人源化 NOD/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 小鼠模型在 HIV 复制与潜伏研究中的应用
2019年1月7日
本方案介绍了一种通过向经辐射处理的新生NSG小鼠肝内注射人类造血干细胞来建立人源化小鼠（hu-NSG）的方法。hu-NSG小鼠可感染HIV，并对联合抗逆转录病毒治疗（cART）具有响应，是研究HIV复制与潜伏的理想病理生理模型。
这些研究有助于回答艾滋病（HIV/AIDS）领域的一些关键科学问题，例如HIV感染的分子机制、感染预后，以及潜伏病毒库的形成机制与解剖定位。该技术的优势在于其无创性，并建立了人源化NSG小鼠模型，该模型可通过移植易感HIV感染且对联合抗逆转录病毒治疗（cART）有反应的人类多谱系干细胞，实现多谱系细胞的发育。首先，将消化后的人类胎儿肝脏组织悬液通过无菌的70微米尼龙滤网过滤，以获得单细胞悬液，然后根据制造商说明书，利用磁性激活细胞分选法富集CD34+造血干细胞（HSCs）。
计数后，将造血干细胞（HSC）重悬于冰上预冷的新鲜DPBS中，调整浓度至每毫升含两乘以十的七次方个活细胞。随后，将整窝新生的人源化NOD/SCID/γ或NSG小鼠放入无菌的扇形辐照笼中，使用铯-137辐射源对动物进行200至250厘戈瑞的γ射线照射处理。接着，将细胞加载至定制的Hamilton 80508型50微升注射器（配备30号针头）中，每只新生小鼠经肝脏直接注射五乘以十的五次方个活的人源CD34+ HSCs及25微升DPBS。
感染后10至12周，通过离心收集每只小鼠的眶后外周血样本，将血浆上清转移至微量离心管中，根据实验需要在-80摄氏度条件下进行冷冻保存。为验证造血干细胞植入情况，用200微升红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，并将细胞悬液转移至1.5毫升微量离心管中，在室温下孵育10分钟。随后通过离心收集剩余的白细胞，并用0.5毫升新鲜含0.01%牛血清白蛋白（BSA）的DPBS溶液洗涤两次，每次洗涤后均进行离心。
第二次洗涤后，在4摄氏度下用100微升封闭液封闭细胞20分钟，随后加入适量的抗体混合液进行标记，抗体用量为每1×10⁶个细胞加入2微升抗体。在4摄氏度孵育30分钟后，用含BSA的新鲜DPBS洗涤细胞两次，然后根据标准操作流程通过流式细胞术分析外周血样本，以定量每份样本中人CD45+CD3+CD14+或CD19+细胞的百分比。接着计算CD4+与CD8+ T细胞的比值，并依据标准的定量逆转录PCR（RT-PCR）流程检测血浆样本中的病毒载量。
为评估 HIV 感染的影响，通过腹腔注射方式，将 HIV 假病毒以每只小鼠 200 纳克 P24 的浓度，递送至已麻醉、携带人源组织且外周血中人源 CD45+ 细胞比例超过 20% 的人源化 NSG 小鼠体内，每两周通过眼眶后静脉丛采血一次，并按所示方法分析 CD4 与 CD8 的比值及血浆病毒载量。为验证病毒抑制效果，将感染后的人源化 NSG 动物每周通过加糖饮水给予新鲜的联合抗逆转录病毒治疗药物（cART），持续 4 周，每两周通过眼眶后静脉丛采血一次，并按所示方法分析 CD4 与 CD8 的比值及血浆病毒载量。当血浆病毒载量低于检测限且 CD4 与 CD8 的比值恢复至 1.5 至 2.5 之间时，为评估停药后的病毒反弹情况，可在停止 cART 治疗后每两周通过眼眶后静脉丛采集外周血样本，并按所示方法对样本进行分析。
在初始移植验证期间，人源 CD45+ 细胞比例应介于 20% 至 80% 之间，且人源白细胞亚群在流式细胞术分析中应呈现为明确的细胞群体。健康个体中 CD4+ 与 CD8+ 细胞的比值维持在 1.5 至 2.5 之间，而在病毒感染后通常会出现显著的 CD4+ T 细胞耗竭。值得注意的是，经 cART 治疗后，该健康比值可得到恢复。
通过定量RT-PCR检测感染过程及cART治疗方案期间的血浆病毒载量，可绘制曲线并分别用于评估病毒递送效率和抗病毒治疗效果。尽管该方法可为HIV/AIDS病毒学研究和治疗开发提供见解，也可应用于其他人类疾病相关研究，如癌症、糖尿病和自身免疫性疾病。人源化NSG小鼠模型的建立为免疫学和肿瘤学领域的研究人员探索人类新的功能障碍和病理机制铺平了道路，尤其适用于针对HIV慢性感染及潜伏病毒库的机制性研究和治疗研究。
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概述
本方案提供了一种通过向经辐射处理的新生NSG小鼠肝内注射人源造血干细胞来建立人源化小鼠（hu-NSG）的方法。hu-NSG小鼠可感染HIV，并对联合抗逆转录病毒治疗（cART）产生响应，是研究HIV复制与潜伏的理想模型。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 艾滋病研究
- 干细胞生物学
背景
- 人源化小鼠对于研究人类疾病具有重要价值。
- HIV潜伏与复制机制对于开发治疗策略至关重要。
- 人源化NSG模型可实现由人类干细胞分化的多谱系发育。
- 该技术具有非侵入性，可增强研究能力。
研究目的
- 建立可靠的HIV研究模型。
- 研究HIV感染的分子机制。
- 探索HIV潜伏储存库的形成机制。
使用的方法
- 过滤人胎肝组织以获得单细胞悬液。
- 通过磁性激活细胞分选法富集CD34+造血干细胞。
- 照射新生NSG小鼠以使其适应干细胞注射。
- 将人CD34+造血干细胞注射至新生小鼠的肝脏中。
主要结果
- 成功建立对 HIV 易感的 hu-NSG 小鼠模型。
- 证明了该模型用于cART研究的可行性。
- 为HIV潜伏感染的形成机制提供了见解。
- 验证了注射技术的非侵入性特点。
结论
- 人源化NSG小鼠模型对HIV研究具有显著效果。
- 该方法有助于深入理解HIV潜伏与感染机制。
- 未来的研究可利用此模型推动治疗策略的开发。
常见问题
行业重要性概述
人源化NSG小鼠模型能够在生理学上具有相关性的系统中，对HIV潜伏机制及治疗反应进行深入研究，支持靶点验证和临床前风险评估。该模型为评估抗病毒疗效和病毒储存库动态提供了可重复的实验平台，有助于推进抗病毒研发管线中的决策。此模型在HIV治愈研究中架起了基础生物学发现与转化研究连续性之间的桥梁。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：研究cART停药后HIV病毒库的建立及病毒反弹的机制。
- 操作价值：通过标准化的眶后采样实现对CD4/CD8比值和血浆病毒载量的纵向监测。
- 科学价值：支持对潜伏期逆转剂及联合抗逆转录病毒治疗方案的功能性验证。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成可量化的多谱系人类免疫系统嵌合，用于一致的基线特征分析。
- 操作价值：在不同队列中提供可重复的HIV易感性及cART应答检测结果。
- 科学价值：促进抗病毒化合物筛选和机制分析的即用型检测系统的建立。
转化与临床前研究
- 科学价值：重现了HIV感染及抗逆转录病毒治疗介导抑制的关键生物学特征。
- 操作价值：为靶向病毒储存库策略的临床前评估提供了与疾病相关的实验体系。
- 战略价值：基于病毒载量抑制和免疫重建指标，支持进行风险调整后的研发推进决策。
流程与工作流整合
人源化NSG模型通过HIV靶点的机制性去风险化，支持发现生物学研究，并推进至治疗候选物评价的临床前工作。
- 发现生物学：阐明潜伏储库形成及病毒持续存在的通路机制。
- 筛选：提供标准化、可量化的抗病毒疗效与耐药性分析结果。
- 分析：通过定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）和流式细胞术实现病毒载量及免疫重建的纵向追踪。
- 转化研究：将早期机制研究与潜伏储库削减策略的临床前验证相衔接。
- 企业级复用：作为可重复使用的平台，支持在发现与临床前阶段对HIV治疗药物进行迭代测试。
运营与企业影响
- 科学价值：通过重现 HIV 潜伏和病毒反弹表型，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：标准化的移植验证和病毒载量定量确保了不同实验场所间结果的可重复性。
- 战略价值：通过降低抗病毒候选药物的作用机制不确定性，为资本高效的投资决策（推进或终止）提供依据。
- 项目组合影响：基于临床前疗效信号，支持对靶向病毒储存库疗法进行风险调整后的优先排序。
实施注意事项
- 需要具备造血干细胞分离、新生小鼠操作以及辐射安全规程方面的专业知识。
- 依赖于获取γ射线辐照源、流式细胞术和qRT-PCR基础设施，用于嵌合分析和病毒载量检测。
- 需要跨团队对眶后采血、细胞处理以及抗逆转录病毒治疗（ART）给药时间表进行标准化。
- 该模型的适用性仅限于支持人源造血嵌合的免疫缺陷背景。
- 由于嵌合率存在变异性，需根据人源CD45+细胞嵌合度阈值（20–80%）对实验队列进行分层。
