单个金属纳米颗粒的高分辨率物理表征

这种基于纳米孔的检测方法已展现出对单个分子进行物理表征和识别的潜力。本视频旨在研究金属纳米颗粒，这一工作正在挑战我们对测量准确性和精确性限制因素的理解。该技术的主要优势在于，该装置相较于传统的脂质双层膜记录系统具有更高的带宽，使我们能够更快地观察到纳米孔中的结果和更多的反应过程。

该技术得以实现的原因是，在20世纪90年代初的研究表明，可以控制蛋白质纳米孔的门控行为，即在不同状态之间切换，并且分子能够与纳米孔的孔壁结合。该技术目前正在被开发用于商业化的DNA测序应用，因为它所需的样本量极小，无需使用荧光标记，且读长远远超过传统方法。

该技术还可用于更准确、快速地区分不同大小的聚合物，其性能优于凝胶电泳和色谱法。首先，配制500毫升电解质溶液，其中含1摩尔氯化钠和10毫摩尔磷酸二氢钠，溶剂为超纯水。在此特定实验装置中，最好使用新鲜配制的溶液和样品。

此外，我们发现高质量的去离子水对于成功形成膜至关重要。接下来，将一毫克冻干的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）野生型单体α溶血素粉末与一毫升超纯水混合。请注意，操作金黄色葡萄球菌α溶血素毒素蛋白可能存在危险。

进行此操作时，请遵循材料安全数据表（MSDS）中的预防措施。接下来，在玻璃闪烁瓶中配制 4 毫升浓度为 5 毫克/毫升的 DPhyPC 正十一烷溶液。用带聚四氟乙烯衬里的瓶盖密封该瓶，并在 4°C 下保存，最长可保存一个月。

随后，将57.6毫克十二钨磷酸水合物溶解于10毫升电解质中，配制成2毫摩尔的多金属氧酸盐（POM）溶液。将POM溶液均分为两份，每份5毫升。用3摩尔的氢氧化钠将其中一份POM溶液的pH值调节至5.5。

开始准备实验时，组装平面脂双层膜电生理装置的测试池。首先，用600目砂纸打磨银丝，并将其浸入市售的次氯酸钠漂白剂中10分钟，以制备银-氯化银丝电极。将电极用去离子水冲洗并干燥后，插入装置的石英毛细管中。

将电极保持在石英纳米孔膜（QNM）内部，该膜用于分隔毛细管与储液池。然后将安装在银丝上的圆柱形银-氯化银小球电极置于储液池中。将两个电极连接至放大器电路板。

接下来，打开数据采集程序，并将电源从零毫伏开始启动。确认在空池的电极之间未检测到直流电流。在本实验演示中，需注意跨毛细血管压力对膜形成及后续纳米孔形成的影响。

若未正确执行这两个步骤，实验将无法成功。用注射器吸取约一毫升电解液，并将其连接到与储液池相连的流体管线上。向储液池中添加电解液，直至QNM的端面完全浸没，此时电极之间的离子电流会使放大器达到饱和，即为浸没完成的标志。

如果放大器未达到饱和，可通过施加正负1伏的脉冲电压，或增加约300毫米汞柱的毛细管压力来疏通QNM。必要时可同时使用这两种方法。一旦放大器达到饱和，从储液池中抽出电解液，直至液面降至QNM以下，此时电流将回到零值，表明已到位。

为开始脂双层形成过程，将电解质溶液液面升至远高于QNM表面，并记录所用溶液的大致体积。然后将10微升移液枪头浸入DPHyPC溶液中，吸取枪头内可见的全部脂质。将枪头轻轻接触电解质溶液表面，使脂质从枪头流出并跨越气-水界面扩散。

等待两到五分钟，使脂质在溶液表面均匀铺展。接着，缓慢抽出电解质溶液，使液面降至石英纳米微管（QNM）以下，然后缓慢加入足够的电解质溶液，使液面上升至高于石英纳米微管的位置，从而形成绝缘的脂双层膜。若经过三次尝试后仍未形成脂双层膜，可按照前述方法再次添加适量脂质，并重复该过程。

一旦观察到双层膜似乎已形成，增加毛细管压力以击破双层膜，然后通过与之前相同的方式缓慢降低并升高溶液液面，使双层膜重新形成。重复此过程数次，以确保石英纳米机械探针（QNM）未被堵塞且双层膜已成功形成。接下来，将一份α-溶血素蛋白在冰上或室温下解冻。

在储液池中加入250纳克单体α溶血素蛋白和约250微升超纯水。然后施加200至400毫伏的偏压以诱导孔道形成。为促进孔道形成，通过增加40至200毫米汞柱的毛细管压力，使双层膜从QNM处扩展。

一旦形成纳米孔，将施加的偏压降低至测量电压，并将压力降低至插入压力的一半左右。开始测试前，重新调节直流偏移电压，以确保当施加电位设为零时无测量电流。接着，相对于储液池，获取施加电位从120毫伏至负120毫伏范围内的离子电流轨迹。

确认无污染物存在，污染物会引发自发性电流阻断。向储液池中加入一至六微升 pH 5.5 的 2 毫摩尔 POM 簇溶液。在施加 -120 毫伏电压下进行离子电流时间序列测量。

单个阴离子型磷钨酸分子通过α-溶血素通道时，会产生瞬时阻断，使平均开放孔道离子电流降低约80%。阻断持续时间与电流阻断程度均与粒子-孔道相互作用直接相关，因此可在相对阻断深度比值的直方图中区分不同离子种类。在pH 5.5条件下，观察到两个峰，其深度比值分别约为0.06和0.16。根据磷核磁共振（NMR）分析，较小的峰对应六负电荷的磷钨酸物种，而主峰对应七负电荷物种。

在 pH 7.5 时，六负离子与七负离子的相对浓度转变为更高的比例。与 pH 5.5 相比，阻断事件减少了 20 倍，这归因于降解为游离的磷酸根和钨酸根离子。对停留时间分布的拟合需要多个指数函数，表明每种离子物种内部存在多种类型的粒子-孔道相互作用。

pH 7.5 下较短的驻留时间表明颗粒与孔之间的相互作用弱于 pH 5.5，这与先前研究结果一致，即在α溶血素通道管腔内部或附近固定电荷的相对数量会随 pH 变化而改变。高纯度去离子水对这一特定实验装置至关重要。实验室曾连续数月无法在 QNMs 上形成膜，其原因很可能是有机物滤芯耗尽所致。

初次接触该方法特定版本的研究人员可能会遇到困难，因为膜非常小，且形成纳米孔存在一定的技巧。该方法始于数十年前，已被证明在分析离子、核酸、合成聚合物以及DNA测序方面具有实用价值。此外，该方法还可能在生物物理学和基础细胞生物学领域找到应用。

例如，该方法可用于研究合成聚合物和生物聚合物的物理特性，以探究其尺寸、与其他分子的相互作用以及其他重要问题。