Name: 消炎散对慢性应激小鼠的抗抑郁作用评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: 了解利用慢性不可预知温和应激建立小鼠抑郁模型并评估中药消炎散抗抑郁作用的标准化实验方案。该方法为传统中医药防治抑郁症的临床前研究提供可靠技术支持。

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本研究受到国家自然科学基金（No. 81630104；No. 81473597）及中央高校基本科研业务费专项资金（No. 2018-JYBZZ-XS005）的资助。本文所展示的实验方案与结果源自以下文章 逍遥散对慢性应激小鼠发挥抗抑郁样作用中海马区胶质纤维酸性蛋白表达标准化的参与机制 由丁秀芳博士， 等

本方案经北京中医药大学动物伦理委员会批准，符合中国《实验动物护理与使用指南》的所有规定。&#160;实验过程中未发生意外死亡情况，本研究中也无需对任何动物实施安乐死。
1. 准备实验用药物
注意：中药材由北京中医药大学刘B博士购买并鉴定。逍遥散包含以下八味传统中药，配比为6:6:6:6:3:6:2:2：当归、白芍、茯苓、柴胡、甘草、白术、薄荷和生姜。
<ol>
	<li>按先前所述方法制备逍遥散16。 
	注意：我们在中日友好医院中药制剂室提取了这些化合物，提取率为18.8%。</li>
	<li>采用高效液相色谱-质谱联用分析法（LC-MS/MS）验证逍遥散的质量17。</li>
</ol>
2. 实验操作前小鼠的准备
注意：实验方案中选用60只12周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠，每只小鼠体重在18至22 g之间。
<ol>
	<li>在进行CUMS实验前，将小鼠单独饲养于典型的无特定病原体（SPF）级实验动物房中（22 ± 1 °C，12 h/12 h明暗循环，相对湿度：30–40%），适应环境一周。</li>
	<li>根据小鼠体重，将其随机分为对照组、模型组、逍遥散治疗组和氟西汀治疗组，每组15只小鼠。</li>
	<li>实验开始前，使用记号笔在每只小鼠尾部编号标记。</li>
	<li>对所有小鼠进行为期五天的蔗糖偏好实验（参见步骤5）和旷场实验（参见步骤6）。</li>
</ol>
3. 小鼠抑郁模型的诱导
注意：为诱导抑郁，模型组及两个治疗组的小鼠接受为期21天的CUMS处理18。方案可根据实际情况调整，但应遵循同一应激源不可连续使用的原则。
<ol>
	<li>连续21天每天使小鼠暴露于以下七种应激源中的任意两种19。我们的造模方案设计如下：
	<ol>
		<li>周一，使小鼠经历食物剥夺（清空每笼饲料，持续24小时，上午8:00至次日上午8:00）和饮水剥夺（移除每笼饮水瓶，持续24小时，上午8:00至次日上午8:00）。</li>
		<li>周二，使小鼠经历束缚应激（将小鼠置于小型塑料容器中束缚3小时，上午8:00至11:00）和空笼应激（移除每笼垫料，持续11小时，上午8:00至晚上19:00）。</li>
		<li>周三，使小鼠经历潮湿污染笼具（向每笼中倒入水并保持湿润24小时，上午8:00至次日上午8:00）和拥挤笼具（每笼放入5只小鼠，持续24小时，上午8:00至次日上午8:00）。</li>
		<li>周四，使小鼠经历束缚应激和冰水游泳20,21（强迫每只小鼠在装有冰水的透明玻璃水族箱中游泳5分钟）。</li>
		<li>周五，使小鼠经历潮湿污染笼具和食物剥夺。</li>
		<li>周六，使小鼠经历束缚应激和拥挤笼具。</li>
		<li>周日，使小鼠经历空笼应激和冰水游泳。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每周记录小鼠的被毛状态和体重，直至造模结束（第21天）。计算被毛状态总分，该分数为七个不同身体部位评分之和：头部、颈部、背部被毛、腹部被毛、前爪、尾部和后爪。评分为1表示被毛整洁，评分为0表示被毛凌乱22。</li>
	<li>实验结束时进行为期五天的蔗糖偏好测试（参见步骤5）和旷场实验（参见步骤6）。</li>
</ol>
4. 逍遥散的给药
注意：逍遥散的剂量（0.25 g/kg/天）是根据其先前报道中表现出的良好疗效而选定的9。
<ol>
	<li>实验过程中，使用蒸馏水配制逍遥散和氟西汀混悬液，并确保立即使用。</li>
	<li>造模前每天给予对照组和模型组小鼠蒸馏水 0.5 mL，通过灌胃给药。同时，给予两个治疗组小鼠逍遥散（0.25 g/kg/天）或氟西汀（2.6 mg/kg/天）。</li>
</ol>
5. 蔗糖偏好实验
注意：测试前未进行任何水或食物剥夺。该方案按照先前报道的方法进行23。
<ol>
	<li>前两天，将小鼠单独饲养，每只小鼠提供两个装有自来水的水瓶。</li>
	<li>接下来两天，给每只小鼠提供两个装有1%蔗糖溶液的水瓶。</li>
	<li>最后一天，给每只小鼠提供两个水瓶，持续24小时，其中一个装有自来水，另一个装有1%蔗糖溶液。为消除小鼠饮水行为中的位置偏好，在12小时后交换两个水瓶的位置。</li>
	<li>记录消耗的蔗糖溶液和自来水的体积（mL），并按以下公式计算蔗糖偏好率：蔗糖偏好率（%）= 蔗糖溶液消耗量 / 总液体消耗量 × 100%。</li>
</ol>
6. 开放旷场实验
<ol>
	<li>在光线较暗且安静的房间内进行旷场实验，使用一个四边黑色无光泽的木制箱子。用蓝色线条将箱底均分为25个相等的方格。</li>
	<li>每只小鼠进入前，用5%酒精清洁旷场箱。然后，将小鼠轻柔地放置于旷场中央。</li>
	<li>在旷场正上方约200 cm处悬挂一台高清数码摄像机，记录每只小鼠5分钟内的行为活动。</li>
	<li>使用视频追踪系统软件分析小鼠行为录像，记录总移动距离和进入中心区域的次数。</li>
	<li>使用统计学软件分析总移动距离和进入中心区域次数的数据。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究中使用的CUMS模型是建立抑郁症应激易感性模型的常用方法24。CUMS的大多数表现可通过抗抑郁药物恢复，表明该模型具有较强的预测效度25。通过该方法，动物接受慢性不可预测的应激刺激后，会出现重度抑郁症的核心症状，包括位置偏爱条件反射降低、快感缺失以及情绪样行为受损26。本实验方案结果显示，持续给予逍遥散或氟西汀可改善CUMS诱导模型小鼠的抑郁样行为；其中氟西汀作为阳性对照药物，用于验证逍遥散的干预效果。
与旷场实验、强迫游泳实验或新奇抑制摄食实验不同，毛发评分并非与人类抑郁症相关的指标，但却是目前用于小鼠抑郁模型最普遍、最可靠且经过充分验证的方法27。在本研究中，模型组小鼠的毛发状态逐渐出现营养不良性改变，这种变化在应激两周后尚未显现，但在慢性不可预知性温和应激（CUMS）程序结束时（三周）明显加重；而在应激暴露一周后，各组间体重差异尚不显著。然而，在造模两周后，各组间的体重差异开始显现...

重度抑郁障碍（MDD）是一种慢性、高度复发性的精神疾病，临床表现为持续情绪低落、抑郁、自卑、精神运动性迟滞、兴趣丧失、睡眠障碍以及严重的悲观情绪或自杀倾向；该病对人类健康和社会稳定造成了严重危害1。根据世界卫生组织的报告，MDD已成为全球主要的致残原因之一，并可能在2030年成为疾病负担的主要原因2,3。目前，抗抑郁药物治疗和心理治疗被认为是治疗MDD的首选方法。然而，大量被诊断为MDD的患者对持续的药物治疗或心理干预无反应，这类患者被归类为难治性抑郁4。
逍遥散是一种经典的中药复方5，自中国宋代以来已广泛用于治疗心理疾病达数千年之久6。它由8味中药组成：Radix Bupleuri、Radix Paeoniae Alba、Radix Angelicae Sinensis、Poria、Rhizoma Atractylodis Macrocephalae、Radix Glycyrrhizae、Rhizoma Zingiberis Recens 和 Herba Menthae。逍遥散含有多种成分，作用于多个靶点，并通过多条通路发挥作用7。研究表明，逍遥散是一种安全有效的方剂，常用于治疗多种与精神障碍相关的疾病，现代研究也重点关注了该复方的抗抑郁机制8,9,10。尽管目前关于重度抑郁症（MDD）的发病机制尚不明确，但已提出多种假说，包括单胺假说、神经递质受体假说、神经内分泌功能改变假说、免疫系统异常假说等etc。多项研究显示，逍遥散的抗抑郁作用与上述假说中的物质基础相关11,12，其治疗效应表现为改善类抑郁行为13。
此外，随着抑郁症的普遍流行，现代社会面临着劳动力减少、提前退休以及高昂治疗费用等问题14。昂贵的治疗需要严格的医疗监护，这意味着医疗成本大幅增加，同时还需要精准预测不良反应和副作用15。中药逍遥散成分易得，具有独特疗效且副作用轻微，其应用有助于减轻现代医学治疗的负担。因此，为了为逍遥散的应用提供更充分的理论依据，应提供一种替代性临床疗法，用于治疗发病率逐年上升的抑郁症，同时促进人类健康。本文描述了一项通过建立小鼠抑郁模型，利用逍遥散预防抑郁样行为的实验方案。采用敞箱实验和蔗糖偏好实验验证逍遥散的抗抑郁作用。

<table><tbody><tr><td>中药</td><td>Tongrentang (亳州，安徽) 饮片有限公司</td><td>-</td><td>药物由中日友好医院中药制剂室提取，使用蒸馏水配制逍遥散混悬液，剂量为 0.25 g/kg/d。</td></tr><tr><td>氟西汀</td><td>PATHEON FRANCE</td><td>5545A</td><td>使用蒸馏水配制氟西汀混悬液，剂量为 2.6 mg/kg/d。</td></tr><tr><td>C57BL/6j 小鼠</td><td>北京维通利华实验动物技术有限公司（查尔斯河公司）</td><td>SCXK 2011-0004</td><td>购自北京维通利华实验动物技术有限公司（查尔斯河公司）的 60 只健康雄性 12 周龄 C57BL/6J 小鼠。</td></tr><tr><td>小鼠笼具</td><td>斯泰林生物科技</td><td>34853016</td><td>318&amp;times;202&amp;times;135 mm</td></tr><tr><td>蒸馏水</td><td>-</td><td>-</td><td>实验全程使用该蒸馏水。</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>-</td><td>用于糖水偏好实验中配制 1% 蔗糖溶液。</td></tr><tr><td>ACS-2EAS 电子天平</td><td>北京恒中衡电子科技有限公司</td><td>-</td><td>用于称量小鼠在不同阶段的体重。</td></tr><tr><td>木质黑色无光泽箱</td><td>-</td><td>-</td><td>（40 cm × 40 cm × 15 cm），由蓝色线条划分为 25 个相等的方格。</td></tr><tr><td>WV-CP470 摄像机</td><td>Panasonic，日本</td><td>-</td><td>高清数码摄像机，用于记录旷场实验的全过程。</td></tr><tr><td>EthoVision 3.0 软件</td><td>Noldus，瓦赫宁根，荷兰</td><td>-</td><td>视频追踪系统，用于评估小鼠的运动功能和情绪行为。</td></tr><tr><td>SPSS Statistics 21.0 软件</td><td>IBM</td><td>-</td><td>采用 SPSS 21.0 软件进行数据分析，根据正态性检验和方差齐性检验结果，对一般数据采用单因素方差分析或非参数检验，组间比较采用 LSD 法。</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 6.0 软件</td><td>Graphpad Software, Inc.，美国</td><td>-</td><td>使用 Graphpad Prism 6.0 软件绘制统计图表。</td></tr></tbody></table>

评估逍遥散对慢性应激小鼠的抗抑郁作用

Evaluating the Anti-depression Effect of Xiaoyaosan on Chronically-stressed Mice

除了标准化使用抗抑郁药物和心理治疗外，中药的应用也使重度抑郁障碍（MDD）患者的总体症状得到改善。因此，本研究旨在建立小鼠抑郁模型，观察慢性不可预知性轻度应激（CUMS）相关的行为变化，并进一步评价逍遥散的抗抑郁作用。将小鼠随机分为四组：对照组、模型组、逍遥散治疗组和氟西汀治疗组。所有小鼠均单独饲养，通过接受为期21天的多种CUMS干预处理以诱导抑郁样状态，具体操作如实验方案所述。对照组和模型组小鼠每日给予0.5 mL蒸馏水，治疗组小鼠则分别给予逍遥散（0.25 g/kg/天）或氟西汀（2.6 mg/kg/天）。研究中所用药物均在三周内每日经口灌胃给药。为评估抑郁样行为，记录了一系列参数，包括毛发状态、体重、敞箱实验评分和蔗糖偏好实验评分。数据分析显示，与对照组小鼠相比，模型组小鼠的行为发生显著改变，而逍遥散和氟西汀治疗可明显改善这些异常行为。本研究结果表明，逍遥散对CUMS诱导的小鼠抑郁样行为具有抗抑郁作用，提示逍遥散处方中的成分因其对抑郁样行为的有益效应，可能值得进一步开发用于抑郁症的治疗。

请注意，这些结果此前已由丁秀芳博士发表。 等18
数据以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。根据正态性检验和方差齐性检验的结果，对一般数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）或非参数检验。组间比较采用LSD检验。此外，对于重复测量数据（毛发评分和体重），采用一般线性模型（GLM）的重复测量过程进行单因素方差分析，并采用多变量方差分析方法对各时间点的组间差异进行比较（LSD法）。
CUMS诱导小鼠的生理状态
在采用慢性不可预知性应激（CUMS）处理小鼠三周以诱导抑郁模型后，模型组小鼠的毛发状态出现逐渐性营养不良；在应激两周后尚未出现明显变化，但...

本文介绍了一种建立小鼠抑郁模型的方法，用于观察慢性不可预知性轻度应激（CUMS）相关的行为学变化，并评价逍遥散的抗抑郁作用。

除了标准化使用抗抑郁药物和心理治疗外，中药的应用已总体上导致……

该方法有助于回答利用逍遥散等传统中药在抑郁症防治领域中的关键问题。逍遥散是中国数千年来治疗心理疾病广泛使用的一种方剂。该技术的主要优势在于为逍遥散在抑郁症防治中的应用提供实验依据。该技术的意义延伸至抑郁症治疗的临床前研究，因为它提供了使用传统中药评估抗抑郁效果的标准化方案。通常，初学者会遇到困难，因为建模过程非常复杂，且对抑郁行为的重要测量参数不易掌握。为诱导抑郁，连续21天每天对小鼠施加以下7种应激源中的任意2种。注意：在建模前每天给予两个治疗组小鼠药物，并向对照组和模型组小鼠提供0.5毫升蒸馏水。通过清空每笼饲料使小鼠经历禁食处理，或通过移除饮水瓶使小鼠经历24小时禁水处理。使小鼠接受束缚应激处理，即将小鼠置于小型塑料容器中束缚3小时。或者使用移除垫料的空笼子。另一种方法是，将水倒入每个笼子中，保持笼子潮湿24小时，使小鼠暴露于潮湿且被污染的笼子环境中。将5只小鼠放入同一个笼子中拥挤饲养25小时，使小鼠暴露于拥挤的笼养环境。对于最后一步，将小鼠置于冰水游泳环境中，使每只小鼠在装有冰水的透明玻璃水族箱中游泳5分钟。最后，在建模结束前每周记录小鼠的毛发状态和体重，持续至第21天，并计算毛发状态的总评分。在蔗糖偏好试验的前两天，将小鼠单独饲养，每笼放置两个装有自来水的水瓶。接下来两天，给小鼠提供两个装有1%蔗糖溶液的瓶子。最后一天，给小鼠提供两个瓶子持续24小时，一个装有自来水，另一个装有1%蔗糖溶液。为消除小鼠在饮水行为中的位置偏好，12小时后交换两个瓶子的位置。记录消耗的蔗糖溶液和自来水的体积。最后，计算蔗糖偏好度。首先，用蓝色线条将一个四边、木质、黑色无光泽盒子的底部划分为25个相等的方格。每次小鼠进入前，用5%酒精清洁旷场箱。然后将小鼠置于旷场中央。在旷场正上方约200厘米处悬挂一台高清数码相机，记录每只小鼠5分钟内的行为。最后，使用视频追踪系统软件对小鼠行为视频进行评估和分析，并记录总运动距离和进入中心区域的次数数据。与模型组相比，连续给予逍遥散或氟西汀治疗后，小鼠的毛发状态明显改善。自第三周起，小鼠体重显著降低。在基线时，所有组的小鼠蔗糖偏好相似。然而，在模型组中，经过3周应激处理后，蔗糖偏好显著下降。此外，所有小鼠在应激暴露前的基线期均表现出相似的行为状态。然而，经过3周的应激暴露后，模型组在5分钟内移动的总距离显著低于对照组。与对照组相比，模型组进入中央区域的次数也显著减少。在进行该操作时，需要注意在每天造模前1至2小时进行此项行为学测试并给予两种药物，以确保观察到的效应确实由药物本身引起。完成该操作后，可进一步开展其他方法，例如强迫游泳实验，以回答更多问题，如逍遥散是否能够改善抑郁小鼠在强迫游泳实验中的绝望行为？该技术建立后，为研究人员探索中药在抑郁症防治领域的效应及其潜在机制奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Behavior

行为

消炎散对慢性应激小鼠的抗抑郁作用评价

本视频展示了通过反复固定小鼠以诱导慢性应激的方法，该方法可导致皮质酮释放，并降低神经元中谷氨酸受体的活性，从而引发类似抑郁的行为。...

通过固定应激在小鼠中诱导类似抑郁行为

来源：Yan, Z.，等．逍遥散对慢性应激小鼠抗抑郁作用的评价．J. Vis. Exp.

通过慢性应激暴露诱导和评估小鼠抑郁状态

本文描述并采用了一种建立小鼠亚慢性轻度社交挫败应激模型的方法，用于研究抑郁症的致病特征，包括体重增加后出现的类似多食和多饮的症状。...

一种用于研究应激诱导行为与生理功能缺陷的亚慢性轻度社交挫败应激小鼠模型

不可预测的慢性轻度应激（UCMS）方案是一种经过验证的研究慢性应激及相关抑郁症状所导致的行为和生理变化的方法。实施八周UCMS方案可诱导任一性别的啮齿类动物出现行为改变及不良健康后果。...

一种用于诱发啮齿类动物抑郁症状、行为改变及负面健康后果的不可预测性慢性轻度应激方案

本文介绍了小鼠中不可预测的慢性温和应激方案。该方案可诱导长期的类抑郁表型，并可用于评估潜在抗抑郁药物在逆转行为学及神经分子水平类抑郁缺陷方面的有效性。...

小鼠快感缺失诱导的不可预测性慢性轻度应激方案

本文提供了一种使用固定装置对慢性固定小鼠诱导类抑郁行为的简化且标准化的实验方案。此外，还介绍了用于验证抑郁状态诱导的行为学和生理学技术。...

一种用于诱导小鼠抑郁样行为的慢性制动应激方案

Y迷宫屏障任务是一种行为测试，用于检测个体为获得奖励而付出努力的动机。本文中，我们讨论了将该行为测试应用于多种经过充分验证的慢性应激模型，包括慢性皮质酮处理和社会挫败应激，以及一种新型的慢性非选择性社会挫败应激（CNSDS），后者在雌性动物中同样有效。...

慢性应激改变小鼠在Y迷宫障碍任务中的努力相关选择行为

抑郁的慢性绝望小鼠模型（CDM）包括重复的强迫游泳实验以及另一个延迟的游泳阶段作为检测指标。该模型适用于诱导一种至少持续4周的稳定慢性抑郁样状态，可用于评估亚慢性及急性治疗干预的效果。...

抑郁症的动物模型——慢性绝望模型（CDM）

本方案基于蒙医学理论，阐述了一种用于抑郁症的慢性不可预测性轻度应激（CUMS）模型，并提供了行为学测试的验证方法。...

基于蒙药的 rats 慢性不可预测性轻度应激

通过整合四种日常社会应激源，本研究描述了一种用于雌性C57BL/6J小鼠精神疾病研究的多重整合社会应激（MISS）模型。经过连续十天重复暴露于MISS后，小鼠表现出类似抑郁和焦虑的表型，从而为研究女性精神疾病提供了一种自然的、基于病因的动物模型。...

一种用于雌性C57BL/6J小鼠精神疾病研究的多重整合社会应激模型

了解利用慢性不可预知温和应激建立小鼠抑郁模型并评估中药消炎散抗抑郁作用的标准化实验方案。该方法为传统中医药防治抑郁症的临床前研究提供可靠技术支持。

评估逍遥散对慢性应激小鼠的抗抑郁作用

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