Name: 虫媒病毒感染作为鉴定病毒免疫调节剂和宿主抗病毒因子的筛选工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: 了解虫媒病毒感染的筛选方法，用于鉴定病毒免疫调节剂和宿主抗病毒因子。该方法利用荧光和发光检测技术在鳞翅目昆虫细胞中定量分析病毒复制，为病毒免疫学研究提供可靠工具。

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D.G. 获得了德克萨斯大学西南医学中心冠名学者计划的资金支持。作者感谢迈克尔·惠特（Michael Whitt，田纳西大学健康科学中心）和肖恩·惠兰（Sean Whelan，哈佛医学院）提供VSV-DsRed和VSV-LUC。作者还感谢加里·卢克（Gary Luker，密歇根大学医学院）惠赠VACV-FL-GFP毒株。

1. 舞毒蛾（Lymantria dispar，LD652）细胞与病毒培养通则
<ol>
	<li>LD652 细胞培养与铺板
	<ol>
		<li>培养 L. dispar来源的LD652细胞，在培养基中维持细胞单层培养材料表在27 °C、正常大气条件下孵育。将细胞培养于10 cm组织培养处理皿中，当细胞融合度达到80%时进行传代。</li>
		<li>接种时，通过反复吹打培养基使贴壁的LD652细胞从培养板上脱落（此类细胞无需胰酶消化即可脱落），然后用生长培养基将样品稀释至约1 x 10的密度5 细胞/mL。用移液器将1 mL稀释后的培养液加入24孔板的每个孔中。每种处理类型的每个时间点至少设置三个重复孔（每块板最多可进行八种处理）。</li>
		<li>让细胞静置至少1小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>痘苗病毒制备
	<ol>
		<li>为制备VACV毒株，需在HeLa细胞中扩增病毒20 或非洲绿猴肾细胞（BSC-1 或 BSC-40 细胞）20,21,22. 
		注意：VACV 西部储备株（VACV-WR）在本文所述的实验中效果良好。</li>
		<li>滴定VACV毒株 通过 在 BSC-1 或 BSC-40 细胞上进行噬斑测定20,22. 
		注意：本文中所述LD652细胞感染所用的VACV感染复数（MOI）均基于BSC-40细胞噬斑实验测定的滴度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>水疱性口炎病毒制备 
	<ol>
		<li>为制备VSV毒株，需在BHK细胞中扩增病毒23.</li>
		<li>在 BSC-40 或 BHK 细胞单层上通过噬斑实验滴定 VSV13,23. 
		注意：本文中所述用于LD652细胞感染的所有VSV感染复数（MOI）均基于BSC-40细胞空斑实验所获得的滴度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 利用共感染和活细胞成像的基于荧光的VSV拯救实验
<ol>
	<li>LD652 细胞的接种与感染
	<ol>
		<li>将 40,000 个 LD652 细胞接种至 8 孔板的每个孔中。</li>
		<li>对于基于荧光的活细胞成像，使用编码荧光蛋白的 VSV 毒株。本实验采用 VSV-DsRed17，这是一种表达游离 DsRed 蛋白的重组 VSV 毒株，DsRed 未与其他任何 VSV 蛋白融合。 
		注意：LD652 细胞在感染后 96 小时内未出现细胞病变效应，因此在该时间范围内评估 VSV 复制时，细胞死亡不会构成干扰因素。</li>
		<li>在无血清培养基（SFM；材料表）中分别将 VSV-DsRed 和 VACV-FL-GFP 配置为 MOI 1 和 MOI 25。 
		注意：VACV-FL-GFP 是一种表达 LUC 与 GFP 融合蛋白的重组 VACV 毒株24。对 VACV 毒株使用 MOI 25 或更高可确保所有 LD652 细胞均被感染13。若使用其他共感染病毒，MOI 需由使用者通过实验经验确定。每种感染处理应设置两个重复孔，并包括仅加入 SFM 的模拟感染对照组。</li>
		<li>将细胞在 0.2 mL 接种液中于 27 °C 培养 2 小时。</li>
		<li>用 0.5 mL/孔的生长培养基洗涤细胞。</li>
		<li>将细胞在含 25 μM 细胞活力染料（材料表）的生长培养基中于 27 °C 孵育 45 分钟。</li>
		<li>吸除培养基，并用 0.5 mL/孔洗涤液洗涤孔板一次，以去除多余染料。</li>
		<li>每孔加入 0.3 mL 生长培养基维持细胞培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活细胞图像采集
	<ol>
		<li>提前 30 分钟开启共聚焦显微镜，并装载 8 孔板。 
		注意：LD652 细胞可在 20–25 °C 的室温下成像，但为获得最佳条件，建议将室温调节至 27 °C。</li>
		<li>为每种待成像的荧光标记蛋白设置适当的激发/发射参数，同时设置相差图像的采集参数。</li>
		<li>调节每个通道的激光强度。 
		注意：可能需要先进行预实验，以确定整个实验时间过程中荧光信号强度的范围，从而优化最终实验的设置。</li>
		<li>使用 10X 物镜，在整个感染期间每隔 1–5 小时对每个孔采集相差图像和荧光图像，直至达到预定时间点（例如，48–72 hpi）。 
		注意：为准确估算整个培养体系中的感染率，每个孔应采集多个视野图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>图像分析
	<ol>
		<li>使用图像分析软件对适当的荧光通道（例如，405 nm、488 nm、568 nm）进行自动图像分析。</li>
		<li>为计算感染细胞的百分比，将各处理组所有视野中显示 VSV 感染的荧光阳性细胞总数（例如，VSV-DsRed 感染中的 DsRed 阳性细胞）除以细胞活力染料标记的活细胞总数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 基于生物发光的LD652细胞VSV拯救实验通用病毒感染方案
<ol>
	<li>接种物的制备
	<ol>
		<li>感染前30分钟，解冻VSV-LUC16（一种表达游离萤火虫荧光素酶蛋白、未与其他VSV蛋白融合的重组VSV毒株）。若需检测VACV共感染期间VSV-LUC的拯救效应，还需将VACV-WR病毒置于冰上解冻。 
		注意：除VACV-WR外，其他病毒也可能在共感染过程中拯救VSV-LUC，但需由使用者通过实验自行确定。</li>
		<li>通过将VSV-LUC在有或无VACV-WR的情况下稀释于SFM中，配制接种物，使得加入0.2 mL/孔的总接种体积时，MOI分别达到10和25。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞感染
	<ol>
		<li>小心吸除成熟的LD652培养基，避免破坏单层细胞，每孔接种0.2 mL病毒液。此时间定义为0 hpi。向额外的孔中加入无菌SFM，作为“模拟感染”的阴性对照处理。</li>
		<li>将细胞在接种物中于27 °C孵育2小时。</li>
		<li>在2 hpi时，通过吸除法移除接种物，并每孔加入1 mL LD652生长培养基。</li>
		<li>继续感染过程至24–72 hpi。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 荧光素酶检测
<ol>
	<li>细胞裂解液的制备
	<ol>
		<li>小心吸除上清液，每孔加入 1 mL 的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）。</li>
		<li>使用 1 mL 注射器的推杆将细胞刮入 DPBS 中。</li>
		<li>将细胞转移至微量离心管中，在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 20 分钟。</li>
		<li>同时，在无菌 H2O 中配制 5× 报告裂解缓冲液（RLB）的 1× 稀释液。</li>
		<li>离心结束后，小心吸除 DPBS，注意不要扰动细胞沉淀。</li>
		<li>将每份沉淀重悬于 150 µL 的 1× RLB 中。</li>
		<li>通过在 -80 °C 冰箱中孵育 5 分钟，随后在室温水浴中快速解冻，对样品进行一次冻融循环。将裂解液保存在 -80 °C，待分析时使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光素酶检测
	<ol>
		<li>将裂解液置于冰上解冻。</li>
		<li>用移液器将 20 μL 裂解液加入到不透光的黑色或白色 96 孔微孔板的各孔中。</li>
		<li>向每个孔中加入 100 μL 荧光素酶检测试剂。</li>
		<li>立即使用化学发光仪测量光强度（针对特定化学发光仪的合适参数需由用户通过实验确定）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光素酶检测分析
	<ol>
		<li>将每种处理组的相对光单位（LU）信号相对于对照处理组的 LU 读数进行归一化处理（代表性结果）。在完成至少三次独立实验后，可对各处理组/对照组获得的平均 LU 值采用适当的统计学方法进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 免疫印迹
<ol>
	<li>使用为LUC检测提取的裂解液进行SDS-PAGE及随后的免疫印迹分析，并采用适当的试剂和仪器。</li>
</ol>
6. 来自LD652细胞培养物的VSV滴度测定
<ol>
	<li>根据步骤1.1接种LD652细胞。</li>
	<li>根据步骤3对细胞进行病毒感染。</li>
	<li>在预定时间点，将上清液收集至无菌微量离心管中。</li>
	<li>在4 °C条件下，以1,000 × g离心10分钟，沉淀细胞，并将上清液转移至新管中。</li>
	<li>将上清液储存于-80 °C，或立即在BSC-40细胞上通过噬斑实验进行滴度测定。 
	注意：若从含有VACV的LD652细胞培养物中滴定VSV，建议在感染后2小时内向BSC-40细胞培养基中添加100 μg/mL阿糖胞苷（AraC），以防止残留的VACV颗粒在BSC-40单层细胞上形成噬斑13。AraC是一种病毒DNA聚合酶抑制剂，可阻断VACV的DNA复制25，但不影响VSV的复制。</li>
</ol>
7. 基于生物发光的VSV拯救实验在LD652细胞中的变异：RNAi与质粒转染实验
<ol>
	<li>用于RNAi介导的病毒或宿主转录本敲低的dsRNA制备
	<ol>
		<li>设计特异性引物，在5’端添加T7启动子序列（TAATACGACTCACTATAGGG），以靶向共感染病毒（例如，VACV）或 L. dispar 目标mRNA转录本。这些引物应产生400–600 bp的PCR产物，以实现有效的RNAi介导的基因沉默。参见Gammon 等13 用于敲低VACV的引物序列如下 L. dispar 通过dsRNA介导的RNAi在LD652细胞中转录。 
		注意： L. dispar mRNA转录本可从已发表的文献中鉴定 L. dispar 转录组数据库26,27,28.</li>
		<li>生成DNA模板 通过 RT-PCR（cDNA合成：50 °C 30分钟，1个循环；PCR：94 °C 15秒、50 °C 30秒、68 °C 45秒，共40个循环）。</li>
		<li>使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。</li>
		<li>以纯化的PCR产物作为模板， 体外 使用体外转录法转录并纯化dsRNA 体外 转录与纯化试剂盒</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将dsRNA或质粒DNA转染至LD652细胞
	<ol>
		<li>接种 1 × 105 24孔板中每孔接种细胞，并静置至少1小时使细胞贴壁。</li>
		<li>每个待转染孔中，将4 μL转染试剂加入100 μL无血清培养基（SFM）中稀释，室温孵育最多15分钟。可根据需要按比例放大配制所有转染用的主混合液。</li>
		<li>每孔用 100 μL SFM 稀释至多 1 μg 的 dsRNA 或总质粒 DNA。室温孵育最多 15 分钟。 
		注意：我们先前发现，每106个细胞转染1 μg的dsRNA/106个细胞5 LD652 细胞足以用于 &#62;病毒或宿主转录本的80%敲低13但针对修改后的实验设置或条件，所需的dsRNA剂量须通过实验确定。</li>
		<li>将转染试剂与dsRNA/质粒DNA稀释液按1:1比例混合（例如将100 μL稀释的dsRNA与100 μL稀释的转染试剂混合，室温孵育20分钟。</li>
		<li>同时，用1 mL/孔的无血清培养基洗涤各孔，然后向每孔加入500 μL无血清培养基。</li>
		<li>将转染试剂与dsRNA（或质粒DNA）的混合物逐滴缓慢加入每孔中。</li>
		<li>将转染试剂与细胞共同孵育5小时。
		<ol>
			<li>对于涉及敲低共感染病毒所编码转录本的RNAi实验（例如，VACV），在转染孵育5小时后，弃去转染试剂，加入含有VSV-LUC的病毒接种物（可含或不含VACV或其他共感染病毒）（步骤3）。随后在感染后2小时（2 hpi），弃去含有VSV-LUC的病毒接种物，更换为完全培养基。可在不同时间点对裂解液进行LUC检测（步骤4），以确定共感染病毒转录本的敲低是否导致VSV-LUC拯救作用的丧失。</li>
			<li>涉及RNAi的RNAi实验 L. dispar 转录本，将转染混合物替换为完全培养基，转染后孵育24小时以实现基因敲低，随后进行VSV-LUC感染（步骤4）。可在不同时间点对提取的裂解液进行LUC检测（步骤4），以确定基因敲低是否成功 L. dispar 转录本促进VSV-LUC的拯救。</li>
			<li>对于涉及转染表达候选免疫调节因子的质粒表达载体的实验，替换转染试剂，并在感染VSV-LUC（步骤4）前孵育24小时以允许蛋白表达。随后可在不同时间点对提取的裂解液进行LUC检测（步骤4），以确定候选免疫调节蛋白的表达是否促进VSV-LUC的恢复。 
			注意：此处描述的转染条件使用 1 μg/孔的质粒 DNA，可达到 40–60% 的转染效率13.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了基于荧光和发光的简单检测方法，用于筛选能够挽救VSV在限制性鳞翅目细胞培养物中复制的条件。VSV在鳞翅目细胞中的中止性感染在检测VSV基因表达时可产生极佳的信噪比。例如，单次VSV-LUC感染裂解物中检测到的发光单位（LU）信号比模拟感染裂解物高出约1000倍，但在72小时的时间过程中，这些信号仅变化约两倍。相比之下，在感染72小时时，VSV-LUC与VACV共感染导致的LU信号比单次VSV-LUC感染增强约300倍。因此，VSV挽救检测具有极佳的动态范围，跨越多个数量级。
建立这些检测方法的关键步骤之一是决定采用基于荧光还是基于发光的方法来检测VSV的拯救效果。我们已展示了如何利用活细胞成像技术及相应的软件工具，对VSV编码的DsRed信号进行定量分析，这些软件可自动量化在存在或不存在拯救性共感染情况下的DsRed阳性细胞。如果研究人员具备活细胞成像条件，这类检测方法建立成本较低，并可采集多个时间点的数据，有助于发现仅在较窄时间窗口内才可观察到的VSV复制动力学差异。相比之下，基于发光的检测本质上属于终点检测，需要在预设的时间点制备细胞裂解液，而裂解液的制备过程可能较为...

病毒能否在特定宿主中有效复制，部分取决于宿主细胞中支持病毒进入和复制的宿主因子是否可用1。病毒的宿主范围还可能由病毒对抗细胞抗病毒防御机制的能力所决定，若无法有效对抗，这些防御机制将阻碍病毒复制2,3。正是这些复杂的病毒-宿主相互作用的结果，最终决定了病毒是否能在特定宿主中完成其生命周期。鉴于病毒复制可能对宿主造成致病性后果，建立实验策略以深入理解那些可能决定感染是中止还是成功的关键病毒-宿主相互作用至关重要。阐明病毒与宿主相互作用的分子特征，将有助于开发新型及替代性的抗病毒治疗策略。
随着RNA干扰（RNAi）4,5 和基因组编辑工具（例如，CRISPR-Cas9、锌指核酸酶、TALENs）6,7 的出现，现在在全基因组范围内改变细胞因子的表达并研究这些改变对病毒复制的影响已成为可行的实验手段。事实上，已有大量基于RNAi和基因组编辑的筛选研究在无脊椎动物和脊椎动物的宿主细胞类型中开展，揭示了病毒与宿主相互作用的新层面8,9,10,11,12。这些筛选通常采用编码报告基因的病毒，例如萤火虫荧光素酶（LUC）或荧光蛋白（例如，GFP、DsRed），从而通过定量检测病毒基因表达水平来间接反映病毒复制情况9,12。该策略使研究人员能够识别促进或抑制病毒复制的宿主因子，其依据分别为病毒报告信号的增强或减弱9,12。然而，在绝大多数情况下，这些筛选所使用的病毒均已高度适应其被研究的宿主细胞类型。尽管该策略对于理解病毒病原体与其天然宿主之间的协同进化关系具有重要意义，但在用于发现宿主抗病毒因子方面却存在根本性局限。在此类筛选中，研究者期望观察到的是RNAi敲低后病毒报告信号的增强，即某个细胞因子被抑制后原本对病毒复制的阻碍作用被解除。首先，如果病毒在对照条件下已能在宿主细胞中高效复制，则筛选的动态范围（即，区分背景信号与增强的病毒报告信号的能力）可能受限。其次，当病毒对宿主细胞高度适应，并且能够有效拮抗筛选中所靶向的宿主防御通路时，这一问题将进一步加剧。
鉴于传统病毒-宿主相互作用筛选方法存在上述问题，我们开发了一种新的研究范式，利用鳞翅目昆虫细胞中天然发生的非完整虫媒病毒感染来研究病毒与宿主的相互作用。该策略基于一个观察结果：已被广泛研究的人类虫媒病毒——水泡性口炎病毒（VSV），在舞毒蛾（L. dispar）来源的细胞中会发生非完整感染13。VSV 自然状态下由双翅目昆虫（即，白蛉）传播至哺乳动物宿主，并已被实验证实可在细胞培养和体内条件下感染多种无脊椎动物和脊椎动物宿主14。VSV 拥有约 11 kb 的负链单链 RNA 基因组，编码五种亚基因组 mRNA，每种 mRNA 翻译产生构成包膜病毒颗粒的蛋白质。然而，借助 VSV 的反向遗传系统，已可构建出除表达五种天然 VSV 基因产物外，还能表达荧光素酶（LUC）或荧光蛋白的复制能力完整的病毒株15,16,17。由于这些报告蛋白不会被整合进 VSV 病毒颗粒中，因此可作为病毒进入细胞后基因表达的便捷检测指标。我们先前的研究表明，在 LD652 细胞中，VSV 基因表达在病毒进入后即受到严重抑制，且感染后 72 小时（hpi）病毒滴度未见升高。相比之下，当 LD652 细胞同时感染 VSV 与哺乳动物痘病毒——痘苗病毒（VACV）时，VSV 的基因表达水平和病毒滴度在此时间点均呈对数级增长。VACV 在 LD652 细胞中可完成早期基因表达、DNA 复制及晚期基因表达，但其复制周期最终仍为非完整感染，原因是病毒颗粒形态发生不完全18。VACV 拥有约 192 kb 的大型 DNA 基因组，编码&#62;200 种蛋白质，其中许多蛋白具有免疫调节功能，可通过抑制宿主免疫应答来促进病毒复制19。因此，我们推测 VACV 与 VSV 共感染时对 LD652 细胞中 VSV 复制的&#34;拯救&#34;作用，很可能是由 VACV 的免疫调节因子介导的，这些因子抑制了原本限制 VSV 复制的L. dispar 宿主反应。支持这一假设的是，使用宿主 RNA 聚合酶 II 抑制剂放线菌素 D 处理 LD652 细胞，同样能够恢复 VSV 在该细胞中的复制，表明依赖转录的宿主反应在病毒进入后阻断了 VSV 的复制过程13。
上述观察结果表明，LD652细胞对VSV感染的天然限制性可能在筛选可增强VSV编码报告基因信号的条件时提供相对较低的背景信号即，那些抑制宿主抗病毒防御的因子）。本文提供了利用基于荧光或荧光素酶（LUC）的检测方法来筛选能够解除鳞翅目细胞中水疱性口炎病毒（VSV）限制条件的实验方案。首先，我们展示了如何利用这些检测方法鉴定病毒编码的免疫调节因子，这些因子可在共感染实验中或通过异位表达候选病毒因子的方式打破VSV的限制。作为示例，我们说明了如何利用这些筛选技术鉴定出痘病毒编码的A51R蛋白为一类新的免疫调节因子家族，该家族可在无其他痘病毒因子存在的情况下恢复VSV的复制。13其次，我们展示了在限制性VSV-LD652细胞感染中进行RNAi筛选，可用于直接鉴定参与节肢动物传播病毒限制的真核宿主因子13.

<table><tbody><tr><td>6孔组织培养板</td><td>CELLTREAT</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>24孔组织培养板</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td></td></tr><tr><td>10 cm组织培养皿</td><td>Corning</td><td>C430167</td><td></td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>G8142</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 420</td><td>Sigma</td><td>14420C</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清 - Optima</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td></td></tr><tr><td>生长培养基</td><td></td><td></td><td>Grace's Insect Medium 与 EX-Cell 420 无血清培养基按1:1混合，并含有1%抗生素-抗真菌素溶液和10%胎牛血清</td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌素溶液（100&amp;times;）</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>无血清培养基（SFM）</td><td>Thermo Fisher</td><td>10902096</td><td></td></tr><tr><td>阿糖胞苷</td><td>Sigma</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>转染试剂</td><td>Thermo Fisher</td><td>10362100</td><td></td></tr><tr><td>Corning cellgro 二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Corning</td><td>25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>报告基因裂解缓冲液 5x</td><td>Promega</td><td>E3971</td><td></td></tr><tr><td>荧光素酶检测试剂</td><td>Promega</td><td>E1483</td><td></td></tr><tr><td>96孔微孔板</td><td>Corning</td><td>3915</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗FLAG抗体</td><td>Wako</td><td>014-22383</td><td></td></tr><tr><td>兔抗萤火虫荧光素酶抗体</td><td>Abcam</td><td>ab21176</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗肌动蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗VSV M抗体</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>John Connor博士（波士顿大学）</td></tr><tr><td>小鼠抗VACV I3L抗体</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>David Evans博士（阿尔伯塔大学）</td></tr><tr><td>8孔腔室培养皿</td><td>Lab-Tek II</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>细胞活力染料</td><td>Thermo Fisher</td><td>C12881</td><td></td></tr><tr><td>FLUOstar 微孔板读数仪</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV10i-LIV</td><td></td></tr><tr><td>图像分析软件</td><td>Olympus</td><td>v1.18</td><td>cellSens软件</td></tr><tr><td>Eppendorf 5702 通风型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>22628102</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc 红外成像系统</td><td>Li-COR Biosciences</td><td>Odyssey Fc</td><td></td></tr><tr><td>LD652细胞</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Basil Arif博士（加拿大自然资源部）</td></tr><tr><td>BSC-40细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-2761</td><td></td></tr><tr><td>BHK细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-10</td><td></td></tr><tr><td>HeLa细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>BSC-1细胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-26</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;转录与纯化试剂盒</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1626</td><td></td></tr><tr><td>PCR纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr></tbody></table>

利用虫媒病毒感染作为筛选工具鉴定病毒免疫调节因子和宿主抗病毒因子

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

基于RNA干扰和基因组编辑的筛选平台已被广泛用于鉴定限制病毒复制的宿主细胞因子。然而，这些筛选通常是在对所研究病毒病原体天然易感的细胞中进行的。因此，在对照条件下病毒的高效复制可能会限制此类筛选的动态范围。此外，如果病毒已很好地适应宿主并具备对抗抗病毒防御的能力，则这些筛选可能难以有效识别限制病毒复制的细胞防御通路。本文中，我们描述了一种探索病毒-宿主相互作用的新范式，即利用以节肢动物传播病毒（如水疱性口炎病毒，VSV）天然流产性感染为核心的筛选方法。尽管VSV能够在多种双翅目昆虫和哺乳动物宿主中复制，但在来源于鳞翅目昆虫（例如舞毒蛾（Lymantria dispar））的多种细胞系中，VSV感染在进入细胞后会表现为流产性感染。然而，当宿主细胞的抗病毒防御功能受损时，这些流产性的VSV感染可以被&#34;拯救&#34;。我们阐述了如何将携带便捷报告基因的VSV毒株与对VSV具有限制性的L. dispar细胞系相结合，建立筛选体系以鉴定参与节肢动物病毒限制的宿主因子。此外，我们还展示了这些筛选工具在鉴定病毒编码因子方面的实用性，这些因子可通过共感染或异位表达来拯救VSV复制，包括哺乳动物病毒所编码的因子。VSV在L. dispar细胞中的天然复制限制在筛选促进VSV拯救的条件时提供了高信噪比，从而使得基于发光和荧光的简单检测方法即可用于监测VSV复制水平的变化。这些方法对于理解宿主抗病毒反应与病毒免疫逃逸因子之间的相互作用具有重要价值。

以活细胞成像技术监测VACV共感染条件下VSV恢复情况的应用为例，将LD652细胞接种于8孔板中，随后进行模拟感染或接种VSV-DsRed（MOI = 1），同时设置有或无VACV-FL-GFP（MOI = 25）共感染的实验组。由于VSV-DsRed表达的DsRed为游离蛋白，并未与VSV结构蛋白融合（图1A），因此仅在VSV进入细胞并启动基因表达后方可被检测到。所有细胞均用细胞活力染料进行标记，该染料可自由穿过细胞质膜，并在细胞内转化为不能透过膜的产物，从而促进荧光信号在标记细胞中的保留。使用405 nm、488 nm、568 nm激光及白光滤光片，每隔5小时采集一次图像，分别用于获取细胞活力染料、VACV-FL-GFP、VSV-DsRed以及相差（PC）通道的信号，持续至感染后65小时（hpi）。在单独感染条件下，LD652细胞可限制VSV-DsRed的复制，因此仅有少量细胞呈现DsRed信号。然而，在VSV-DsRed与VACV-FL-GFP共感染的情况下，随时间推移，大多数细胞在实验结束时均表现出DsR...

本文介绍了用于鉴定以下两类分子的实验方案：1）促进节肢动物传播病毒（arbovirus）复制的病毒编码免疫调节因子；2）限制节肢动物传播病毒复制的真核宿主因子。这些基于荧光和发光的检测方法使研究人员能够在信号-背景比低的简单实验体系中，快速获得节肢动物传播病毒复制的定量结果。

基于RNA干扰和基因组编辑的筛选平台已被广泛用于鉴定限制病毒复制的宿主细胞因子。

该方法有助于解答病毒免疫学领域中的关键问题，例如，哪些宿主因子能够限制节肢动物传播病毒（arbovirus）的复制，以及反过来，病毒编码的哪些免疫逃逸蛋白能够克服这些宿主限制机制。该技术的主要优势在于，它允许研究者利用简单的发光和荧光检测方法，来确定在原本无法完成感染的鳞翅目昆虫细胞中，支持节肢动物传播病毒复制的细胞条件。由于节肢动物传播病毒在鳞翅目细胞中的背景复制水平极低，因此研究人员能够相对容易地检测出支持其复制的特定条件。首先，将LD652细胞培养于10厘米经组织培养处理的培养皿中，当细胞融合度达到80%时进行传代。反复用移液器将培养基吹打至细胞单层表面，使细胞脱落，然后将细胞悬液用生长培养基稀释至大约每毫升10万个细胞的密度。随后，将1毫升稀释后的细胞悬液转移至24孔板的每个孔中。然后，让细胞沉降至少一小时。在感染前30分钟，将VSV荧光素酶和痘苗病毒的冻存管置于冰上解冻。随后，将VSV荧光素酶分别用或不用痘苗病毒稀释于无血清培养基（SFM）中，使其感染复数（MOI）分别达到10和25。小心吸出成熟的 LD652 培养基，避免扰动细胞单层，每孔接种 0.2 毫升病毒。接着，向其他孔中加入无菌 SFM，作为模拟感染的阴性对照。将细胞在接种物中于 27°C 孵育 2 小时。然后，通过抽吸去除接种物，并向每个孔中加入一毫升 LD652 生长培养基。此后，让感染继续进行 24 至 72 小时。首先，小心抽吸上清液，并向每个孔中加入一毫升 DPBS。使用注射器活塞将细胞刮入DPBS中。然后将细胞转移至微量离心管中，在400 × g、4 °C条件下离心20分钟。同时，用无菌水将五倍稀释的报告裂解缓冲液稀释。离心后，吸除 DPBS，注意不要扰动沉淀。接着，将沉淀重悬于 150 µL 1 倍 RLB 中。然后，将样品在 −80 °C 条件下孵育，随后在室温水浴中快速解冻。此后，将裂解液于负80摄氏度保存，以用于后续分析。将裂解液置于冰上解冻，并用移液器将20微升裂解液加入96孔板的各孔中。接着，向板的每个孔中加入100微升荧光素酶检测试剂。立即使用流明计测量光强度。在单次感染条件下，LD652细胞会限制VSV荧光素酶的复制，因此仅能观察到微弱的荧光素酶信号。然而，共感染会导致荧光素酶信号显著升高。在单独感染条件下，LD652 细胞会限制 VSV dsRED 的复制，因此仅有少量细胞表现出 dsRED 信号。然而，与痘苗病毒共感染后，随着时间推移，大多数细胞最终均显示出 dsRED 信号。单次感染后约65小时，约有2%的细胞呈dsRED阳性。相比之下，在相同时间点，约77%的共感染细胞呈dsRED阳性。在进行该实验时，重要的是要优化荧光素酶检测或活细胞成像的时间点，以确保VSV有足够时间进行复制并产生可检测的信号。在完成该实验步骤后，可进一步开展其他方法，例如通过RNA干扰介导的宿主因子敲低，以鉴定可能限制节肢动物传播病毒复制的潜在宿主抗病毒因子。该技术建立后，为病毒免疫学领域的研究人员阐明痘病毒编码的A51R蛋白在促进痘病毒复制及致病过程中的作用奠定了基础。请注意，操作真核病毒可能具有极高危险性，因此在进行该实验时采取适当的防护措施至关重要，例如佩戴个人防护装备。

arbovirus-infections-as-screening-tools-for-identification-viral

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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