基于网模的无支架三维心脏组织创建方法

该协议描述了一种新颖且简单的基于霉菌的三维心脏组织创建方法，该方法使用球体作为无支架心脏组织创建的工具。在我们的实验中，分离了三种类型的细胞，即人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞、人心脏成纤维细胞和人脐静脉内皮细胞，并用于生成细胞悬液。在 50ML 锥形管中含有 70% 心肌细胞、15% 成纤维细胞和 15% 内皮细胞。

然后，我们将细胞悬液分配到超低附着悬滴系统的每个孔中，这将导致三天后自发形成数百个跳动的球体。然后收获球体并放入新颖的模腔中。然后将组织保存在装有培养基的无菌容器中，在培养箱中的振荡器上保存数天。

随后去除霉菌，得到具有机械完整性的无支架组织补片。悬滴装置是一种可重复使用的超低附着孔，具有 850 个微孔，每个微孔的直径为 350 微米。悬滴与标准 6 孔板兼容。

制备细胞悬液后，我们将含有 1000 万个细胞的 4 毫升细胞悬液分配到悬滴系统的每个孔中。这些设备在 37 摄氏度、5% 二氧化碳和 95% 湿度下培养。72 小时后，观察到平均直径为 350 微米的跳动球体的自发形成。

通过将悬滴装置放入另一个装有培养基的培养皿中，轻轻旋转以释放球体并让它们流过悬滴系统底部的孔隙来收获球体。这是用于三维、无支架、心脏组织创建的新型模具的示意图。它包括处理垫、填充底座和新型模具。

该新型模具由底座、底方板、底网、10层用细不锈钢镶脚制成的侧网组成。顶网、顶方板、固定管和塞销。Novel Mold 系统可以制造不同尺寸的组织，包括 2 x 2 毫米、4 x 4 毫米和 6 x 6 毫米。

使用角柱堆叠和对齐底网。然后在一对无菌镊子的帮助下，将 10 层侧网交替堆叠，形成一个由细不锈钢叉组成的网。然后用 1X 磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 冲洗填充基底，以降低表面张力，然后将球体固定到新型模具中。

在相同的甲烷中润湿新型模具型腔后，球体被固定在所需大小的预定型腔中。就位后，多余的介质通过净模排出，使球体填充并呈现预定义型腔的形状。然后将顶网和顶方板组装到角柱上，并固定止动销和固定管，以防止球体冲刷。

将填充的新型模具系统转移到含有 6 毫米 B-27 补充培养基的六孔板中，然后在摇床上的培养箱中以 30 至 40 RPM 的速度保持 7 至 10 天。孵育的持续时间可以改变，具体取决于心脏补片的大小。孵育后，取出系统，取出固定管、塞子、顶部方板和顶网。

然后小心地将分层的侧网一个一个地滑出，注意不要破坏组织。去除所有侧网后，在底网顶部获得完整的心脏补片。在 24 小时内观察到功能性同步跳动。

这种基于模具的新型方法是创建无三维支架心脏组织的一种高效且简单的方法，只需最少的手动作。所得的多层组织由融合的球体组成，具有令人满意的结构完整性和同步跳动行为。这种基于霉菌的新型方法为当前工程组织的生物制造方法提供了一种经济高效且可扩展的替代方案。