高效且可扩展的临床兼容性角膜缘上皮干细胞从人多能干细胞的定向分化

本方案介绍了一种无明确定义饲养层细胞的方法，用于将人多能干细胞分化为角膜缘上皮干细胞。在健康眼球中，角膜缘上皮干细胞负责更新角膜上皮细胞。这些细胞受损会导致一种称为角膜缘干细胞缺乏症的疾病，并引起角膜透明度丧失。

此处展示的细胞培养方法可高效生成角膜缘上皮干细胞，用于未来的角膜细胞替代治疗。首先，按照文本方案中所述的方法传代并维持无饲养层的人多能干细胞培养。务必使用高质量的人多能干细胞作为分化的起始材料。

准备诱导拟胚体形成时，将所有所需材料和试剂在超净工作台中恢复至室温。通过向每孔加入500微升无异源胰蛋白酶EDTA，使无饲养层的人多能干细胞脱离并形成悬浮液。在37摄氏度、5%CO2条件下孵育。

三分钟后，将细胞从培养箱中取出，检查细胞形态，以确定胰蛋白酶去除的最佳时机。仔细观察细胞，在细胞变圆但尚未完全脱落时，即为去除无异源胰蛋白酶EDTA的最佳时间点。在此最佳时间点，将无异源胰蛋白酶EDTA从细胞中移除。

加入确定浓度的胰蛋白酶抑制剂，轻轻吹打使细胞脱落。将单细胞悬液收集至50毫升离心管中。以300g离心5分钟。

然后，去除上清液，并将细胞重悬于1毫升培养基中。细胞计数后，将两百万至三百万个细胞加入三毫升基础诱导培养基中，该培养基含有5 µM的blebbistatin，并接种至低吸附六孔板的每个孔中。于37°C、5% CO₂条件下过夜培养。

第二天，在显微镜下检查类胚体的质量。移除培养基，并更换为3毫升基础诱导培养基，其中添加10微摩尔SB-505124和50纳克/毫升人碱性成纤维细胞生长因子。继续在37摄氏度、5%CO2条件下培养。

接下来两天，移除培养基，并更换为三毫升基础诱导培养基，其中添加 25 纳克/毫升的骨形态发生蛋白 4。然后，在先前相同的条件下继续培养。第 4 天，用 DPBS（含钙离子和镁离子）稀释，制备每平方厘米 0.5 微克的层粘连蛋白-521 和每平方厘米 5 微克的人胎盘 IV 型胶原蛋白的混合溶液。

使用该混合液，以每皿五毫升的总包被体积对100毫米组织培养皿进行包被，用于贴壁分化。密封培养皿，并在4摄氏度下保存过夜。第五天，在超净工作台中将所有所需材料和试剂升温至室温。

此后，移除包被溶液，并向每皿中加入 10 毫升预热的分化培养基。使用移液器将单个培养板孔中的类胚体转移至两到三个组织培养皿中。然后轻轻振荡每个培养皿，使类胚体均匀分布。

接下来的两到三周内，在37摄氏度、5%CO2条件下将细胞维持在贴壁培养状态，每周更换三次培养基，每次加入10毫升新鲜的分化培养基。使用相差显微镜定期观察细胞，检查是否出现正确的上皮细胞形态。首先，在超净工作台中将所有所需材料和试剂预温至室温，但冷冻保存培养基应预先冷却。

接下来，通过加入无异源成分的胰蛋白酶EDTA，并在37摄氏度、5% CO2条件下孵育，将人多能干细胞来源的角膜缘上皮干细胞解离为单细胞悬液。五分钟后，从培养箱中取出细胞，观察细胞形态，以确定去除胰蛋白酶的最佳时机。仔细观察细胞，当细胞变圆但尚未完全脱落时，即为去除无异源成分胰蛋白酶EDTA的最佳时间点。

在最佳时间点，从细胞中移除无异源物的胰蛋白酶EDTA，并按照前述方法使细胞脱离。计数细胞后，以300g离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于预冷的无异源物冷冻保存培养基中。

使用移液器将单细胞悬液转移至冻存管中，每管含有500,000至100万个细胞，溶液体积为1毫升冻存培养基。将冻存管放入冻存盒中，并在5分钟内转移至-80摄氏度的冰箱中过夜保存。

第二天，将试管转移至液氮中进行长期保存。在解冻细胞之前，用每平方厘米5微克的人胎盘IV型胶原蛋白和每平方厘米0.5微克的LM-521的混合物包被所有需要的培养皿和孔板孔，同时在超净工作台中将所有所需材料和试剂预热至室温。接着，从培养皿和孔板孔中移除包被液，并加入适量预热的分化培养基。

将预热的分化培养基加入15毫升锥形管中。将细胞快速解冻至室温。解冻后，立即把细胞悬液转移至锥形离心管中。

在300 × g条件下离心5分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于分化培养基中，以去除任何冷冻保存液。将细胞以每平方厘米40,000至50,000个细胞的密度接种至预先包被的培养皿中，加入分化培养基进行培养。

将细胞在 37 摄氏度、5% CO2 条件下培养，每周更换三次分化培养基。在 Laminin-521 上，未分化的高质量无饲养层人多能干细胞首先形成边界清晰的独立克隆，随着融合逐渐发展为均一的单层细胞。在基础诱导培养基中培养，并添加 5 微摩尔的 blebbistatin 培养 24 小时，通常可形成大小不一但结构紧密、形态规则的拟胚体悬浮物；而在悬浮状态下进行表面外胚层诱导期间，拟胚体的形态不应发生显著变化。当将拟胚体接种至含 IV 型胶原和 Laminin-521 组合基质的分化培养基中后，很快即可观察到克隆样外延生长。

分化21至25天后，细胞形成典型的上皮细胞样多边形形态的融合均一单层。这些细胞可冷冻保存以供后续使用，因为冻存后细胞的活力和形态均能得到良好维持。在分化第24天，绝大多数细胞表达眼部发育关键调控因子配对盒蛋白PAX6以及广泛认可的角膜缘上皮干细胞标志物p63α。

在大多数p63α阳性细胞中可共同表达Delta Np63，证实了最具角膜特异性的Delta Np63α阳性细胞表型。部分其他标志物有表达，而另一些在此阶段则无法检测到，表明分化已向单能性角膜缘上皮前体细胞方向进展，但尚未发生向成熟角膜上皮细胞的终末分化。平均而言，每个未分化的无饲养层人多能干细胞在第25天时可产生0.7个细胞。

到第24天时，预计至少有65%的细胞群体呈delta Np63 alpha阳性。冻存过程可进一步纯化细胞群体。总体而言，本文所述方法相对简单，但有几个关键点对成功至关重要。

起始材料的高质量至关重要，同时通常还需要轻柔、流畅的细胞培养技术。本方案提供了可靠的手段，可用于临床应用以及各种研究目的的角膜缘上皮干细胞的制备。此外，该方法还可经简单修改，用于视网膜色素上皮细胞的分化。