRNA并进行mRNA纯化。使用分光光度计检测，确保mRNA浓度高于100 ng/µL，且260 nm与280 nm处吸光度比值约为2.0。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去膜化Xenopus laevis精子DNA的制备 
	注：改编自Murray 19911。
	<ol>
		<li>处死成年雄性Xenopus laevis25，解剖四只雄性青蛙的睾丸26,27。</li>
		<li>将四只青蛙的睾丸置于同一个100 mL培养皿中，用50 mL冷的1×MMR溶液（0.1 M NaCl、2 mM KCl、1 mM MgCl2、2 mM CaCl2、5 mM HEPES、0.1 mM EDTA）清洗三次。</li>
		<li>在100 mL培养皿中去除睾丸中的多余血液和脂肪，然后用冷核提取缓冲液（NPB）（250 mM蔗糖、15 mM HEPES，pH 7.4、1 mM EDTA，pH 8.0、0.5 mM三盐酸亚精胺、0.2 mM四盐酸精胺）洗涤两次。</li>
		<li>去除核提取缓冲液（NPB），在100 mL培养皿中用锋利的解剖剪将睾丸剪成长度小于0.2 cm的小块。向睾丸组织中加入8 mL冷NPB以进一步破碎组织。</li>
		<li>使用孔径为70 µm的尼龙网膜过滤睾丸组织，将精子样品收集至15 mL锥形管中。在4 °C下以1,730 × g离心10分钟，弃去上清液。</li>
		<li>向精子细胞中加入1 mL NPB和50 µL 10 mg/mL溶血卵磷脂，在室温下孵育5分钟，以实现精子细胞的去膜化。</li>
		<li>用含3% BSA溶液的10 mL冷NPB洗涤去膜化后的精子DNA三次。</li>
		<li>使用血细胞计数板测定精子DNA的密度。</li>
		<li>将精子DNA以5 µL分装在液氮中速冻，并于-80 °C保存。精子DNA的最佳浓度约为105个细胞核/µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>GFP-核定位信号蛋白（GFP-NLS）的纯化
	<ol>
		<li>将带有GST标签的GFP-NLS质粒转化至BL21（DE3）感受态E. coli细胞5中。</li>
		<li>在不含抗生素的条件下于37 °C培养1小时，随后涂布于含100 µg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板上。</li>
		<li>将平板在37 °C孵育14至18小时，使细胞形成单菌落。挑取单菌落接种至含100 µg/mL氨苄青霉素的4 mL LB培养基中，于37 °C振荡培养12小时。</li>
		<li>配制已高压灭菌的YT培养基（16 g Bacto-胰蛋白胨、10 g Bacto-酵母提取物、5 g NaCl），并将YT培养基加热至37 °C。</li>
		<li>将1 mL过夜培养的LB菌液接种至250 mL预热的含100 µg/mL氨苄青霉素的YT培养基中，振荡培养2小时以增加细胞密度。</li>
		<li>每隔30分钟使用分光光度计在600 nm波长下测定细胞光密度（OD）。当OD值达到0.1时，加入0.1 mM IPTG诱导GFP-NLS蛋白表达。</li>
		<li>于18 °C振荡过夜培养，以降低细胞生长速率，促进蛋白的高效表达与合成。</li>
		<li>在4 °C下以34,524 × g离心5分钟，弃去上清液。</li>
		<li>将菌体沉淀重悬于40 mL PBS缓冲液中（含800 µL 50 mg/mL溶菌酶、100 µL 0.2 M PMSF、13.2 µL 10 mg/mL的亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制剂和抑肽酶混合液，以及8 µL 0.5 M EDTA），并在4 °C孵育20分钟。</li>
		<li>使用超声破碎仪在20 kHz频率下进行4次、每次30秒的超声处理，每次间隔30秒，以释放表达的GFP-NLS蛋白。</li>
		<li>在20,000 × g下离心35分钟，去除破碎的细胞碎片。</li>
		<li>采用亲和层析法提取并纯化GFP-NLS蛋白。</li>
		<li>用15 mL PBS缓冲液将1.5 mL珠浆洗涤三次，然后将250 mL裂解液与珠子在4 °C下颠倒孵育4小时。</li>
		<li>在2000 × g下离心5分钟收集珠子，向珠子中加入10 mL洗涤液（25 mM Tris碱，pH 7.5、500 mM NaCl、5 mM DTT）。将珠子与700 µL洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.8、20 mM还原型谷胱甘肽、5 mM DTT）在4 °C旋转孵育。收集50 µL洗脱液作为分装样品。</li>
		<li>通过考马斯亮蓝凝胶电泳测定所收集蛋白的浓度28。</li>
		<li>使用PD-10柱通过缓冲液置换，以3 mL储存缓冲液（20 mM HEPES、150 mM KCl、10%甘油，pH 7.7）洗脱蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 制备循环的Xenopus提取物
注意：提取物制备的整体流程如图1A所示。改编自Murray 19911。
<ol>
	<li>在产卵前10天，向三只性成熟的雌性Xenopus laevis注射66 IU的孕马血清促性腺激素（PMSG）。</li>
	<li>在制备周期性提取物前18小时，向这些Xenopus蛙注射500 IU的人绒毛膜促性腺激素（HCG），以诱导其产卵。</li>
	<li>弃去过夜产出的卵。根据实验结果（数据未显示），由新鲜挤出的卵制备的提取物比来自同一只雌蛙所产卵制备的提取物具有更持久的活性。将每只雌蛙的卵挤入含有10 mL 0.2x MMR缓冲液的100 mm培养皿中，并在体视显微镜下检查。</li>
	<li>弃去动物极与植物极边界不清晰或动物极顶部有不规则白色斑点的卵批次。</li>
	<li>选择来自一只雌蛙、卵群均一且动物极与植物极界限清晰的卵批次，并将这些卵转移至600 mL烧杯中。</li>
	<li>倒去多余的0.2x MMR缓冲液，轻柔加入250 mL含2 g/100 mL半胱氨酸（pH 7.7）的1x提取缓冲液（100 mM KCl、0.1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、10 mM HEPES、50 mM蔗糖，pH 7.7）至卵中。</li>
	<li>用手剧烈摇动卵，用共800 mL的半胱氨酸缓冲液分三次洗涤，每次约3分钟，直至卵聚集并沉降至烧杯底部，表明胶状膜已成功去除。</li>
	<li>用1 L的0.2x MMR溶液分四次洗涤卵。</li>
	<li>使用玻璃移液管挑出并弃去变白的卵。</li>
	<li>倒去MMR缓冲液，加入200 mL含0.1 µg/mL钙离子载体A23187的0.2x MMR缓冲液以激活卵。</li>
	<li>使用玻璃移液管的宽口端轻轻搅拌卵，直至卵被激活，然后去除钙离子载体溶液。</li>
	<li>待卵沉降至烧杯底部后，检查激活效率。激活良好的卵其动物极约占25%，植物极约占75%。</li>
	<li>用含蛋白酶抑制剂（亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制剂和抑肽酶各10 µg/mL）的1x提取缓冲液将激活后的卵洗涤两次，每次50 mL。</li>
	<li>小心将卵转移至0.4 mL带盖微型离心管中，先以200 × g离心60秒，再以600 × g离心30秒，使卵沉淀。</li>
	<li>使用玻璃巴斯德移液管吸除卵上层多余的缓冲液，以减少提取物的稀释。</li>
	<li>在4 °C条件下以15,000 × g离心10分钟，破碎卵细胞。</li>
	<li>用剃刀片切割离心管，分离破碎卵形成的三层结构，保留中间层的粗细胞质。</li>
	<li>将粗细胞质转移至新的超速离心管中，并加入蛋白酶抑制剂和细胞松弛素B，终浓度均为10 µg/mL。</li>
	<li>再次在4 °C条件下以15,000 × g离心5分钟，进一步纯化细胞质，去除多余的脂质和卵黄。</li>
	<li>将新制备的提取物置于冰上保存。</li>
</ol>
3. 液滴生成
<ol>
	<li>二维玻璃腔室的制备 
	注意：矩形玻璃管可作为限制液滴在单一二维平面内的腔室，便于观察和数据采集。
	<ol>
		<li>将内径为 2 mm × 100 µm 的矩形玻璃管切割成 4 mm 长的小段。使用磨石的锋利边缘，在玻璃管外表面用轻划痕标记所需切割位置，然后在划痕两侧轻轻施加压力，使玻璃管断裂成所需长度。</li>
		<li>将干浴孵育器预热至 95 °C。取出加热块并放入聚碳酸酯真空干燥器中。</li>
		<li>取一支 1.5 mL 微量离心管，加入 30 µL 三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷，置于加热块上。将切割好的玻璃管平放在真空干燥器内，距离加热块约 5 cm。</li>
		<li>将干燥器连接至真空泵。开启泵运行 1 分钟以达到所需真空度，随后关闭三通阀密封干燥器，使三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷蒸气在玻璃管内壁形成涂层。该涂层可形成疏水环境，有助于稳定液滴。</li>
		<li>将玻璃管留在干燥器中过夜进行涂层处理。次日即可使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>液滴生成与成像 
	注意：液滴生成与成像的操作流程如图 1B 和 1C 所示。
	<ol>
		<li>在仅进行细胞质周期实验时，向步骤 2 制备的提取物中加入 10 ng/µL 的 securin-mCherry mRNA。或者，向提取物中加入去膜精子染色质（每 µL 提取物含 250 个）、10 µM GFP-NLS 蛋白和 10 ng/µL securin-mCherry mRNA，以生成表现出周期性细胞核形态变化的液滴。</li>
		<li>在 1.5 mL 微量离心管中，将 20 µL 添加了重组蛋白或 mRNA 的提取物与 200 µL 溶于 HFE7500 氟化油中的 2% 全氟聚醚-聚乙二醇（PFPE-PEG）氟化表面活性剂混合。</li>
		<li>使用涡旋混合器生成液滴。液滴大小范围可通过涡旋速度和时间调节。为生成半径在 50 至 200 µm 范围内的液滴，将涡旋速度设为 56 ×g（半径 4.9 mm 时转速为 3,200 rpm），并将含有提取物与表面活性剂混合液的微量离心管轻轻压在混合器上持续 3.5 秒。目视检查液滴大小是否均匀。</li>
		<li>使用 20 µL 移液枪将漂浮在上层的液滴及等体积的 PFPE-PEG 表面活性剂转移至 PCR 管中。将步骤中制备的玻璃管插入 1.5 mL 微量离心管的液滴层中，等待液滴填充约 75% 的管长后，再将玻璃管推入表面活性剂层直至完全充满。此操作可降低液滴密度，使液滴在腔室内形成单层排列，避免因过度拥挤导致重叠或形变。</li>
		<li>在直径为 40 mm 的玻璃底培养皿中加入矿物油。使用精细镊子轻轻将装有液滴的玻璃管压入油中使其完全浸没。</li>
		<li>加载所有样品后，使用玻璃移液管清除任何可见的碎片或泄漏的液滴。若在成像过程中玻璃管未完全浸没，需补充矿物油确保完全覆盖。</li>
		<li>在配备电动 x-y 载物台的落射荧光显微镜上进行液滴成像（参见材料表）。所有成像均使用 4X 空气物镜。进行荧光成像时，采用 130 W 汞蒸气短弧灯作为荧光光源，使用 GFP 滤光片组（激发光 482/35 nm，发射光 514/LP nm）和 mCherry 滤光片组（激发光 562/40 nm，发射光 641/75 nm）分别检测 GFP-NLS 和 securin-mCherry 信号。</li>
		<li>每隔 6 至 9 分钟记录一次明场及多个荧光通道的时间序列图像，直至液滴失去活性为止。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 图像处理与数据分析
<ol>
	<li>液滴的分割与追踪
	<ol>
		<li>以以下格式导入记录的数据 &#34;.tif&#34; 或 &#34;.oif&#34; 导入图像分析软件（参见 材料表).</li>
		<li>使用明场通道对单个液滴进行分割。明场图像中，液滴呈现为亮色圆环，边界较暗。对图像进行阈值分割，通过调节明暗像素之间的阈值，为每个液滴添加追踪表面，使每个表面覆盖对应液滴的整个区域。</li>
		<li>使用自回归运动算法在相邻帧之间自动追踪片段。将液滴在两相邻帧间的可接受最大移动距离调整为小于大多数液滴的半径，以精确追踪小液滴。</li>
		<li>在整个视频中目视检查所有轨迹，以发现将液滴之间的空隙区域而非实际液滴进行分割的错误分割结果。手动删除错误的轨迹。</li>
		<li>分割并追踪无液滴区域的背景，以获取背景荧光强度。为提高信噪比，从每个时间帧的液滴荧光强度中减去背景强度。</li>
		<li>随时间导出每条轨迹的测量参数，包括荧光强度的平均值和标准差以及液滴面积 &#34;.csv&#34; 文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>液滴尺寸与振荡周期的数据分析
	<ol>
		<li>加载 &#34;.csv&#34; 将文件导入R中，以绘制每个液滴随时间变化的荧光强度图。记录液滴ID至 &#34;.csv&#34; 文件。</li>
		<li>导入 &#34;.csv&#34; 分析软件导出的文件以及 &#34;.csv&#34; 将包含液滴ID列表的文件导入Matlab并保存为 &#34;.mat&#34; 用于进一步数据分析的文件。</li>
		<li>根据分割后导出的液滴面积信息和玻璃腔室的高度，计算压缩液滴的体积19. 利用体积计算液滴作为球体的半径。</li>
		<li>使用峰谷检测算法提取峰和谷的时间点。对峰和谷的位置进行人工校正，以确保其被准确识别。</li>
		<li>通过计算两个相邻峰之间的时间间隔来确定细胞周期时长。将每个液滴中所有时间间隔的平均值作为该液滴的细胞周期时长。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Murray, A. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1839804">Cell cycle extracts.</a> Methods in Cell Biology. 36, 581-605 (1991).</li>
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我们没有需要披露的内容。

我们介绍了一种用于构建高通量人工细胞系统的新方法，该系统能够 体外 在单细胞水平上重建并长期追踪自持性细胞周期振荡。该方法的成功依赖于几个关键步骤。首先，需使用新鲜榨取的 非洲爪蟾 与已产出的卵相比，高质量的卵倾向于产生振荡活性维持时间更长的提取物。其次，将提取物封装于表面活性剂稳定的微环境中，对维持其振荡活性至关重要。第三，将油滴孵育于细管中，可使油滴限制为单层分布，便于图像处理和长期追踪。第四，在管内壁涂覆三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷作为抗黏附涂层以降低表面能，有助于保持提取物的活性。第五，用油密封管口可防止液滴流动，该封油方法还能防止蒸发，进一步保护提取物活性。上述措施共同提高了实验的成功率。 体外 液滴中稳健振荡的重建以及长期实验中对这些液滴的分割与追踪的准确性
为了制备微乳液液滴，我们采用了简单的涡旋法，该方法与一些其他研究中使用的方法类似29,30,<sup cl...

从……制备的细胞质提取物 Xenopus laevis 卵子因其卵母细胞体积大、细胞周期进程迅速，以及能够重建有丝分裂事件的能力，成为细胞周期生物化学研究中最主要的模型之一 体外1,2该系统已助力首次发现并从机制上表征了细胞周期调控中的关键因子，如促进成熟因子（MPF），以及下游有丝分裂过程，包括纺锤体组装和染色体分离。1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11。该 非洲爪蟾 卵提取物还被用于深入解析细胞周期时钟的调控网络8,12,13,14 以及对DNA损伤/复制检查点的研究15 有丝分裂纺锤体组装检查点16,17,18.
利用Xenopus卵提取物对细胞周期开展的这些研究主要基于群体测量。然而，传统的群体反应检测可能无法真实模拟细胞的实际行为，因为其体系尺寸以及反应分子的亚细胞空间区室化与真实细胞存在显著差异。此外，对有丝分裂活性的群体测量往往在经历有限次数的周期后迅速衰减8。这些群体反应的局限性阻碍了提取物系统进一步揭示细胞周期振荡器复杂的时钟动态特性与功能。近期研究已将细胞周期停滞于细胞静止因子（CSF）阶段的无细胞Xenopus提取物19,20封装到尺寸确定的类细胞区室中，有助于阐明胞质体积如何调控纺锤体大小。然而，该in vitro系统因细胞静止因子的作用而停滞于减数第二次分裂的中期1，要深入研究细胞周期振荡器，仍需建立可在单细胞水平长期维持振荡的实验体系。
为以单细胞分辨率研究细胞周期振荡，我们开发了一种细胞尺度的高通量系统，可在单个微乳液滴中重建并同时测量多个自持的有丝分裂振荡过程。在本详细视频方案中，我们演示了通过将周期性反应组分包裹在微滴中来构建人工有丝分裂振荡系统的方法 Xenopus laevis 大小为10至300 µm的微乳液中的卵细胞质。在该系统中，有丝分裂振荡包括染色体的凝集与去凝集、核膜的破裂与重建，以及后期底物的降解与合成（例如， 该方案中securin-mCherry已成功重建。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Xenopus laevis&lt;/em&gt; 蛙</td><td>Xenopus-I 公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep 自旋微量制备试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒 (250)</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 转录试剂盒</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3)-T-1 感受态细胞</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2935</td><td></td></tr><tr><td>钙离子载体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A23187</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>有毒</td></tr><tr><td>三氯甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931</td><td>有毒</td></tr><tr><td>(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PFPE-PEG 表面活性剂</td><td>Ran 生物技术公司</td><td>008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td><td></td></tr><tr><td>GE Healthcare 谷胱甘肽 Sepharose 4B 微珠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0756-01</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 柱</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>VitroCom 微型中空玻璃毛细管</td><td>VitroCom</td><td>5012</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZ61 体视显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX83 显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1200 共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 分光光度计</td><td>Thermofisher</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>0.4 mL 扣盖微量离心管</td><td>E&amp;K Scientific</td><td>485050-B</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNA 微量提取试剂盒</td><td>ThermoFisher (Ambion)</td><td>12183018A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 模拟涡旋混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>2215365</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>Version 7.3</td><td>图像分析软件</td></tr></tbody></table>

在无细胞微乳液中重建细胞周期振荡 非洲爪蟾 卵母细胞提取物

Reconstitution of Cell-cycle Oscillations in Microemulsions of Cell-free Xenopus Egg Extracts

在单细胞水平上实时测量振荡对于揭示生物钟的机制至关重要。尽管由大量细胞制备的提取物 Xenopus laevis 卵子在解析细胞周期进程背后的生化网络方面具有重要作用，尽管每个独立振荡器均可持续振荡，但其总体平均测量结果通常表现为阻尼振荡。这是由于在存在噪声的生物系统中，难以实现各个振荡器之间的完全同步。为了重建单个细胞中振荡器的动力学行为，我们开发了一种基于液滴的人工细胞系统，该系统能够在类似细胞的区室中包裹具有周期性活性的胞质提取物，从而重构有丝分裂周期。 Xenopus laevis 卵细胞。这些仅含细胞质的简单细胞可维持超过30个周期的持续振荡。为了构建含有细胞核的更复杂人工细胞，我们在体系中加入去膜精子染色质，以触发细胞核的自组装。我们观察到染色体周期性的凝缩/去凝缩以及核膜周期性的破裂/重建，类似于真实细胞中的行为。这表明有丝分裂振荡器能够准确地驱动多个下游有丝分裂事件。我们利用多通道延时荧光显微镜，在单个液滴中同时追踪了有丝分裂振荡器与下游过程的动力学变化。该人工细胞周期系统为定量操控和分析具有单细胞分辨率的有丝分裂振荡提供了一个高通量的研究框架，有望为细胞周期时钟的调控机制与功能提供重要见解。

在图2中，我们展示了该方案可在简单的无核细胞以及含有细胞核的复杂细胞中均产生有丝分裂振荡，其中振荡器驱动细胞核的周期性形成与变形。无核液滴在92小时的时间范围内可产生多达30个无阻尼的有丝分裂振荡周期，这通过荧光报告蛋白securin-mCherry的周期性合成与降解得以体现（图2A）。Securin是后期促进复合物APC/C的底物。因此，securin-mCherry在后期的降解表明了APC/C的活性。
为了检测有丝分裂振荡器驱动下游有丝分裂事件的能力，我们向细胞质提取物中额外添加了去膜精子染色质、纯化的绿色荧光蛋白-核定位信号（GFP-NLS）以及Hoechst 33342染料。 图2B 显示了在自持性有丝分裂振荡器驱动下，细胞周期不同阶段——间期（蓝色柱状图）和有丝分裂...

我们提出了一种用于生成 体外 通过包封卵母细胞提取物在单细胞水平实现自我维持的有丝分裂振荡 非洲爪蟾 在油包水微乳液中。

在单细胞水平上实时测量振荡对于揭示生物钟的机制至关重要。尽管粗提物……

该方法有助于回答系统生物学领域中的关键问题，例如有丝分裂网络背后的调控机制以及细胞周期钟的动力学特性和功能。该技术的主要优势在于能够生成大量液滴，每个液滴中包含多个细胞周期，从而为我们提供一个用于定量操作和分析的高通量研究框架。实验开始时，弃去动物极与植物极边界不清晰或动物极表面存在不规则白斑的卵母细胞批次。接下来，从一只雌性青蛙中选取合适的一批卵，并将卵转移至一个600毫升的烧杯中。倒去多余的0.2倍浓度的MMR缓冲液，然后在1倍提取缓冲液中轻轻加入半胱氨酸至卵中。随后，用手剧烈摇动烧杯，以去除卵的胶状外膜。用总共800毫升的半胱氨酸缓冲液重复此洗涤步骤三次，或直至卵子聚集并沉降到烧杯底部。去除胶状包被后，用1升0.2倍浓度的MMR溶液洗涤卵子四次。使用玻璃移液管吸除并弃去变白的卵子。将 MMR 缓冲液从烧杯中倒出，向卵中加入 200 毫升钙离子载体溶液。用玻璃移液管轻轻搅拌卵，直至其被激活，然后移除钙离子载体溶液。卵在钙离子载体溶液中停留过久会启动凋亡。我们将卵子搅拌1.5分钟，并检查激活效率。如果未激活，继续搅拌，并更频繁地检查，直至达到90%的激活率。待卵子沉降至烧杯底部后，再次检查激活效率。充分激活的卵子动物极约占25%，植物极约占75%。接下来，用含有蛋白酶抑制剂的提取缓冲液，总共50毫升，分两次洗涤卵子。然后，小心地将卵子转移至0.4毫升的扣盖微量离心管中。将微量离心管在200 ×g下离心60秒，然后在600 ×g下离心30秒，以沉淀收集卵子。每步操作后，使用玻璃巴斯德吸管移除卵子上方多余的缓冲液。随后，在4°C条件下，于15,000 ×g下破碎卵子10分钟。使用剃刀片切割试管，分离破碎卵子的三层结构，并保留中间层的粗制胞质。然后，将粗制胞质转移至洁净的超速离心管中。每毫升胞质中分别添加10微克的蛋白酶抑制剂和细胞松弛素B。将粗制细胞质在 15,000 g、4 °C 条件下离心 5 分钟。然后用剃刀片切割离心管，收集中间层的细胞质。将 freshly prepared 提取物置于冰上。首先，将 securin-mCherry mRNA 加入已制备的提取物中。接着，向提取物与mRNA的混合液中加入 200 微升 2% PFPE-PEG 氟化表面活性剂。使用涡旋混合器生成液滴，并根据需要调整涡旋速度和时间。然后，目视检查液滴，确保其大小均匀。使用200微升移液器，将漂浮在上层的液滴和等体积的表面活性剂转移至PCR管中。将一根玻璃管浸入液滴层，等待液滴充满玻璃管约75%。然后，将管子插入表面活性剂层中，并完全充满管子。接着，用矿物油填充玻璃底培养皿。随后，使用精细镊子将充满液滴的管子浸入油中。使用玻璃移液管清除任何可见的碎屑或泄漏的液滴。为避免液滴移动和泄漏，应将充满液滴的玻璃管小心地浸入矿物油下方。我们可以用平衡力从玻璃管两端同时推动，或者先在玻璃

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

无细胞爪卵萃取物微乳液细胞周期振荡的重建

粗制和分级的非洲爪蟾卵提取物可用于提供重建细胞过程所需的组分，以进行形态学和生物化学分析。通过卵细胞裂解及差速离心法制备粗制提取物，进而用于制备分级提取物和轻质膜组分。...

非洲爪蟾卵提取物的制备与分级分离

Xenopus tropicalis 卵提取物的制备用于鉴定微管相关RNA

本文描述了一种利用放射性标记和荧光素酶融合蛋白在Xenopus卵提取物中分析蛋白质降解的方法，并介绍了该方法在小分子蛋白质降解调节剂高通量筛选中的应用。...

在Xenopus卵提取物中重建β-catenin降解过程

我们描述了操作Xenopus laevis未成熟卵母细胞、卵母细胞体外成熟为卵子以及胞质内精子注射的方法。in...

操作与 体外 成熟 非洲爪蟾 卵母细胞，继以胞质内精子注射，用于研究胚胎发育

染色体高度凝缩的有丝分裂染色质去凝缩的分子机制尚不明确。我们提出一种基于从HeLa细胞分离的有丝分裂染色质簇建立的无细胞检测方法 Xenopus laevis 能够真实重建解凝过程的卵提取物 体外.

一种无细胞体系检测方法用于研究有丝分裂末期染色质去凝集过程

我们描述了一种利用Xenopus卵母细胞和动物帽系统进行基因表达克隆的方法，可用于筛选能够诱导有反应能力的外胚层产生应答的基因，并讨论了对这些基因进行后续分析的技术。该系统在多种基因产物的功能鉴定中具有重要应用价值。...

使用 Xenopus 卵母细胞表达系统进行功能克隆

细胞及细胞内比例调控的机制仍不明确。Xenopus...

使用Xenopus laevis胚胎提取物研究细胞核大小调控机制的无细胞实验

有丝分裂纺锤体的组装和定位依赖于微管动力学、马达蛋白和交联蛋白共同产生的作用力。本文介绍了我们近期开发的方法，该方法利用球形乳液液滴的几何限域，自下而上地重建基本的有丝分裂纺锤体。...

在球形乳液液滴中重建基础有丝分裂纺锤体

我们报告了两种细胞同步化方案，可为研究细胞周期特定阶段的相关事件提供背景。我们证明，该方法可用于分析在未受干扰的细胞周期中或在暴露于影响细胞周期的试剂时，特定基因的调控情况。...

通过两种互补的细胞同步化方案研究细胞周期调控的基因表达

我们描述了一种制备和实时成像非洲爪蟾（Xenopus...

Xenopus laevis 卵提取物制备及活体成像方法用于可视化动态胞质结构

提供了一种在微流控芯片上培养和操作小鼠胚胎组织的方案。通过施加通路调节剂的脉冲，该系统可用于外部控制信号振荡，从而对小鼠体节发生进行功能研究。...

一种用于研究调控体节发生信号振荡功能的微流控方法

了解利用非洲爪蟾卵提取物微乳液重建体外有丝分裂振荡的方法。该技术为系统生物学研究细胞周期调控机制提供了高通量分析框架。

在无细胞微乳液中重建细胞周期振荡非洲爪蟾卵母细胞提取物

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