Name: 一种检测慢性淋巴细胞白血病新 nfat2 靶基因的染色质免疫沉淀法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学习染色质免疫沉淀法检测慢性淋巴细胞白血病中NFAT2的新靶基因。该技术可揭示致癌机制，为开发潜在治疗策略提供关键信息，助力肿瘤学研究。

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本工作由德国研究基金会（DFG）资助项目 MU 3340/1-1 和德国癌症援助基金会（Deutsche Krebshilfe）资助项目 111134（两项资助均授予 M.R.M.）。我们感谢 Elke Malenke 提供出色的技术支持。

所有涉及&#160;人体材料的实验均经蒂宾根大学伦理委员会批准，并已获得参与本研究样本提供的所有患者的书面知情同意。
1. Jurkat 细胞的分离与刺激
注意：为了优化该实验方案，建议使用已知高表达 NFAT2 的 Jurkat 细胞系。所有步骤均需在层流罩内进行。
<ol>
	<li>将RPMI 1640培养基加入10%胎牛血清（FCS）和1%青霉素/链霉素，置于37 °C水浴中预热，配制50 mL。</li>
	<li>在细胞培养瓶中，用20 mL含10% FCS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基，在37 °C、5% CO2条件下培养Jurkat细胞1–2天，使细胞密度达到约2 × 106 个/mL（通过台盼蓝染色和血球计数板在显微镜下计数），然后以200 × g离心5分钟收集细胞。</li>
	<li>用移液器吸除上清液，将细胞重悬于10 mL含10% FCS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中。随后，使用常规台盼蓝染色法和血球计数板在显微镜下对细胞进行计数。</li>
	<li>将步骤1.3中的细胞以200 × g离心5分钟，吸除上清液。然后将细胞重悬于含10% FCS和1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基中，调整细胞密度为2 × 107 个/mL，并用移液器将1 mL细胞悬液转移至新的常规5 mL离心管中。</li>
	<li>加入32.4 nM佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）和1 µM离子霉素刺激细胞。然后将管盖打开（为避免污染，可使用透气封口膜），在37 °C、5% CO2条件下孵育16小时。</li>
</ol>
2. 从人类患者中分离并刺激原代慢性淋巴细胞白血病细胞
注意：患者样本的获取和刺激处理如前所述7。所有步骤均在层流罩内进行。
<ol>
	<li>准备从患者抽血及进行密度梯度分离所需的设备：21-G针头、止血带、NH4肝素抗凝采血管（例如 S-monovettes）、1× PBS 和密度梯度介质（密度 1.077 g/mL）</li>
	<li>静脉穿刺后，将慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的血液（每位患者约40 mL）抽入注射器中，随后转移至50 mL离心管。用10 mL PBS冲洗注射器，并将冲洗液与血液-PBS悬液合并于50 mL离心管中（根据血液体积调整离心管数量）。</li>
	<li>在新的50 mL锥形管中制备15 mL密度梯度介质。随后，将35 mL血液-PBS悬液小心地叠加在密度梯度介质上。操作时，将锥形管保持在较低的倾斜角度，缓慢将血液-PBS悬液沿管底壁加入。随着血液-PBS悬液在50 mL锥形管中逐渐积累，逐步将管子调整至直立（90°）位置。根据血液-PBS悬液的总体积重复此步骤。</li>
	<li>以 560 x g 离心 g 孵育20分钟（不刹车），然后提取含有外周血单个核细胞（PBMCs）的单个核细胞层。操作时，用5 mL血清移液管收集密度梯度分离后的白色中间层，并转移至新的50 mL锥形离心管中。</li>
	<li>用 PBS 将细胞悬液补至 50 mL，360 x g 离心 5 分钟 g. 吸去上清液。以275 x g离心5分钟，重复此步骤 g然后，将一位患者的细胞收集到5-10 mL PBS中，置于50 mL锥形管内。</li>
	<li>按照1.3中的描述进行细胞计数。 
	注意：这取决于分离的外周血单个核细胞中慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的比例，若比例足够高，细胞可直接用于本实验；否则需进行B细胞分离。 例如， 通过磁性细胞分选（MACS）进行。建议进行B细胞分离，但如果慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞占总淋巴细胞比例超过95%（通过流式细胞术确定），则可省略此步骤。根据试剂盒说明书对CLL患者血液进行固定和裂解处理，随后按照说明书使用CD19-FITC和CD5-PE抗体对细胞进行染色，并通过流式细胞术分析细胞。图中显示一名典型患者的结果。 图1，其中CLL细胞的比例为89.03%。因此，该患者需进行B细胞分离。生理性B细胞的比例可忽略不计（本例中为3.72%）。</li>
	<li>用 10 mL 预热至 37 °C 的 RPMI 1640 培养基洗涤细胞，培养基中添加 10% FCS、1% 青霉素/链霉素、100 mM 非必需氨基酸、1 mM 丙酮酸钠和 50 mM β-巯基乙醇，在 200 × g 条件下离心 5 分钟 g 用移液管吸除上清液。</li>
	<li>将细胞浓度调整至 2 x 107 细胞/mL，加入含10% FCS、1%青霉素/链霉素、100 mM非必需氨基酸、1 mM丙酮酸钠和50 mM β-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中（37 °C），取1 mL细胞悬液加入5 mL离心管中。 
	注意：β-巯基乙醇用于拮抗氧化应激。</li>
	<li>加入 32.4 nM PMA 和 1 µM 离子霉素刺激细胞，随后在 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育细胞 16 小时。2 管盖打开（为避免污染，可使用透气的密封膜）。 
	注意：为降低细胞所受应激，可在37 °C、5% CO₂条件下静置培养1小时2 在刺激前16小时将样品置于培养箱中。</li>
</ol>
3. 固定、细胞裂解和染色质剪切
注意：患者样本和Jurkat细胞使用市售的ChIP试剂盒进行固定和裂解，具体操作按照制造商说明书进行，并参照先前所述方法进行修改7。固定操作在层流罩内进行。
<ol>
	<li>准备一个含有1 mL 37%甲醛的1.5 mL离心管、一个含有1 mL 1.25 M甘氨酸的1.5 mL离心管、一个含有4 mL 1× PBS的5 mL离心管，以及一个装有冰的盒子，用于细胞固定。</li>
	<li>在步骤1.5或2.9中完成细胞刺激并孵育相应时间后，将5 mL离心管在200 × g 条件下离心5分钟，并将细胞重悬于5 mL离心管中的500 µL PBS中。</li>
	<li>向细胞中加入340 µM甲醛（即13.5 µL 37%甲醛），通过轻柔吹打混匀，室温孵育2.5分钟（Jurkat细胞）或5分钟（患者样本）。 
	注意：原代细胞需要更长的固定时间以确保最佳剪切效果。</li>
	<li>加入125 mM甘氨酸（即57 µL 1.25 M甘氨酸）以终止固定反应，再孵育5分钟。随后立即将样本置于冰上，并在4 °C条件下以500 × g 离心5分钟。用移液器吸除上清液。</li>
	<li>用1 mL预冷的PBS在4 °C条件下以200 × g 洗涤细胞两次，每次离心后均用移液器吸除上清液。 
	注意：固定完成后，本实验方案可暂停。固定后的细胞应保存于-80 °C。为检测后续实验中拟使用的抗体表位是否因固定而被遮蔽，可额外取样进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot分析。这些步骤使用100 µg蛋白，按制造商说明书操作。所有αNFAT2抗体均以1:1000稀释，GAPDH抗体以1:10000稀释。Jurkat细胞固定样本使用合适与不合适抗体的示例图像见图2。</li>
	<li>用移液器反复吹打，将细胞沉淀重悬于5 mL市售裂解缓冲液1中。然后将样本置于冰上并在摇床上孵育10分钟，同时持续振荡。 
	注意：裂解前可将细胞在液氮中破碎10秒。此步骤适用于Jurkat细胞，但应避免用于原代患者样本。进行破碎时，将5 mL离心管放入盛有5–10 mL液氮的专用容器中，停留5秒。操作时需佩戴护目镜和适当的安全手套。</li>
	<li>随后在4 °C条件下以500 × g 离心5分钟，并小心用移液器吸除上清液。</li>
	<li>用移液器反复吹打，将细胞在5 mL市售裂解缓冲液2中充分匀浆，并在冰上振荡孵育10分钟。然后在4 °C条件下以500 × g 离心5分钟，并小心用移液器吸除上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于500 µL（Jurkat细胞）或140 µL（患者样本）剪切缓冲液1中，缓冲液中含1×蛋白酶抑制剂（分别为5 µL或1.4 µL），并在冰上孵育10分钟。</li>
	<li>进行染色质剪切时，将步骤3.9中的140 µL细胞悬液转移至超声破碎管中（避免产生气泡，若因样本体积不足可重复此步骤）。将管子放入聚焦式超声仪中，温度设为7 °C，以平均入射功率9.375 W超声处理10分钟（细胞系）或7.5分钟（患者样本），以获得200–500 bp的DNA片段。</li>
	<li>最后在小型离心机中于4 °C条件下以15700 × g 离心10分钟，将上清液收集至新的1.5 mL离心管中。</li>
	<li>为检测剪切片段大小是否合适，取20 µL剪切后的染色质样本在1.5% TBE琼脂糖凝胶中进行凝胶电泳分析。Jurkat细胞剪切染色质质量良好与较差的示例图像见图3。至此，本实验方案可暂时暂停。剪切后的染色质应保存于-80 °C。</li>
</ol>
4. 染色质免疫沉淀
注意：染色质免疫沉淀使用市售的 ChIP 试剂盒进行，按照生产商说明书进行操作，并稍作修改7。
<ol>
	<li>计算免疫沉淀反应的数量（Jurkat 细胞使用 70 µL 或患者样本使用 15 µL 剪切后的染色质，每份加入一种抗体），并在 1.5 mL 离心管中为每次沉淀准备 20 µL 蛋白 A 包被的磁珠。用每份 40 µL 的 1× ChIP 缓冲液 1 通过吹打重悬磁珠进行洗涤，将磁珠置于磁力架上静置 1 分钟，然后用移液器吸除上清液。总共重复此步骤四次。最后，将磁珠用原始体积的 1× ChIP 缓冲液 1 重悬。</li>
	<li>进行免疫沉淀时，使用 10 µg 的 αNFAT2 抗体（7A6）捕获 NFAT2 及其结合的靶序列；使用 2.5 µg 的兔 IgG 抗体（DA1E）作为 IgG 对照。按照 表 1 所示，在新的 1.5 mL 离心管中准备反应&#160;。 
	注意：本实验方案中必须使用亲和力高且在固定过程中表位未被遮蔽的单克隆抗体。多克隆抗体会引入额外的变异性，显著增加结果解读的难度。</li>
	<li>将步骤 4.2 的混合物在 4 °C 下于旋转仪上以 6 rpm 转速孵育过夜。</li>
	<li>次日，在小型离心机中以 7,000 × g 离心 5 秒，随后将离心管置于磁力架上静置 1 分钟，吸弃上清液。依次用洗涤缓冲液 1、2、3 和 4 各洗涤磁珠一次。</li>
	<li>具体操作为：将磁珠重悬于 350 µL 洗涤缓冲液中，在 4 °C 下于旋转仪上以 6 rpm 转速孵育 5 分钟。</li>
	<li>然后在小型离心机中以 7,000 × g 离心 5 秒，再将离心管置于磁力架上 1 分钟，吸弃上清液后加入下一种洗涤缓冲液。</li>
	<li>最后一次洗涤后，用移液器吸除上清液，将磁珠重悬于 100 µL 洗脱缓冲液 1 中，并在旋转仪上以 6 rpm 转速孵育 30 分钟。</li>
	<li>短暂离心（在小型离心机中以 7,000 × g 离心 5 秒），然后将离心管置于磁力架上静置 1 分钟。</li>
	<li>接着用移液器将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中，并加入 4 µL 洗脱缓冲液 2。</li>
	<li>制备输入对照时，将 1 µL 剪切后的染色质与 99 µL 洗脱缓冲液 1 和 4 µL 洗脱缓冲液 2 混合（在此设置中，每位患者有三个样品管：一个输入对照、一个 IgG 对照和一个 αNFAT2 样品）。</li>
	<li>将样品在 1.5 mL 管振荡器中于 65 °C、1300 rpm 条件下孵育 4 小时。加入 100 µL 100% 异丙醇，涡旋混匀后在小型离心机中以 7,000 × g 离心 5 秒。</li>
	<li>充分涡旋重悬现有的磁珠，向每个样品中加入 10 µL 磁珠，并在旋转仪上以 6 rpm 转速于室温孵育 1 小时。</li>
	<li>孵育结束后，在小型离心机中以 7,000 × g 离心 5 秒，将离心管置于磁力架上 1 分钟，吸弃上清液。</li>
	<li>将磁珠重悬于 100 µL 洗涤缓冲液 1 中，颠倒混匀，在旋转仪上以 6 rpm 转速于室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>在小型离心机中以 7,000 × g 离心 5 秒，置于磁力架上 1 分钟，用移液器吸除上清液。使用洗涤缓冲液 2 重复步骤 4.13–4.14。</li>
	<li>随后吸弃洗涤缓冲液，将磁珠重悬于 55 µL 洗脱缓冲液中，在旋转仪上以 6 rpm 转速于室温孵育 15 分钟以洗脱沉淀的 DNA。最后在小型离心机中以 7,000 × g 离心 5 秒，置于磁力架上 1 分钟，将上清液转移至新的 1.5 mL 离心管中。 
	注意：此处实验流程可暂时暂停。洗脱的 DNA 应储存于 -20 °C。</li>
</ol>
5. 检测CLL细胞中NFAT靶基因。
<ol>
	<li>按照表2所示，对每个样本进行两份平行的qRT-PCR反应。 
	注意：为检测目的基因，使用市售的qRT-PCR预混液，在实时荧光定量PCR仪上进行定量实时PCR（qRT-PCR）。</li>
	<li>反应使用白色96孔反应板，并在RT-PCR仪上进行。循环条件如下：95 °C 预变性30 s，[95 °C 变性5 s，60 °C 退火延伸30 s] 共40个循环。 
	注意：将输入样本（未稀释或用无核酸酶水按1:10、1:100和1:1000稀释）进行系列稀释，用于计算相对富集度。在Jurkat细胞中，以IL-2作为阳性对照32；在慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞中，CD40L（NFAT2在B细胞中的已知靶基因）作为阳性对照，LCK则作为NFAT2在CLL中一个新靶基因的示例33,34。CD40L、IL-2和LCK启动子区域的引物信息见于试剂与设备明细表中。</li>
</ol>
6. 标准化与数据分析
注意：使用 IgG 对照进行归一化，计算目的基因启动子区域（IL-2、CD40L 或&#160;LCK）的相对富集度。
<ol>
	<li>首先，确定输入系列稀释样本的Ct（阈值循环）值， IL-2, CD40L 和 LCK 通过qRT-PCR数据分析软件评估启动子区域。</li>
	<li>通过输入样品的连续稀释定义浓度的标准曲线，并利用该标准曲线计算相应浓度 IL-2，CD40L 以及 LCK 每个样本重复的启动子区域。</li>
	<li>接下来，计算重复样本的平均值。然后，将IgG免疫沉淀样本设为参照，将其相对富集度定义为1.0，并将其他样本（来自NFAT2免疫沉淀）与该参照进行比较。</li>
	<li>最后，通过将样品的浓度除以IgG对照的浓度，计算相对富集度。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

成功进行染色质免疫沉淀（ChIP）实验的关键步骤包括选择合适的抗体以及优化染色质剪切过程25。在本实验方案的开发过程中，αNFAT2抗体的选择尤为困难。尽管目前市面上有多种αNFAT2抗体，且其中大多数适用于Western印迹及其他应用，但只有克隆号为7A6的抗体能够成功用于ChIP实验7。即使是来自不同生产商、标称为相同的7A6抗体，在ChIP实验中的表现也存在显著差异。一个主要挑战在于，XChIP实验流程中所使用的交联固定过程可能破坏目标蛋白的抗原表位25。
染色质剪切步骤对于获得XChIP实验的合适结果也至关重要。在本NFAT2 ChIP方案中，通过琼脂糖凝胶电泳评估，200-500 bp的片段大小被证明是最佳的7。若剪切条件不当，导致起始DNA材料不足或DNA片段过小或过大，通常会在进行该检测时产生次优结果。使用冻存后复融的外周血单个核细胞（PBMCs）时，也观察到剪切效果不理想。因此...

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方国家成人中最常见的白血病，其特征是表达CD19、CD23和CD5的成熟B细胞显著积聚1。大多数患者病情进展缓慢，多年内无需&#160;特殊治疗。相比之下，部分患者病情迅速进展，需立即接受免疫化疗或其他靶向治疗2,3。活化T细胞核因子（NFAT）是一类转录因子家族，调控多种细胞类型的发育和活化过程4,5,6。我们近期研究发现，在病情缓慢进展的CLL患者中，CLL细胞存在NFAT2的过表达及其组成性激活7。在此类细胞中，NFAT2调控一种对B细胞受体刺激无反应的状态，称为无能（anergy）7。为证实NFAT2能够结合人CLL细胞中淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK）启动子并调控LCK的表达，本研究建立并应用了一种特异性的染色质免疫沉淀实验（ChIP）。
染色质免疫沉淀（ChIP）是研究转录因子在基因表达中作用的多种技术之一8。基因表达受到多种调控因子的精密调控，其中转录因子在这一过程中发挥着不可替代的作用9,10,11,12。已在众多物种中鉴定出在时空背景下调控基因表达的转录因子（例如，在发育和分化过程中）13,14,15,16,17,18。涉及转录因子的复杂调控机制出现错误，可能导致包括癌症在内的多种病理过程19,20。因此，鉴定转录因子及其靶基因可能为治疗提供新的途径21,22。为研究这一引人入胜的领域，目前已发展出多种方法，如ChIP、电泳迁移率变动分析（EMSA）、各种DNA下拉实验以及报告基因检测等8,11,12,23,24。
证明某种转录因子与基因组的特定区域存在相互作用 体内 ChIP 是一种理想的技术25为此，可使用紫外线照射或甲醛处理对活细胞中的DNA及其相关蛋白进行交联（交联ChIP，XChIP）。而在所谓的天然ChIP（NChIP）中，该步骤被省略，以获得更佳的DNA和蛋白质回收效果。26DNA-蛋白质复合物随后通过超声处理断裂为约200-500个碱基对（bp）的片段，并利用针对目标转录因子的特异性抗体从细胞碎片中进行免疫沉淀。接着纯化并利用PCR、分子克隆和测序技术对结合的DNA片段进行表征。替代技术则采用微阵列（ChIP-on-Chip）或下一代测序（ChIP-Seq）来分析免疫沉淀的DNA。
染色质免疫沉淀（ChIP）最早由 Gilmour 和 Lis 于 1984 年提出，当时他们利用紫外光将活体细菌中的 DNA 与结合蛋白共价交联27细胞裂解后，对细菌RNA聚合酶进行免疫沉淀，利用已知基因的特异性探针来绘制 体内 RNA聚合酶的分布与密度。该方法随后被相同的研究人员用于分析热休克蛋白基因上真核生物RNA聚合酶II的分布情况 果蝇28XChIP 实验随后由 Varshavsky 及其同事进一步优化，他们首次采用甲醛交联法来研究组蛋白 H4 与热休克蛋白基因的结合情况29,30NChIP 方法由于具有天然完整的表位，因而能实现更好的 DNA 和蛋白质回收，并具有更高的抗体特异性，该方法最早由 Hebbes 及其同事于 1988 年描述。31.
与分析DNA-蛋白质相互作用的其他技术相比，ChIP的优势在于能够直接研究转录因子与DNA的实际相互作用 体内 且不使用探针或由缓冲液或凝胶创建的人工条件8,11,12结合ChIP与&#160;下一代测序技术可同时鉴定多个靶标。
该技术的主要局限性在于其在完整生物体的大规模检测中应用受限25。如果相应蛋白质仅在低水平表达或仅在短暂的时间窗口内表达，则使用ChIP技术分析&#160;差异基因表达模式也可能具有挑战性。另一个可能的限制因素是缺乏适用于ChIP的合适抗体11。
此处提供的 ChIP 方案可用于 体内 通过定量实时PCR（qRT-PCR）鉴定转录因子的靶基因。具体目标是鉴定NFAT2在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中的新靶基因。选择染色质免疫沉淀（ChIP）技术，因其能够在自然条件下直接证明NFAT2在人CLL患者细胞中与不同靶基因启动子区域的结合。

<table><tbody><tr><td>1 X PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 试管振荡器 Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>可用类似仪器替代</td></tr><tr><td>10X Bolt 样品还原剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0009</td><td></td></tr><tr><td>20X Bolt MES SDS 电泳缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0002</td><td></td></tr><tr><td>37% 甲醛 p.a., ACS</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td></td></tr><tr><td>4X Bolt LDS 样品缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>B0007</td><td></td></tr><tr><td>抗 NFAT2 抗体</td><td>Alexis</td><td>1008505</td><td>克隆号 7A6</td></tr><tr><td>抗 NFAT2 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>8032S</td><td>克隆号 D15F1</td></tr><tr><td>抗 NFAT2 抗体 ChIP 级</td><td>Abcam</td><td>ab2796</td><td>克隆号 7A6</td></tr><tr><td>大型离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>可用类似仪器替代</td></tr><tr><td>CD19-FITC 小鼠抗人抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555412</td><td>克隆号 HIB19</td></tr><tr><td>CD5-PE 小鼠抗人 CD5 抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>555353</td><td>克隆号 UCHT2</td></tr><tr><td>密度梯度介质 Biocoll（密度 1.077 g/mL）</td><td>Merck</td><td>L 6115</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 1.5 mL 管</td><td>eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>优质 FBS</td><td>Merck</td><td>S0615</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>可用类似仪器替代</td></tr><tr><td>Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液（100X）</td><td>Thermo Scientific</td><td>78440</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 蛋白转印装置</td><td>Thermo Scientific</td><td>IB21001</td><td></td></tr><tr><td>iBlot 2 转印膜堆，硝酸纤维素，标准尺寸</td><td>Thermo Scientific</td><td>IB23001</td><td></td></tr><tr><td>iDeal ChIP-seq 组蛋白检测试剂盒</td><td>Diagenode</td><td>C01010059</td><td></td></tr><tr><td>钙离子霉素钙盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I3909</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680LT 驴抗兔 IgG (H + L)，0.5 mg</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68023</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW 山羊抗小鼠 IgG (H + L)，0.1 mg</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>LI-COR Odyssey 近红外成像系统</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>B446</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 96 孔白色多孔板</td><td>Roche</td><td>4729692001</td><td>可用其他实时 PCR 仪器的板替代</td></tr><tr><td>裂解液 OptiLyse B</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM1400</td><td></td></tr><tr><td>M220 AFA 级水</td><td>Covaris</td><td>520101</td><td></td></tr><tr><td>M220 专注式超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>500295</td><td></td></tr><tr><td>磁力架，DynaMag-15 磁铁</td><td>Thermo Scientific</td><td>12301D</td><td>可用类似仪器替代</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液 100X</td><td>Thermo Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>显微镜 Axiovert 25</td><td>Zeiss</td><td>451200</td><td>可用类似仪器替代</td></tr><tr><td>microTUBE AFA 纤维预切带卡口盖 6x16mm</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td></td></tr><tr><td>改进型 Neubauer 计数板</td><td>Karl Hecht GmbH &amp;amp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Co KG</td><td>40442012</td><td>可用类似仪器替代</td></tr><tr><td>NH4 肝素单采血管</td><td>Sarstedt</td><td>02.1064</td><td></td></tr><tr><td>无核酸酶水</td><td>Promega</td><td>P1193</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris 蛋白凝胶，1.0 mm，15 孔</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey&amp;reg; 封闭缓冲液（TBS）500 mL</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-50000</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100X</td><td>Merck</td><td>A2213</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green FastMix</td><td>Quanta Bio</td><td>95072-012</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>引物 &lt;em&gt;CD40L&lt;/em&gt; 启动子区正向引物</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-ACTCGGTGTTAGCCAGG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>引物 &lt;em&gt;CD40L&lt;/em&gt; 启动子区反向引物</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-GGGCTCTTGGGTGCTATTGT -3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>引物 &lt;em&gt;IL-2&lt;/em&gt; 启动子区正向引物</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCCAAAGAGTCATCAGAAGAG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>引物 &lt;em&gt;IL-2&lt;/em&gt; 启动子区反向引物</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-GGCAGGAGTTGAGGTTACTGT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>引物 &lt;em&gt;LCK&lt;/em&gt; 启动子区正向引物</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-CAGGCAAAACAGGCACACAT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>引物 &lt;em&gt;LCK&lt;/em&gt; 启动子区反向引物</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-CCTCCAGTGACTCTGTTGGC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>兔单克隆 IgG XP 同型对照抗体</td><td>Cell Signaling</td><td># 3900S</td><td>克隆号 DA1E</td></tr><tr><td>实时 PCR 仪</td><td>Roche</td><td>LightCycler 480</td><td>可用类似仪器替代</td></tr><tr><td>滚轴混合器</td><td>Phoenix Instrument</td><td>RS-TR 5</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充物</td><td>Thermo Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>安全型 Multifly 针头 21G</td><td>Sarstedt</td><td>851638235</td><td></td></tr><tr><td>SeeBlue Plus2 预染蛋白标准品</td><td>Thermo Scientific</td><td>LC5925</td><td></td></tr><tr><td>振荡器 Duomax 1030</td><td>Heidolph Instruments</td><td>543-32205-00</td><td>可用类似仪器替代</td></tr><tr><td>小型离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heraeus Fresco 17</td><td>可用类似仪器替代</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermo Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>&amp;szlig;-巯基乙醇</td><td>Thermo Scientific</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Tris 缓冲盐水（TBS-10X）</td><td>Cell Signaling</td><td>#12498</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

一种染色质免疫沉淀实验用于鉴定慢性淋巴细胞白血病中新的nfat2靶基因

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

慢性淋巴细胞白血病（CLL）以恶性B细胞克隆扩增为特征，是西方国家最常见的白血病类型。大多数CLL患者疾病进展缓慢，其白血病细胞表现为无能（anergic）表型，即B细胞受体对外源性刺激无反应。我们近期研究发现，转录因子NFAT2在CLL细胞无能状态中起关键调控作用。在不同疾病中分析转录因子功能时，一个主要挑战是鉴定其特异性靶基因。这一点对于&#160;阐明致病机制及潜在治疗干预具有重要意义。染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation, ChIP）是一种用于检测蛋白质与DNA相互作用的经典技术，因此可用于鉴定哺乳动物细胞中转录因子的直接靶基因。本文中，ChIP被用于鉴定 LCK 作为NFAT2在人类CLL细胞中的直接靶基因。使用甲醛对DNA及其结合蛋白进行交联，随后通过超声处理将DNA剪切为约200-500个碱基对（bp）的片段。利用抗NFAT2抗体（αNFAT2抗体）从细胞碎片中选择性地免疫沉淀与NFAT2交联的DNA片段。经纯化后，通过实时定量PCR（qRT-PCR）检测结合的DNA片段。富集明显的DNA序列代表基因组中被NFAT2靶向的区域。 在体DNA的适当剪切以及所需抗体的选择对于该方法的成功应用尤为关键。本方案适用于演示NFAT2与靶基因之间的直接相互作用。其主要局限性在于，难以在大规模检测中将染色质免疫沉淀技术（ChIP）应用于完整生物体内多种转录因子靶基因的分析。

图1展示了对一名慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者进行CD19-FITC和CD5-PE抗体染色后的典型流式细胞术分析结果。图1a显示了淋巴细胞的设门区域，这些细胞在CLL患者的血液中占大多数。图1b显示了CD19+/CD5+ CLL细胞的比例，在本例中占淋巴细胞的89.03%。该患者体内CD19+/CD5- B细胞的比例为3.72%。
图2展示了不同固定时间处理的Jurkat细胞中抗体性能的示例，通过SDS-PAGE和Western Blot进行评估。分析了来自不同生产商的多种抗体。图2a<...

慢性淋巴细胞白血病（CLL）是西方世界最常见的白血病类型。NFAT转录因子在多种细胞类型的发育和活化过程中发挥重要的调控作用。本文介绍了一种在人类CLL细胞中应用染色质免疫沉淀（ChIP）技术的实验方案，用于鉴定NFAT2的新型靶基因。

一种染色质免疫沉淀实验用于鉴定慢性淋巴细胞白血病中新的NFAT2靶基因

慢性淋巴细胞白血病（CLL）以恶性B细胞克隆扩增为特征，是西方国家最常见的白血病……

该方法有助于提供肿瘤学领域的关键信息，例如鉴定潜在的靶基因和致病机制，从而开发潜在的治疗干预手段。该技术的主要优势在于能够检测NFAT2与其他转录因子与已知及新靶基因之间的相互作用。通常，初次接触该方法的研究人员会面临困难，因为最佳的固定和超声破碎条件较难确定。首先，取一个1.5毫升离心管，加入1毫升37%甲醛。然后另取一个1.5毫升离心管，加入1毫升1.25摩尔甘氨酸，并在一个5毫升离心管中加入4毫升PBS。接着，在细胞刺激结束后，按照文本所述实验方案离心收集细胞，用500微升PBS重悬细胞，并将离心管置于装有冰块的盒子中。向细胞中加入 13.5 µL 的 37% 甲醛，通过上下吹打混匀。然后将悬液在室温下孵育。之后加入 57 µL 的 1.25 M 甘氨酸以终止固定。室温孵育5分钟。孵育结束后立即将细胞置于冰上，在4°C条件下以500 × g离心5分钟。然后吸除上清液。随后，用一毫升预冷至4°C的PBS缓冲液重悬细胞，在4°C、200 × g条件下离心5分钟，洗涤细胞两次，并弃去上清液。将细胞沉淀用五个毫升的裂解缓冲液1通过上下吹打重悬。然后将样品置于冰上，振荡孵育10分钟。此后，在 4°C 条件下以 500 × g 离心 5 分钟。然后使用移液器小心吸去上清液。在 5 毫升裂解缓冲液 2 中重悬细胞，并反复吹打混匀。然后在冰上振荡孵育细胞10分钟。孵育结束后，在4°C条件下以500 × g离心5分钟，并小心去除上清液。接着，用含有1×蛋白酶抑制剂的剪切缓冲液1重悬细胞沉淀。然后将细胞悬液在冰上孵育10分钟。取140微升细胞悬液转移至超声破碎管中，注意避免产生气泡。将管子置于7摄氏度的聚焦式超声仪中，剪切10至7.5分钟。将细胞悬液转移至1.5毫升离心管中。在4°C条件下，以15,700 × g离心10分钟，收集上清液至新管中。首先，在一个1.5毫升离心管中为每次沉淀反应准备20微升蛋白A包被的磁珠。将磁珠置于磁力架上静置1分钟，吸去上清液。然后用移液器反复吹打，每20微升蛋白A包被的磁珠加入40微升1×染色质免疫沉淀缓冲液一进行洗涤。将磁珠再次置于磁力架上静置1分钟，吸去上清液。在将珠子重新悬浮于原始体积的1× chIP缓冲液一之前，重复此洗涤过程三次。向珠子中加入BSA蛋白酶抑制剂、5× chIP缓冲液和ChIP-seq级水。接着，加入剪切后的染色质。使用10微克抗NFAT2抗体捕获NFAT2，以2.5微克IgG抗体作为对照。将混合物在4°C、6 RPM转速的旋转仪上孵育过夜。次日，在7,000 × g下离心试管5秒，并将其置于磁力架上孵育1分钟。然后吸去上清液，并依次用洗涤缓冲液一、二、三和四各洗涤磁珠一次。将离心管在7000 ×g 条件下离心5秒，随后置于磁力架上孵育1分钟。之后移除上清液，并加入下一种洗涤缓冲液。最后一次洗涤后，将离心管在700

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癌症研究

一种检测慢性淋巴细胞白血病新 nfat2 靶基因的染色质免疫沉淀法

本方案描述了如何利用染色质免疫沉淀（ChIP）技术研究由信号转导通路诱导的转录调控过程中染色质模板发生的动态改变。...

染色质免疫沉淀（ChIP）检测人细胞中基因激活表达过程中的动态组蛋白修饰

本视频介绍了使用微球菌核酸酶进行染色质剪切的实验方案。染色质剪切是染色质免疫沉淀（ChIP）实验流程中的关键步骤，有助于研究人类慢性髓系白血病细胞中蛋白质与DNA的相互作用。在本视频所展示的实验方案中，染色质剪切通过超声处理完成。...

染色质剪切：一种利用酶消化法生成染色质片段的方法

本视频介绍了染色质免疫沉淀（ChIP）实验的方案，这是一种用于证明蛋白质与DNA相互作用的经典技术。该技术可用于鉴定人类慢性淋巴细胞白血病细胞中的靶基因。...

染色质免疫沉淀实验：一种用于研究细胞内蛋白质-DNA相互作用的技术

在本视频中，我们演示了染色质免疫沉淀技术，用于鉴定少突胶质前体细胞基因组DNA特定区域上的蛋白质结合位点 通过...

染色质免疫沉淀法鉴定基因组DNA上靶蛋白结合位点

我们介绍一种使用原代T细胞进行染色质免疫沉淀的稳健方法。该方法基于标准流程，但采用了一套特定的条件和试剂，可提高对有限数量细胞的操作效率。尤为重要的是，本文详细描述了数据分析阶段的具体步骤。...

使用有限生物量进行高效的染色质免疫沉淀

本文介绍了一种结合两种蛋白质组学技术的实验方案，即二维凝胶电泳（2DE）与质谱分析（MS），用于鉴定两个或多个原始样本组之间差异表达或发生翻译后修饰的蛋白质。该方法结合功能实验，可实现对预后标志物或治疗靶点的鉴定与表征。...

从二维电泳凝胶斑点到蛋白质功能：慢性淋巴细胞白血病中HS1蛋白的研究启示

本文所述方案是一种简便且可重复的方法，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）来检测在不同培养条件下慢性淋巴细胞白血病（CLL）细胞的嘌呤代谢情况。...

基于高效液相色谱法检测人慢性淋巴细胞白血病细胞外核苷酸/核苷代谢的实验方法

本研究介绍了一种优化的甲基化CpG结合域（MBD）测序方案及相应的计算分析流程，用于鉴定慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者中差异甲基化的富含CpG区域。...

利用基于甲基化CpG结合结构域捕获的方法对中国台湾慢性淋巴细胞白血病患者的全面DNA甲基化分析

本文介绍了一种实验方案，旨在通过对少量细胞进行染色质免疫沉淀（ChIP）、文库构建、高通量测序及生物信息学数据分析，研究少突胶质细胞转录因子2（Olig2）在急性分离的脑少突胶质细胞前体细胞（OPCs）中的全基因组结合情况。...

通过低细胞量染色质免疫沉淀测序分析鉴定急性纯化的PDGFRα+细胞中转录因子Olig2的基因组结合位点

本方案可实现从原代慢性淋巴细胞白血病细胞中高效制备细胞核与细胞质组分，并对其进行优化。这些样品可用于确定蛋白质的定位，以及在细胞受到刺激或药物处理后，蛋白质在细胞核与细胞质区室之间转运发生的变化。...

原代慢性淋巴细胞白血病细胞的亚细胞分级分离以监测核/胞质蛋白转运

本文概述了一种从小鼠骨髓中分离中性粒细胞并构建ATAC-seq文库的实验方案，旨在确保中性粒细胞的高存活率和高质量文库的制备。文章提供了骨髓细胞制备、免疫磁珠分选及文库构建的详细步骤，为中性粒细胞研究领域的新手研究人员提供了有价值的参考指南。...

小鼠骨髓来源中性粒细胞的ATAC-Seq文库制备

学习染色质免疫沉淀法检测慢性淋巴细胞白血病中NFAT2的新靶基因。该技术可揭示致癌机制，为开发潜在治疗策略提供关键信息，助力肿瘤学研究。

一种染色质免疫沉淀实验用于鉴定慢性淋巴细胞白血病中新的NFAT2靶基因

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