一种高通量荧光素酶检测法用于评估单次作用蛋白酶PCSK9的蛋白水解活性

该方法有助于回答PCSK9生物化学领域中的关键问题，例如哪些药物或基因改变会影响PCSK9的蛋白水解功能。该技术的主要优势在于，它能够对一种本底发生频率较低的生化事件实现快速且可扩增的检测。该技术的应用意义延伸至动脉粥样硬化性心脏病领域，因为PCSK9的蛋白水解功能是其最终影响血清胆固醇水平所必需的。

尽管该方法可为PCSK9本身提供深入见解，也可应用于其他生物化学系统，例如其他具有固有低蛋白水解活性的蛋白酶。首先，吸除每孔HEK293T细胞中的培养基。用PBS洗涤，并加入最小体积的0.5%胰蛋白酶-EDTA进行处理。

在37摄氏度孵育2至5分钟，以使细胞从原培养瓶中解离。加入两倍体积含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基以灭活胰蛋白酶-EDTA。然后用移液器将培养瓶中的液体反复吹打数次，使贴壁细胞脱落，并将细胞转移至无菌离心管中。

接下来，取出少量细胞样品。加入等体积的台盼蓝染色，并将染色后的细胞转移至载玻片，使用自动细胞计数仪进行细胞计数。在500 × g条件下离心5分钟，以收集细胞。

此后，吸去培养基，并将细胞和培养基重悬至所需浓度。使用多通道移液器和无菌槽，将每孔中的100 µm细胞转移至白色96孔板中。接着，在37°C、5% CO₂条件下将细胞培养24小时。

然后，将质粒制备成转染所需的浓度，每种质粒设置四个孔，包括阳性对照质粒、阴性对照质粒以及不含质粒的缓冲液。首先，配制稀释的脂质转染试剂主混合液和DNA预复合试剂主混合液。接着，使用多通道移液器和无菌储液槽，将16.8 µL稀释后的DNA预复合试剂分装至深孔板的每个孔中。

此后，使用多通道移液器将主板中每个质粒的 3.2 µL 转移至深孔板的每个孔中。然后，使用移液器向每孔加入 20 µL 稀释的脂质转染试剂混合物，并充分混匀。盖上板子，在室温下静置 10 至 15 分钟，以形成脂质-DNA 复合物。

此后，使用多通道移液器轻轻吸除96孔板中293T细胞的培养基。然后，用95微升添加了10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基替换原有培养基。接着，使用多通道移液器向各相应孔中加入10微升转染混合物。

接着，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时。首先，配制用于制备双倍浓度腔肠素检测试剂的储备溶液，包括磷酸盐缓冲液中的3摩尔抗坏血酸钠、蒸馏水中的5摩尔氯化钠、磷酸盐缓冲液中浓度为10毫克/毫升的牛血清白蛋白（BSA），以及酸化甲醇中浓度为2毫摩尔的腔肠素。接下来，准备足量的腔肠素试剂用于荧光素酶信号检测。

使用不同的试剂分别处理培养基中的细胞。然后，将除腔肠素以外的所有试剂混合。用0.22微米的注射器滤器过滤该混合物。

过滤后，加入腔肠素。转染24小时后，从培养箱中取出细胞。然后，使用多通道移液器将每个孔中的50 µL培养基转移至新的白色96孔板中。

使用多通道移液器向仅含有条件培养基的孔板中加入50微升双倍浓度的非裂解腔肠素试剂。然后，在室温下于暗处轻轻振荡孵育5至10分钟。接着，向含有细胞的孔板中加入双倍浓度的裂解腔肠素试剂，重复此步骤。

孵育结束后，在酶标仪中测定仅含培养基的孔板和含细胞的孔板的发光值。最后，弃置孔板并将数据文件保存以供后续分析。将荧光素酶检测试剂与仅含培养基的孔板及含细胞的孔板孵育相同的时间非常重要，因为这些孔板的数据将被直接比较。

在本实验方案中，通过荧光素酶检测法评估了PCSK9蛋白酶在底物位点P6至P6'的切割序列特异性。蛋白酶对P6以及P4至P1'位点的切割序列改变耐受性较差；但P5以及P2'至P6'位点对序列改变具有较高的耐受性。

此外，结果表明，最优切割序列与野生型序列基本相同。通过将临床中发现的错义突变文库与野生型蛋白酶进行比较，评估了其相对切割活性。在所评估的84个突变中，超过一半表现出相较于野生型蛋白酶的显著活性变化，提示蛋白酶活性的改变在临床人群中较为常见。

采用此方案后，可进一步通过流式细胞术或肝细胞胆固醇摄取实验等方法，评估PCSK9蛋白水解活性改变对LDL受体功能的影响。