Name: 单金属纳米粒子的高分辨率物理特性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-28T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 了解基于纳米孔的单分子检测技术，用于识别多金属氧酸盐等金属纳米粒子。该方法比传统脂质双层装置具有更高带宽，可实现更快检测与更高精度，适用于DNA测序及分析化学研究。

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我们感谢欧洲分子生物学组织（EMBO）提供的博士后奖学金（资助对象：J.E.）以及美国国立卫生研究院国家人类基因组研究所（NIH NHGRI）的资助（资助对象：J.J.K.）。我们感谢哥伦比亚大学的Jingyue Ju教授和Sergey Kalachikov教授提供七聚体αHL，同时也感谢弗吉尼亚联邦大学的Joseph Reiner教授富有启发性的讨论。

注意： 以下方案专用于Electronic BioSciences（EBS）Nanopatch DC系统。然而，该方案可轻松适配于其他用于测量平面脂质双层膜电流的电生理设备（标准脂质双层膜室、U型管构型、拉制微毛细管， 等等。）。商业材料及其来源的标识仅用于描述实验结果。此标识绝不意味着美国国家标准与技术研究院的推荐，也不意味着这些材料是可获得的最佳选择。
1. 溶液与分析物的制备
<ol>
	<li>使用 I 型水纯化系统制备的 18 MΩ-cm 水配制所有电解质溶液，以去除痕量有机物，然后在离子通道记录前立即通过 0.22 μm 真空滤膜过滤所有电解质溶液。 
	注意： 水质是影响膜纳米孔系统稳定性和使用寿命的关键因素。</li>
	<li>野生型 αHL。
	<ol>
		<li>操作 αHL 毒素蛋白时，请遵循材料安全数据表（MSDS）中的安全预防措施。</li>
		<li>将冻干的野生型单体 S. aureus α-溶血素（αHL）粉末用 18 MΩ-cm 水溶解至浓度为 1 mg/mL。将样品分装为每份 10 至 30 μL，置于耐低温离心管中，迅速在液氮中速冻，随后于 -80 °C 保存。或者，可使用已纯化的预制七聚体 αHL31。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 mL 玻璃闪烁瓶（带聚四氟乙烯涂层瓶盖）中，将脂质 1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（DPhyPC）溶于 n-十二烷中，配制成 0.2 mg/mL 溶液。该溶液可于 4 °C 保存，一个月内可重复使用。</li>
	<li>配制磷钨酸溶液。
	<ol>
		<li>操作&#160;磷钨酸&#160;粉末时，请遵循材料安全数据表（MSDS）中的安全预防措施。将 57.6 mg H3PW12O40 溶解于 10 mL 的 1 M NaCl 和 10 mM NaH2PO4 溶液中，配制成 2 mM 磷钨酸储备液。</li>
		<li>取 5 mL 该溶液，用 3 M NaOH 调节 pH 至 5.5；另取 5 mL 储备液，用 3 M NaOH 调节 pH 至 7.5。 
		注意： 在 pH 5.5 条件下，十二磷钨酸（PTA, H3PW12O40）主要分解为单空位阴离子 [PW11O39]7-。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 测试电池组装
<ol>
	<li>按照制造商的说明组装测试池。</li>
	<li>用600目砂纸打磨一根银/氯化银（Ag/AgCl）导线后，将其浸入漂白剂（次氯酸钠）中10分钟。将电极置于石英纳米孔膜（QNM）内部。</li>
	<li>将嵌入银丝中的圆柱形 AgCl 压片电极置于 QNM 外部。</li>
	<li>测试细胞安装完毕后，打开电源和数据采集程序。确保在测试细胞中无溶液时，直流电流读数为 0 pA。</li>
	<li>使用连接至测试池的注射器 通过 连接流体管路，向QNM表面添加缓冲电解质溶液，并确保离子电流使放大器达到饱和。若未达到饱和，QNM可能堵塞。施加脉冲电压（±1 V）和/或高于300 mm Hg的压力以清除堵塞。若处理有效，随后降低电压和压力。</li>
</ol>
3. 脂质双层的形成
<ol>
	<li>将溶液注入测试池，使液面明显高于QNM表面，然后降低液面高度 通过 将注射器移至液面以下，使电流降至零。</li>
	<li>将10 μL移液器吸头浸入脂质小瓶中。推动吸头后端，并轻敲小瓶侧壁，以去除所有可见的脂质。</li>
	<li>当溶液液面高于QNM表面时，将移液器吸头接触测试池中溶液的气-液界面，等待两到五分钟，使脂质均匀铺展。</li>
	<li>缓慢降低溶液液面至QNM表面以下，直至电流达到饱和，然后缓慢升高溶液液面，使其超过QNM表面，从而形成脂双层膜。
	<ol>
		<li>一旦观察到双层膜形成（即， 当电流降至零时，通过增加压力反复尝试弹出数次，并确保QNM未被堵塞。若需重新形成脂双层膜，先将溶液液面降至QNM表面以下，再缓慢升高液面。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如果脂双层膜首次未能形成，将溶液降至孔的下方，然后再次升高。若经过3次尝试后仍未形成，则添加更多脂质&#160;脂质&#160;如3.2和3.3节所述。</li>
	<li>形成膜后，当施加的电位为零时，将电流偏移量调零。</li>
</ol>
4. αHL 孔形成
<ol>
	<li>向测试池（体积 ≈ 200 μL）中加入 2.5 ng 纯化的预形成&#160;αHL 七聚体蛋白样品（或 250 ng 单体 αHL），以实现通道形成。</li>
	<li>在形成双层膜后，使用气密注射器（图 1）增加双层膜的压力，使膜从 QNM 处扩展，促进纳米孔插入。根据不同的 QNM，通常将施加的背压提高至 40 至 200 mmHg。 
	注意： EBS 软件具有自动插入功能，可施加较高的偏压（通常为 200 至 400 mV）以诱导孔道形成，一旦单个通道形成，便会自动将电压降低至设定的测量偏压。</li>
	<li>纳米孔形成后，将背压降低至插入压力的大约 1⁄2。若观察到多个通道，可通过显著降低压力将其去除。</li>
</ol>
5. 纳米孔中的金属簇分离
<ol>
	<li>为消除电极不平衡的影响，应调节直流偏置电压，使得当施加的电位设为零时，测得的电流为零。</li>
	<li>在加入POM样品之前，先进行对照实验，以确保无任何污染物（例如在储液池中（排除前次实验残留的POMs）。具体而言，在无任何POMs的条件下，施加+120 mV至-120 mV的电势，获取离子电流轨迹，以确认不存在自发性电流阻断。 
	注意： 由于αHL通道的不对称结构（图1），正负施加电位下的离子电流大小会有所不同。该施加电压以上的测得电流之比可反映离子通道的方向性 α膜中的HL纳米孔。</li>
	<li>以1至5 μM浓度的金属簇溶液冲洗储液池，加入POM样品。或者，在组装细胞前将样品加载至毛细管中，以研究POM在αHL通道另一端的分配情况。</li>
	<li>使用制造商的软件记录离子电流，以检测单个POM进入纳米孔时引起的瞬态电流阻断。根据离子电流阻断深度、事件频率以及阻断停留时间分布，估算分子的物理和化学性质。</li>
</ol>
6. 离子通道记录与数据分析
<ol>
	<li>使用高阻抗、低噪声放大器和数据采集系统获取离子电流时间序列测量值。针对每种 pH 条件，在施加 -120 mV 电压（相对于通道 cis 侧）下进行测量。</li>
	<li>对信号应用低通 100 kHz 八极贝塞尔滤波器，随后以 500 kHz 进行数字化（即，2 μs/点）。从时间序列中提取事件，并使用 MOSAIC 软件包中的 ADEPT 算法分析事件32,33。</li>
</ol>

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</ol>

由于具有阴离子电荷，POMs 可能通过静电相互作用与有机反离子结合。因此，确定合适的溶液条件和适当的电解质环境（尤其是溶液中的阳离子）以避免与 POMs 形成复合物显得尤为重要。在缓冲液的选择上需格外谨慎。例如，与磷酸盐缓冲溶液相比，三(羟甲基)氨基甲烷或柠檬酸缓冲溶液中 POMs 的捕获速率显著降低，这可能是因为前两种缓冲液之一会与 POM 形成复合物，从而无法与纳米孔发生强相互作用。此外，特意选用 NaCl 电解质而非 KCl（以及其他碱金属盐），以避免 K+ 引起 [PW11O39]7- 沉淀。
准确测量停留时间分布的关键在于能够以足够高的带宽测量电流。例如，当停留时间呈指数分布时，停留时间短的阻断事件远多于停留时间长的事件，因此通过采集大量数据可更准确地估算停留时间分布即， 以尽可能高的带宽进行采集，该带宽受限于系统电容）。为在纳米孔谱学中实现这一条件，应尽量降低系统电容（包括膜电容和杂散电容）。通过缩短所有连接电缆的长度并使用高质量的电气接触来减少杂散电容。通过减小双...

在单分子水平上检测生物分子分析物可通过使用纳米孔并测量离子电流调制来实现。通常，根据制备方式的不同，纳米孔可分为两类：生物纳米孔（由蛋白质或DNA折纸自组装而成）1,2,3，或固态（例如，使用半导体加工设备制造4,5尽管固态纳米孔被认为在物理上可能更坚固，并可在广泛的溶液条件下使用，但迄今为止，蛋白质纳米孔具有更高的灵敏度、更强的抗污染能力、更大的带宽、更好的化学选择性以及更高的信噪比。
多种蛋白质离子通道，例如由 金黄色葡萄球菌 α-溶血素（αHL）可用于检测单个分子，包括离子（例如，H+ 和 D+)2,3多核苷酸（DNA和RNA）6,7,8，受损的DNA9多肽10蛋白质（折叠和非折叠）11聚乙二醇及其他聚合物12,13,14，金纳米颗粒15,16,17,18,19以及其他合成分子20.
我们最近证明，αHL 纳米孔还能够轻松地在单分子水平上检测和表征金属簇——多金属氧酸盐（POMs）。多金属氧酸盐是一类离散的纳米级阴离子金属氧簇，最早于1826年被发现21，此后已合成出多种不同类型。目前可获得的多金属氧酸盐在尺寸、结构和元素组成上各不相同，因而展现出广泛的功能与应用，涵盖化学22，23、催化24、材料科学25，26以及生物医学研究27，28，29等领域。
POM 的合成是一种自组装过程，通常在水中通过混合化学计量所需的单体金属盐来完成。一旦形成，POM 会表现出多种多样的尺寸和结构。例如，Keggin 型多阴离子结构 XM12O40q- 由一个杂原子（X）与四个氧原子配位形成四面体（q 为电荷数）构成。该杂原子位于由 12 个八面体 MO6 单元（其中 M 为处于高氧化态的过渡金属）组成的笼状结构中心，这些八面体单元通过相邻的共用氧原子相互连接。虽然钨系多金属氧酸盐在酸性条件下结构稳定，但氢氧根离子会导致金属-氧（M-O）键发生水解断裂30。这一复杂过程会导致一个或多个 MO6 八面体亚单元的丢失，从而形成单缺位和三缺位物种，并最终导致 POM 完全分解。本文的讨论将仅限于 12-磷钨酸在 pH 5.5 和 7.5 条件下的部分分解产物。
本实验方案的目标是利用基于生物纳米孔的电子平台，在单分子水平上检测离散的金属氧簇。该方法能够实现溶液中金属簇的检测，对溶液中多种物质的分辨能力优于传统分析方法33。该技术可揭示多金属氧酸盐（POM）结构中的细微差异，且所需浓度显著低于核磁共振波谱法。尤为重要的是，该方法甚至能够区分Na8HPW9O341的异构体形式。

<table><tbody><tr><td>纳米片DC系统</td><td>Electronic Biosciences, Inc., EBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millipore LC-PAK</td><td>Millipore 真空滤器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL</td><td>850356P</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;癸烷，试剂级，&amp;ge;99%，&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D901</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;HL</td><td>List Biological Laboratories, Campbell, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>银丝</td><td>Alfa Aesar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mm Ag/AgCl 圆盘电极</td><td>In Vivo Metric</td><td>E202</td><td></td></tr><tr><td>高阻抗放大器系统</td><td>Electronic Biosciences, San Diego, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>石英毛细管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>定制聚碳酸酯测试池</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>数据处理与分析软件 MOSAIC</td><td>https://pages.nist.gov/mosaic/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水合磷钨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>455970</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>一水合磷酸二氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71507</td><td></td></tr></tbody></table>

单个金属纳米颗粒的高分辨率物理表征

High Resolution Physical Characterization of Single Metallic Nanoparticles

通过测量单个纳米级孔道中离子电流因分子通过而产生的减小程度，可以检测并表征单个分子。该信号反映了分子的理化性质及其与孔道的相互作用。我们证明，由细菌蛋白金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）α溶血素（αHL）形成的纳米孔可在单分子水平上检测多金属氧酸盐（POMs，阴离子型金属氧簇）。此外，该方法还能同时测量溶液中12-钨磷酸（PTA，H3PW12O40）多金属氧酸盐的多种降解产物。纳米孔方法的单分子灵敏度使得POMs的表征所需浓度显著低于核磁共振（NMR）波谱法。该技术可为化学家提供一种新工具，用于研究多金属氧酸盐或其他金属簇的分子特性，深入理解POM的合成过程，并可能提高其产率。理论上，该方法还可用于探究分子中特定原子的位置、分子片段的旋转以及金属的氧化态。此外，这一新技术的优势在于能够实时监测溶液中的分子动态。&#160;

在过去的二十年中，膜结合蛋白的纳米级孔道已被证明是多功能的单分子传感器。基于纳米孔的测量相对易于实施。两个充满电解质溶液的腔室由嵌入电绝缘脂质膜中的纳米孔分隔开来。通过膜片钳放大器或外部电源在纳米孔两侧施加静电势 通过 浸入电解质储液池中的 Ag/AgCl 电极。电场驱动带电粒子进入纳米孔，导致离子电流发生瞬时减小，该减小程度取决于粒子的尺寸、形状和电荷。计算机程序控制施加的电压，并实时监测因分子可逆地进入纳米孔所引起的离子电流阻断事件。电流信号通过低噪声、高阻抗的场效应晶体管放大并转换为电压信号，再通过数据采集卡进行数字化处理。
本文提供了一种利用生物纳米孔检测多金属氧酸盐（POMs）的通用方法。如图2所示，在未加入POMs时，施加-120 mV电压下未受阻塞的通道平均开放电流约为100 pA。加入POMs后，会产生瞬时阻塞，并使离子电流降低约80%。正如预期，由于这些粒子...

本文介绍了一种利用基于生物纳米孔的电子平台在单分子水平检测离散金属氧簇——多金属氧酸盐（POMs）的实验方案。该方法为研究这些分子的传统分析化学工具提供了一种互补手段。

单个分子可通过测量其对流经单个...的离子电流的减弱程度来进行检测和表征

这种基于纳米孔的检测方法已展现出对单个分子进行物理表征和识别的潜力。本视频旨在研究金属纳米颗粒，这一工作正在挑战我们对测量准确性和精确性限制因素的理解。该技术的主要优势在于，该装置相较于传统的脂质双层膜记录系统具有更高的带宽，使我们能够更快地观察到纳米孔中的结果和更多的反应过程。该技术得以实现的原因是，在20世纪90年代初的研究表明，可以控制蛋白质纳米孔的门控行为，即在不同状态之间切换，并且分子能够与纳米孔的孔壁结合。该技术目前正在被开发用于商业化的DNA测序应用，因为它所需的样本量极小，无需使用荧光标记，且读长远远超过传统方法。该技术还可用于更准确、快速地区分不同大小的聚合物，其性能优于凝胶电泳和色谱法。首先，配制500毫升电解质溶液，其中含1摩尔氯化钠和10毫摩尔磷酸二氢钠，溶剂为超纯水。在此特定实验装置中，最好使用新鲜配制的溶液和样品。此外，我们发现高质量的去离子水对于成功形成膜至关重要。接下来，将一毫克冻干的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）野生型单体α溶血素粉末与一毫升超纯水混合。请注意，操作金黄色葡萄球菌α溶血素毒素蛋白可能存在危险。进行此操作时，请遵循材料安全数据表（MSDS）中的预防措施。接下来，在玻璃闪烁瓶中配制 4 毫升浓度为 5 毫克/毫升的 DPhyPC 正十一烷溶液。用带聚四氟乙烯衬里的瓶盖密封该瓶，并在 4°C 下保存，最长可保存一个月。随后，将57.6毫克十二钨磷酸水合物溶解于10毫升电解质中，配制成2毫摩尔的多金属氧酸盐（POM）溶液。将POM溶液均分为两份，每份5毫升。用3摩尔的氢氧化钠将其中一份POM溶液的pH值调节至5.5。开始准备实验时，组装平面脂双层膜电生理装置的测试池。首先，用600目砂纸打磨银丝，并将其浸入市售的次氯酸钠漂白剂中10分钟，以制备银-氯化银丝电极。将电极用去离子水冲洗并干燥后，插入装置的石英毛细管中。将电极保持在石英纳米孔膜（QNM）内部，该膜用于分隔毛细管与储液池。然后将安装在银丝上的圆柱形银-氯化银小球电极置于储液池中。将两个电极连接至放大器电路板。接下来，打开数据采集程序，并将电源从零毫伏开始启动。确认在空池的电极之间未检测到直流电流。在本实验演示中，需注意跨毛细血管压力对膜形成及后续纳米孔形成的影响。若未正确执行这两个步骤，实验将无法成功。用注射器吸取约一毫升电解液，并将其连接到与储液池相连的流体管线上。向储液池中添加电解液，直至QNM的端面完全浸没，此时电极之间的离子电流会使放大器达到饱和，即为浸没完成的标志。如果放大器未达到饱和，可通过施加正负1伏的脉冲电压，或增加约300毫米汞柱的毛细管压力来疏通QNM。必要时可同时使用这两种方法。一旦放大器达到饱和，从储液池中抽出电解液，直至液面降至QNM以下，此时电流将回到零值，表明已到位。为开始脂双层形成过程，将电解质溶液液面升至远高于QNM表面，并记录所用溶液的大致体积。然后将10微升移液枪头浸入DPHyPC溶液中，吸取枪头内可见的全部脂质。将枪头轻轻接触电解质溶液表面，使脂质从枪头流出并跨越气-水界面扩散。等待两到五分钟，使脂质在溶液表面均匀铺展。接着，缓慢抽出电解质溶液，使液面降至石英纳米微管（QNM）以下，然后缓慢加入足够的电解质溶液，使液面上升至高于石英纳米微管的位置，从而形成绝缘的脂双层膜。若经过三次尝试后仍未形成脂双层膜，可按照前述方法再次添加适量脂质，并重复该过程。一旦观察到双层膜似乎已形成，增加毛细管压力以击破双层膜，然后通过与之前相同的方式缓慢降低并升高溶液液面，使双层膜重新形成。重复此过程数次，以确保石英纳米机械探针（QNM）未被堵塞且双层膜已成功形成。接下来，将一份α-溶血素蛋白在冰上或室温下解冻。在储液池中加入250纳克单体α溶血素蛋白和约250微升超纯水。然后施加200至400毫伏的偏压以诱导孔道形成。为促进孔道形成，通过增加40至200毫米汞柱的毛细管压力，使双层膜从QNM处扩展。一旦形成纳米孔，将施加的偏压降低至测量电压，并将压力降低至插入压力的一半左右。开始测试前，重新调节直流偏移电压，以确保当施加电位设为零时无测量电流。接着，相对于储液池，获取施加电位从120毫伏至负120毫伏范围内的离子电流轨迹。确认无污染物存在，污染物会引发自发性电流阻断。向储液池中加入一至六微升 pH 5.5 的 2 毫摩尔 POM 簇溶液。在施加 -120 毫伏电压下进行离子电流时间序列测量。单个阴离子型磷钨酸分子通过α-溶血素通道时，会产生瞬时阻断，使平均开放孔道离子电流降低约80%。阻断持续时间与电流阻断程度均与粒子-孔道相互作用直接相关，因此可在相对阻断深度比值的直方图中区分不同离子种类。在pH 5.5条件下，观察到两个峰，其深度比值分别约为0.06和0.16。根据磷核磁共振（NMR）分析，较小的峰对应六负电荷的磷钨酸物种，而主峰对应七负电荷物种。在 pH 7.5 时，六负离子与七负离子的相对浓度转变为更高的比例。与 pH 5.5 相比，阻断事件减少了 20 倍，这归因于降解为游离的磷酸根和钨酸根离子。对停留时间分布的拟合需要多个指数函数，表明每种离子物种内部存在多种类型的粒子-孔道相互作用。pH 7.5 下较短的驻留时间表明颗粒与孔之间的相互作用弱于 pH 5.5，这与先前研究结果一致，即在α溶血素通道管腔内部或附近固定电荷的相对数量会随 pH 变化而改变。高纯度去离子水对这一特定实验装置至关重要。实验室曾连续数月无法在 QNMs 上形成膜，其原因很可能是有机物滤芯耗尽所致。初次接触该方法特定版本的研究人员可能会遇到困难，因为膜非常小，且形成纳米孔存在一定的技巧。该方法始于数十年前，已被证明在分析离子、核酸、合成聚合物以及DNA测序方面具有实用价值。此外，该方法还可能在生物物理学和基础细胞生物学领域找到应用。 例如，该方法可用于研究合成聚合物和生物聚合物的物理特性，以探究其尺寸、与其他分子的相互作用以及其他重要问题。

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单金属纳米粒子的高分辨率物理特性

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