Name: 高效可扩展的人多潜能干细胞临床相容角膜缘上皮干细胞的定向分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学习无饲养层细胞培养技术，将人多潜能干细胞高效分化为角膜缘上皮干细胞。该方法支持大规模生产临床级细胞，用于角膜细胞替代治疗，推动再生医学发展。

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本研究由芬兰科学院（资助号 297886）、Tekes 人类备用部件计划、芬兰技术和创新资助局、芬兰眼与组织库基金会以及芬兰文化基金会资助。作者感谢生物医学实验室技术人员 Outi Melin、Hanna Pekkanen、Emma Vikstedt 和 Outi Heikkilä 在细胞培养方面提供的出色技术支持和贡献。感谢 Katriina Aalto-Setälä 教授提供所使用的 hiPSC 细胞系，以及 BioMediTech 成像核心设施提供荧光成像设备。

坦佩雷大学已获得芬兰国家医学法律事务局（批准编号：1426/32/300/05）的批准，可开展涉及人类胚胎的研究。该机构还获得了皮尔坎马医院区伦理委员会的支持意见，允许其建立、培养和分化人胚胎干细胞系（Skottman/R05116），以及在眼科研究中使用人诱导多能干细胞系（Skottman/R14023）。本研究未建立新的细胞系。
注意：所述方案基于特定的商业化人多能干细胞（hPSC）及角膜上皮分化培养基。请参阅材料表以获取生产厂家/供应商信息及目录编号。
1. 建立无异种成分且无饲养层的hPSC培养体系
<ol>
	<li>准备工作
	<ol>
		<li>用人类重组层粘连蛋白-521（LN-521）包被24孔板。首次无饲养层（FF）传代时，使用浓度为1.09 µg/cm²的LN-521。2，以及 0.55 µg/cm2 以下段落中，建议的LN-521浓度可作为成功进行无饲养层（FF）培养的起始点，但可适当降低。
		<ol>
			<li>按照制造商说明，在 4 °C 下缓慢解冻 LN-521 冻存管。 
			注意：&#160;正确处理的LN-521溶液在解冻后可于4 °C保存最长3个月。</li>
			<li>为制备包被溶液，将适量LN-521储存液用含有Ca²⁺的1×杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释2+ 和 Mg2+ 至每孔总体积为300 µL。</li>
			<li>将包被液加入孔中，用封口膜密封酶标板，4 °C 过夜孵育。包被好的酶标板可在 4 °C 保存最多 2 周。 
			（可选）：&#160;或者，对于快速包被方案，将孔板与包被液在37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。2.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制hPSC培养基（特指Essential 8 Flex），按照生产商说明将提供的添加剂加入基础培养基中，并添加50 U/mL青霉素-链霉素。注意该配方对光和高温敏感。在室温（RT）下避光解冻添加剂并温育培养基。补充添加剂后的hPSC培养基需在配制后两周内使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将hPSC从饲养层培养体系转移至LN-521基质上的无饲养层培养
	<ol>
		<li>在超净工作台中将所有所需材料和试剂提前升温至室温。</li>
		<li>在饲养层上从标准培养体系传代人多能干细胞（hPSCs）例如 使用标准方法在灭活的人包皮成纤维细胞（hFF）或小鼠胚胎成纤维细胞，或其他饲养层培养体系上培养的人多能干细胞（hPSC）集落，可用手术刀切割成小块，再用针尖将这些小块分离下来。采用饲养层培养体系培养的人PSCs，可通过集落传代法进行传代，传代时可选择是否进行预先的酶处理。</li>
		<li>从24孔板中移除LN-521包被液，每孔加入1 mL预热的hPSC培养基。 
		注意：&#160;切勿让孔板干燥，因为LN-521在干燥条件下会失活。</li>
		<li>用移液器将菌落碎片/细胞簇转移至包被有LN-521的24孔板中，每孔加入20–30个菌落碎片，注意避免孔内过度拥挤，培养基为hPSC培养基。</li>
		<li>转移后次日更换为1 mL hPSC培养基，之后每隔一天换液一次。3–4天后细胞即可用于传代，此时hPSC已形成具有平滑、未分化形态的克隆。参考见 图 1B （第一张图像）。在第一次FF传代时，细胞不应生长至完全汇合的单层状态，而应在集落直径达到约1 mm时进行传代。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FF hPSC 培养物的传代与维持
	<ol>
		<li>在超净工作台中将所有所需材料和试剂预热至室温。</li>
		<li>从第二次FF传代开始，当培养物达到80–100%融合度时进行FF hPSCs传代。将FF hPSCs以单细胞传代方式接种至新的LN-521包被的24孔板中，每周两次（周一和周四），以维持高质量的未分化形态培养物，并实现无需周末换液的培养方案。具体操作细节请参见18,24,25.
		<ol>
			<li>用不含 Ca 的 1x DPBS 将 FF hPSCs 洗涤两次，每次 1 mL2+ 和 Mg2+.</li>
			<li>使用无异源胰蛋白酶-EDTA（特指TrypLE Select Enzyme），每孔加入500 µL，在37 °C、5% CO₂条件下孵育，使饲养层游离型人多能干细胞（FF hPSCs）脱落2孵育时间应以细胞变圆但尚未脱落为宜。通常在37 °C、5% CO₂条件下孵育3分钟即可。2 （不超过5分钟）。</li>
			<li>去除无异源性胰蛋白酶-EDTA，立即每孔加入500 µL确定型胰蛋白酶抑制剂。</li>
			<li>通过轻柔但彻底的吹打使FF hPSCs脱离，获得单细胞悬液。将FF hPSC悬液经40 µm细胞滤网转移至含有预热hPSC培养基的15 mL锥形离心管中。</li>
			<li>用1 mL hPSC培养基洗涤各孔，并将洗涤液加入15 mL圆锥形离心管中。</li>
			<li>将单细胞悬液在300 × g下离心5分钟，吸除上清，将细胞沉淀重悬于1 mL预热的hPSC培养基中。</li>
			<li>使用血细胞计数板或自动细胞计数器对细胞进行计数。</li>
			<li>移除LN-521包被液（0.55 µg/cm²）2从24孔板中取出，并按1.2.3步骤加入hPSC培养基。</li>
			<li>将FF hPSCs接种于0.55 µg/cm²的培养皿中2 LN-521 包被的 24 孔板，细胞密度为 40,000 – 50,000 个细胞/cm²2.</li>
			<li>传代后次日更换为新鲜的hPSC培养基，之后每隔一天更换一次，周日除外。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞在传代后3-4天即可用于分化，此时培养物已达到 &#62;85% 汇合度。为确保hPSCs的高质量，可参考既往研究中详细描述的表征方法18,24,25建议在FF系统中使用单细胞传代培养hPSCs时，传代次数不超过15代，以避免核型改变。分化实验应仅使用高质量、未分化的hPSCs作为起始材料。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人多能干细胞来源的角膜缘上皮干细胞的定向分化与冷冻保存
<ol>
	<li>准备工作
	<ol>
		<li>制备无异源成分的基础诱导培养基（基础诱导培养基）：在杜氏改良伊格尔培养基（特指 KnockOut DMEM）中添加 15% 无异源成分的血清替代物（特指 CTS KnockOut SR XenoFree）、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM 2-巯基乙醇、1% 非必需氨基酸以及 50 U/mL 青霉素-链霉素。基础诱导培养基需在两周内使用完毕。</li>
		<li>制备悬浮培养中用于角膜诱导的培养基。
		<ol>
			<li>第 1 天：在基础诱导培养基中添加 5 μM blebbistatin。</li>
			<li>第 2 天：在基础诱导培养基中添加 10 µM SB-505124 和 50 ng/mL 人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。</li>
			<li>第 3–4 天：在基础诱导培养基中添加 25 ng/mL 骨形态发生蛋白 4（BMP-4）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为贴壁培养制备角膜上皮分化培养基（分化培养基，特指 CnT-30）：根据生产商说明书向基础培养基中添加补充成分，并加入 50 U/mL 青霉素-链霉素。 
		注：分化培养基的配方对光敏感。补充后的分化培养基应在补充之日起 6 周内使用完毕。</li>
		<li>用 5 µg/cm2 人胎盘 IV 型胶原蛋白（col IV）和 0.5 µg/cm2 LN-521 的混合物包被 100 mm 组织培养皿，用于贴壁分化（参见步骤 2.3），包被液使用含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 1× DPBS 稀释，每皿总包被体积为 5 mL。按照 1.1.1.3 中所述方法制备并储存含 col IV 和 LN-521 的包被液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>步骤 I：悬浮培养中的角膜诱导
	<ol>
		<li>在超净工作台中将所有所需材料和试剂预热至室温。</li>
		<li>按照步骤 1.3.2.1–1.3.2.6 的说明，使用无异源成分的胰蛋白酶-EDTA 将 FF hPSCs 消化为单细胞悬液。计数细胞后，将 2–3×106 个细胞接种至低吸附 6 孔板的每个孔中，每孔总体积为 3 mL，培养基为添加了 5 μM blebbistatin 的基础诱导培养基，在 37 °C、5% CO2 条件下孵育过夜以诱导胚体（EB）形成（第 1 天）。</li>
		<li>次日（第 2 天），移除培养基，更换为 3 mL 添加了 10 µM SB-505124 和 50 ng/mL bFGF 的基础诱导培养基。</li>
		<li>接下来的两天（第 3–4 天），移除培养基，更换为 3 mL 添加了 25 ng/mL BMP-4 的基础诱导培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>步骤 II：贴壁培养中的角膜分化
	<ol>
		<li>在超净工作台中将所有所需材料和试剂预热至室温。</li>
		<li>第 5 天，将 EB 接种至已包被 5 µg/cm2 col IV 和 0.5 µg/cm2 LN-521 的 100 mm 组织培养皿中。
		<ol>
			<li>从 100 mm 组织培养皿中移除包被液，每皿加入 10 mL 预热的分化培养基。 
			注：切勿让培养皿干燥，因为 LN-521 在干燥后会失活。</li>
			<li>通过移液将一个 6 孔板孔中的 EB 转移至两到三个 100 mm 组织培养皿中（约每 cm2 50 个 EB）。轻轻振荡使 EB 均匀分布。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将细胞在 37 °C、5% CO2 条件下进行贴壁培养，每周三次（周一、周三、周五）更换 10 mL 新鲜分化培养基，持续 2.5–3 周。定期使用相差显微镜观察细胞，检查是否出现正确的上皮形态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>步骤 III：hPSC 来源的角膜缘上皮干细胞（LESCs）的冷冻保存
	<ol>
		<li>在超净工作台中将所有所需材料和试剂预热至室温，但冷冻保存培养基应预先冷却。</li>
		<li>使用无异源成分的胰蛋白酶-EDTA 消化 hPSC 来源的 LESCs 并进行细胞计数，操作参照 FF hPSCs 的步骤 1.3.2.1–1.3.2.6，但使用分化培养基。 
		注：对于 hPSC 来源的 LESCs，使用无异源成分胰蛋白酶-EDTA 的最佳孵育时间较长（约 5 分钟）。每 100 mm 培养皿使用 3 mL 无异源成分胰蛋白酶-EDTA 和确定的胰蛋白酶抑制剂。</li>
		<li>细胞计数后，以 300 × g 离心 5 分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于预冷的无异源成分 hPSC 冷冻保存培养基中。将单细胞悬液移入冻存管，每管含 0.5–1 × 106 个细胞，体积为 1 mL 冷冻保存培养基。</li>
		<li>将冻存管放入冻存盒中，并立即（5 分钟内）转移至 -80 °C 过夜。</li>
		<li>次日，将冻存管转移至液氮中进行长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>步骤 IV：复苏冻存的 hPSC-LESCs
	<ol>
		<li>复苏前，用 5 µg/cm2 col IV 和 0.5 µg/cm2 LN-521 包被培养皿/孔板。</li>
		<li>在超净工作台中将所有所需材料和试剂预热至室温。</li>
		<li>从培养皿/孔中移除包被液，并加入适量预热的分化培养基。 
		注：切勿让培养皿干燥，因为 LN-521 在干燥后会失活。</li>
		<li>在室温下快速解冻细胞，并立即将细胞悬液转移至含有 5 mL 预热分化培养基的 15 mL 圆锥形离心管中。</li>
		<li>以 300 × g 离心 5 分钟，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于分化培养基中以去除残留的冷冻保存培养基。</li>
		<li>将细胞接种至包被有 5 µg/cm2 col IV 和 0.5 µg/cm2 LN-521 的培养皿/孔中，使用分化培养基，接种密度为 40,000–50,000 个细胞/cm2。在 37 °C、5% CO2 条件下培养，每周更换三次分化培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 人多能干细胞来源的角膜缘上皮干细胞表型鉴定
<ol>
	<li>定性免疫荧光分析
	<ol>
		<li>用于免疫荧光时，用 5 µg/cm² 的包被物对 24 孔或 12 孔板的孔进行包被2 col IV 和 0.5 µg/cm2 在分化培养基中，以每平方厘米40 000–50 000个细胞的密度将LN-521包被的培养板接种并解冻hPSC-LESCs2.</li>
		<li>当细胞培养达到汇合状态时，使用4%多聚甲醛（PFA）固定细胞：用不含Ca²⁺和Mg²⁺的1x DPBS洗涤孔板两次2+ 和 Mg2+在室温下用 4% PFA 孵育 15–20 分钟。随后用 1x DPBS 洗涤两次，以去除残留的 PFA。每孔使用 0.5–1 mL 溶液。 
		注意：固定后的细胞可在染色前于4 °C条件下保存在1x DPBS中，最长可保存一周。 
		注意：PFA 具有毒性和腐蚀性。应在通风橱中操作 PFA，并穿戴防护服、护目镜和手套。</li>
		<li>吸除 1× DPBS，加入含 0.1% Triton X-100 的 1× DPBS，孵育 10–15 分钟以透化细胞膜。</li>
		<li>吸弃0.1% Triton X-100，于室温下用含3%牛血清白蛋白（BSA）的1× DPBS孵育1小时，以封闭非特异性抗体结合位点。用含0.5% BSA的1× DPBS配制一抗稀释液。 
		注意：参见 表1 推荐的一抗。</li>
		<li>吸弃3% BSA，加入适当稀释的一抗，4 °C孵育过夜。</li>
		<li>用1×DPBS洗涤各孔，每次5分钟，共洗涤3次。在含0.5% BSA的1×DPBS中配制二抗稀释液。 
		注意：参见 表1 推荐的二抗。</li>
		<li>吸弃 1x DPBS，加入合适且适当稀释的二抗，在室温避光孵育 1 小时。 
		注意：从这一步开始，需将样品避光保存，以防止荧光染料褪色。</li>
		<li>用1×DPBS洗涤各孔3次，每次5分钟，最后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）对细胞核进行复染，并使用荧光封片剂封片。DAPI可按照试剂生产商说明书单独使用，或直接包含在封片剂中。将圆形盖玻片（直径分别为19 mm和13 mm，用于12孔板和24孔板）放入各孔中。根据所用封片剂的生产商说明书进行封片样本的干燥与保存。</li>
		<li>使用荧光显微镜对染色后的细胞进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>定量免疫荧光分析
	<ol>
		<li>在载玻片上制备由人多能干细胞（hPSC）衍生的角膜上皮样细胞（LESCs）的细胞离心涂片样本。
		<ol>
			<li>使用无异源性胰蛋白酶-EDTA 按照步骤 2.4.2 的说明解离 hPSC 来源的角膜缘上皮干细胞，并对细胞进行计数。</li>
			<li>计数后，加入预冷的1×DPBS，于300 × g离心5分钟。根据所用细胞离心机制造商的说明，调整样品体积和细胞浓度。 例如 样本体积为 150 µL 时，细胞数量为 50,000 – 100,000 个。</li>
			<li>使用细胞离心机将细胞离心至载玻片上 例如 28 × g 离心 5 分钟，随后在室温下用 4% 多聚甲醛（PFA）溶于 1× DPBS 中固定 15–20 分钟。推荐的离心时间和转速请参考所用细胞离心机的说明书。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>按照步骤3.1.3–3.1.8所述方法对细胞离心涂片样本进行染色。使用液体阻断笔在样本周围画出疏水圈，以滴染方式染色，节约试剂。洗涤步骤可在配有载玻片架的容器中进行，以确保充分去除多余抗体并降低背景染色。用DAPI复染细胞核，使用荧光封片剂将染色后的样本封片，加盖盖玻片。根据制造商说明对封片后的样本进行干燥和保存。</li>
		<li>每个样本随机选择5–10个位置拍摄图像 例如 荧光显微镜10倍放大</li>
		<li>根据总细胞数（DAPI阳性细胞）估算阳性染色细胞所占的百分比， 例如 使用 ImageJ 图像处理与分析软件（https://imagej.nih.gov/ij/）工具进行分析。建议分析 &#62;每份样本500个细胞。
		<ol>
			<li>在 ImageJ 软件中打开待分析的图像。复制该图像，并使用默认高斯模糊滤波以去除噪声。</li>
			<li>创建阈值。调整阈值参数以最优选择呈阳性染色的细胞核，然后应用。复制的图像现已转换为二值图像。</li>
			<li>使用二值化处理工具“填充孔洞”和“分水岭”处理二值图像，可自动分离代表单个细胞核的合并区域。</li>
			<li>使用“分析颗粒”工具可自动将感兴趣区域（ROIs）列表添加到应用命令后弹出的 ROI 管理器窗口中。关闭二值图像。</li>
			<li>在 ROI Manager 中选择“显示全部”以在原始图像中可视化 ROI。确认染色的细胞核被正确选中，如有需要，可手动删除或添加单个选区。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>流式细胞术分析
	<ol>
		<li>为确认 p63α 表达水平，对细胞进行流式细胞术染色。
		<ol>
			<li>使用无异源性胰蛋白酶-EDTA 按照步骤 2.4.2 中的说明解离 hPSC 来源的角膜缘上皮干细胞，并进行细胞计数。</li>
			<li>用1 mL预冷的1×DPBS洗涤细胞两次，300 × g离心5分钟。加入现用型固定/透化溶液，4 °C固定和透化20分钟。随后用1 mL预冷的1×透化洗涤缓冲液洗涤细胞两次。 
			注意：从这一步开始，除非另有说明，始终将细胞置于 4 °C 或冰上。</li>
			<li>警告：固定/透化溶液含有4.2%甲醛。操作该危险溶液时应在通风橱中进行，并穿戴防护服、护目镜和手套。</li>
			<li>将样品分装至5 mL聚丙烯管中。每份样品应含有100,000–200,000个细胞，并将样品体积用1×洗涤缓冲液调整至约100 µL。</li>
			<li>向样本管中加入 2 µL 荧光染料标记的 p63-α FACS 抗体（推荐抗体见设备与材料表）。留一份样本不加染色，作为阴性对照。涡旋混匀样本，并在室温避光孵育 1 小时。</li>
			<li>用1 mL预冷的1×洗涤缓冲液洗涤细胞两次，最后用300 µL缓冲液重悬细胞沉淀。将离心管置于冰上，避光保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用流式细胞仪分析样本。利用未染色的阴性对照样本进行设门，以确定正确的细胞群，并排除荧光背景信号。至少分析10,000个p63-α染色的细胞。有关详细的技术操作，请参阅所用流式细胞仪的用户手册。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Susaimanickam, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+minicorneal+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案预期结果是在约3.5周内，从单细胞悬浮状态的游离培养人多能干细胞（FF hPSC）成功且稳定地生成角膜缘上皮干细胞（LESC）。由于角膜上皮起源于表面外胚层29，本方案的第一步旨在引导hPSC向该谱系分化。通过使用转化生长因子β（TGF-β）拮抗剂SB-505124和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）进行为期24小时的短期诱导，启动外胚层分化，随后加入中胚层信号分子BMP-4作用48小时，以推动细胞向表面外胚层方向发展。接下来，在IV型胶原蛋白/层粘连蛋白521（col IV/LN-521）组合基质上进行贴壁分化，并结合化学成分明确的分化培养基，进一步引导细胞向LESC分化。
起始材料（即饲养层依赖型人多能干细胞，FF hPSCs）的质量对于成功分化至关重要。应使用接近汇合且未分化表型比例接近100%的FF hPSC培养物。建议定期对hPSC进行核型分析，因为单细胞传代可能使hPSC易于发生核型异常，从而获得生长和分化的竞争优势30。长时间暴露于胰蛋白酶可能导致胚胎体（EB）形成不...

眼球表面透明的角膜允许光线进入视网膜，并提供眼睛大部分的屈光力。最外层为分层的角膜上皮，由角膜缘上皮干细胞（LESCs）持续再生。LESCs 位于角膜缘生理性微环境基底层的角膜巩膜交界处1,2。LESCs 缺乏特异且唯一的标志物，因此其鉴定需要对一组假定标志物进行更广泛的分析。上皮转录因子 p63，尤其是 p63 α 亚型的 N 端截短转录本（ΔNp63α），已被提出作为重要的阳性 LESC 标志物3,4。LESCs 的不对称分裂使其能够自我更新，同时产生子代细胞，这些子代细胞向心性并向前迁移。当细胞向角膜表面移动时，逐渐失去干细胞特性，最终分化为表层的扁平鳞状细胞，并持续从角膜表面脱落。
角膜各层的损伤均可能导致严重的视力障碍，因此角膜缺陷是全球范围内视力丧失的主要原因之一。在角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）中，角膜缘因疾病或外伤遭到破坏，导致结膜化和角膜表面混浊，进而造成视力丧失5,6。利用自体或异体角膜缘移植物进行细胞替代治疗，为LSCD患者提供了一种治疗策略4,7,8,9。然而，获取自体移植物可能对健康眼带来并发症风险，且供体组织严重短缺。人类多能干细胞（hPSCs），特别是人类胚胎干细胞（hESCs）和人类诱导多能干细胞（hiPSCs），可作为临床相关细胞类型的无限来源，包括角膜上皮细胞。因此，由hPSCs衍生的角膜缘上皮干细胞（hPSC-LESCs）成为眼科细胞替代治疗的一种极具吸引力的新型细胞来源。
传统上，未分化 hPSC 的培养方法及其向角膜缘上皮细胞（LESCs）分化的方案均依赖于成分未定义的饲养层细胞、动物血清、条件培养基或羊膜10,11,12,13,14,15。近年来，出于对更安全细胞治疗产品的追求，研究人员开始致力于开发更加标准化且无异源成分的培养与分化方案。因此，目前已有多种成分明确且无异源成分的未分化 hPSC 长期培养方法实现商业化16,17,18。作为进一步发展，近年来已出现一系列基于分子信号引导 hPSC 向角膜上皮细胞命运定向分化的方案19,20,21,22,23。然而，这些方案中的许多仍以成分未定义的、依赖饲养层的 hPSC 作为起始材料，或在分化过程中使用复杂的异源性生长因子混合物。
本实验方案旨在提供一种稳健、优化、无异源成分且无需饲养层的hPSC培养方法，并进一步将其分化为角膜缘上皮干细胞（LESC）。在确定的无白蛋白hPSC培养基（特别是Essential 8 Flex）中，将多能hPSC以单层形式培养于层粘连蛋白-521（LN-521）基质上，可快速获得均一的分化起始材料。随后，采用一种简单的两步分化策略：首先在悬浮培养中引导hPSC向表皮外胚层命运分化，继而在贴壁条件下进一步分化为LESC。在24天内即可获得ΔNp63α表达率&#62; 65%的细胞群体。该无异源成分且无需饲养层的方案已应用于多种hPSC细胞系（包括hESC和hiPSC），无需针对不同细胞系进行特定优化。本文所述的无需周末维护的培养、传代、冻存以及hPSC-LESC表型鉴定方案，可实现高质量LESC的大规模制备，适用于临床或科研用途。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;材料/试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>#14040-091</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca 的 1x DPBS&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;+ 和 Mg&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;+</td><td>Lonza</td><td>#17-512F/12</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 细胞培养皿</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3296</td><td>用于贴壁hPSC-LESC分化的培养容器格式</td></tr><tr><td>12孔板</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3336</td><td>IF 样品培养容器格式</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Corning CellBIND</td><td>#3337</td><td>用于免疫荧光样品的培养容器规格</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>#31350-010</td><td></td></tr><tr><td>6孔板，超低吸附</td><td>Corning Costar</td><td>#3471</td><td>悬浮培养中诱导的培养容器格式</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗小鼠 Ig</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#A-21202</td><td>免疫荧光二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗兔 Ig</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#A-21206</td><td>免疫荧光二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 抗山羊Ig</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#A-11057</td><td>免疫荧光二抗</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 抗小鼠 Ig</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#A-10037</td><td>免疫荧光二抗</td></tr><tr><td>碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，人）</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#AF-100-18B</td><td>无动物源性重组人碱性成纤维细胞生长因子（154个氨基酸）</td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm 固定/破膜溶液</td><td>BD 生物科学</td><td>#554722</td><td>流式细胞术固定与透化溶液</td></tr><tr><td>BD 固定/洗涤缓冲液</td><td>BD 生物科学</td><td>#554723</td><td>流式细胞术洗涤缓冲液</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#B0560</td><td></td></tr><tr><td>骨形态发生蛋白4（BMP-4）</td><td>PeproTech Inc.</td><td>#120-05A</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#A8022-100G</td><td></td></tr><tr><td>细胞角蛋白12抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>#SC-17099</td><td>免疫荧光一抗</td></tr><tr><td>细胞角蛋白14抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>#MAB3164</td><td>免疫荧光一抗</td></tr><tr><td>细胞角蛋白15抗体</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#MS-1068-P</td><td>免疫荧光一抗</td></tr><tr><td>CnT-30</td><td>CELLnTEC Advanced Cell Systems AG</td><td>#Cnt-30</td><td>用于贴壁hPSC-LESC分化的培养基</td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白（人源）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C5533</td><td>人胎盘 IV 型胶原蛋白</td></tr><tr><td>CoolCell LX 冷冻容器</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#BCS-405</td><td></td></tr><tr><td>CryoPure 管</td><td>Sarstedt</td><td>#72.380</td><td>用于hPSC-LESC冷冻保存的1.6 mL冻存管</td></tr><tr><td>定义明确的胰蛋白酶抑制剂</td><td>Gibco</td><td>#R-007-100</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Flex 培养基试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#A2858501</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>#35050061</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白521</td><td>生物基质</td><td>#Ln521</td><td>人重组层粘连蛋白521</td></tr><tr><td>&amp;Delta;Np63&amp;alpha; 抗体</td><td>BioCare Medical</td><td>#4892</td><td>免疫荧光一抗</td></tr><tr><td>OCT3/4 抗体</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>#AF1759</td><td>免疫荧光一抗</td></tr><tr><td>p63&amp;alpha; 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#ACI3066A</td><td>免疫荧光一抗</td></tr><tr><td>p63-&amp;alpha; (D2K8X) XP兔单克隆抗体（PE偶联物）</td><td>细胞信号技术公司</td><td>#56687</td><td>p63-&amp;alpha; 用于流式细胞术的PE偶联抗体</td></tr><tr><td>PAX6 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HPA030775</td><td>免疫荧光一抗</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Lonza</td><td>#17-602E</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#158127</td><td>免疫荧光用细胞固定剂</td></tr><tr><td>含DAPI的ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#P36931</td><td>用于免疫荧光的DAPI封片剂（硬封片）</td></tr><tr><td>PSC 冷冻保存试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#A2644601</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 酶</td><td>Gibco</td><td>#12563-011</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut DMEM&amp;rsquo;s 改良的 Eagle&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Gibco</td><td>#10829018</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut SR XenoFree CTS</td><td>Gibco</td><td>#10828028</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸</td><td>Gibco</td><td>#11140050</td><td></td></tr><tr><td>SB-505124</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#S4696</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T8787</td><td>免疫荧光通透剂</td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>#H-1200</td><td>用于免疫荧光的 DAPI 封片液</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞离心机 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; CellSpin II</td><td>Tharmac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪&lt;em&gt; 例如&lt;/em&gt; BD Accuri C6</td><td>BD 生物科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜 &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;奥林巴斯 IX 51</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高效且可扩展的临床兼容性角膜缘上皮干细胞从人多能干细胞的定向分化

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

角膜缘上皮干细胞（LESCs）负责持续更新角膜上皮，从而维持角膜稳态和视觉清晰度。由人多能干细胞（hPSC）衍生的LESC为角膜细胞替代疗法提供了有前景的细胞来源。未定义的、异种来源的培养和分化条件会导致研究结果的变异，并阻碍hPSC衍生治疗产品的临床转化。本方案提供了一种在无异种成分且无饲养层细胞的条件下，可重复且高效地实现hPSC向LESC分化的技术方法。首先，将未分化的hPSC在重组层粘连蛋白-521（LN-521）上以单层形式培养于成分明确的hPSC培养基中，为后续分化提供高质量、稳定的起始材料。其次，采用一种快速且简便的hPSC-LESC分化方法，仅需24天即可获得LESC细胞群体。该方法包括使用小分子在悬浮条件下进行为期四天的表面外胚层诱导，随后在成分明确的角膜上皮分化培养基中，于LN-521/IV型胶原组合基质上进行贴壁培养。通过冷冻保存和延长分化过程，可进一步纯化细胞群体，并实现细胞的大规模储存，以满足细胞治疗产品的需求。所获得的高质量hPSC-LESC为治疗角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）所致的角膜表面重建提供了潜在的全新治疗策略。

从人多能干细胞到人多能干细胞来源的角膜缘上皮干细胞
从诱导FF hPSCs分化到冻存hPSC-LESCs的整个过程大约需要3.5周。该分化方法的关键步骤示意图如下所示 图1A. 图1B 展示了不同实验阶段细胞群体的典型形态。所展示的数据来自Regea08/017 hESC细胞系和UTA.04607.WT hiPSC细胞系，这两种细胞系均由芬兰坦佩雷大学建立并完成表征，具体方法如前所述。26,27,28.
在含hPSC培养基的LN-521...

本方案介绍了一种在无异种成分且无饲养层细胞的培养条件下，将人多能干细胞分化为角膜缘上皮干细胞的简单两步法。此处提供的细胞培养方法能够以较低成本大规模生产具有临床质量的细胞，适用于角膜细胞治疗。

角膜缘上皮干细胞（LESCs）负责持续更新角膜上皮，从而维持角膜稳态

本方案介绍了一种无明确定义饲养层细胞的方法，用于将人多能干细胞分化为角膜缘上皮干细胞。在健康眼球中，角膜缘上皮干细胞负责更新角膜上皮细胞。这些细胞受损会导致一种称为角膜缘干细胞缺乏症的疾病，并引起角膜透明度丧失。此处展示的细胞培养方法可高效生成角膜缘上皮干细胞，用于未来的角膜细胞替代治疗。首先，按照文本方案中所述的方法传代并维持无饲养层的人多能干细胞培养。务必使用高质量的人多能干细胞作为分化的起始材料。准备诱导拟胚体形成时，将所有所需材料和试剂在超净工作台中恢复至室温。通过向每孔加入500微升无异源胰蛋白酶EDTA，使无饲养层的人多能干细胞脱离并形成悬浮液。在37摄氏度、5%CO2条件下孵育。三分钟后，将细胞从培养箱中取出，检查细胞形态，以确定胰蛋白酶去除的最佳时机。仔细观察细胞，在细胞变圆但尚未完全脱落时，即为去除无异源胰蛋白酶EDTA的最佳时间点。在此最佳时间点，将无异源胰蛋白酶EDTA从细胞中移除。加入确定浓度的胰蛋白酶抑制剂，轻轻吹打使细胞脱落。将单细胞悬液收集至50毫升离心管中。以300g离心5分钟。然后，去除上清液，并将细胞重悬于1毫升培养基中。细胞计数后，将两百万至三百万个细胞加入三毫升基础诱导培养基中，该培养基含有5 µM的blebbistatin，并接种至低吸附六孔板的每个孔中。于37°C、5% CO₂条件下过夜培养。第二天，在显微镜下检查类胚体的质量。移除培养基，并更换为3毫升基础诱导培养基，其中添加10微摩尔SB-505124和50纳克/毫升人碱性成纤维细胞生长因子。继续在37摄氏度、5%CO2条件下培养。接下来两天，移除培养基，并更换为三毫升基础诱导培养基，其中添加 25 纳克/毫升的骨形态发生蛋白 4。然后，在先前相同的条件下继续培养。第 4 天，用 DPBS（含钙离子和镁离子）稀释，制备每平方厘米 0.5 微克的层粘连蛋白-521 和每平方厘米 5 微克的人胎盘 IV 型胶原蛋白的混合溶液。使用该混合液，以每皿五毫升的总包被体积对100毫米组织培养皿进行包被，用于贴壁分化。密封培养皿，并在4摄氏度下保存过夜。第五天，在超净工作台中将所有所需材料和试剂升温至室温。此后，移除包被溶液，并向每皿中加入 10 毫升预热的分化培养基。使用移液器将单个培养板孔中的类胚体转移至两到三个组织培养皿中。然后轻轻振荡每个培养皿，使类胚体均匀分布。接下来的两到三周内，在37摄氏度、5%CO2条件下将细胞维持在贴壁培养状态，每周更换三次培养基，每次加入10毫升新鲜的分化培养基。使用相差显微镜定期观察细胞，检查是否出现正确的上皮细胞形态。首先，在超净工作台中将所有所需材料和试剂预温至室温，但冷冻保存培养基应预先冷却。接下来，通过加入无异源成分的胰蛋白酶EDTA，并在37摄氏度、5% CO2条件下孵育，将人多能干细胞来源的角膜缘上皮干细胞解离为单细胞悬液。五分钟后，从培养箱中取出细胞，观察细胞形态，以确定去除胰蛋白酶的最佳时机。仔细观察细胞，当细胞变圆但尚未完全脱落时，即为去除无异源成分胰蛋白酶EDTA的最佳时间点。在最佳时间点，从细胞中移除无异源物的胰蛋白酶EDTA，并按照前述方法使细胞脱离。计数细胞后，以300g离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于预冷的无异源物冷冻保存培养基中。使用移液器将单细胞悬液转移至冻存管中，每管含有500,000至100万个细胞，溶液体积为1毫升冻存培养基。将冻存管放入冻存盒中，并在5分钟内转移至-80摄氏度的冰箱中过夜保存。第二天，将试管转移至液氮中进行长期保存。在解冻细胞之前，用每平方厘米5微克的人胎盘IV型胶原蛋白和每平方厘米0.5微克的LM-521的混合物包被所有需要的培养皿和孔板孔，同时在超净工作台中将所有所需材料和试剂预热至室温。接着，从培养皿和孔板孔中移除包被液，并加入适量预热的分化培养基。将预热的分化培养基加入15毫升锥形管中。将细胞快速解冻至室温。解冻后，立即把细胞悬液转移至锥形离心管中。在300 × g条件下离心5分钟。吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于分化培养基中，以去除任何冷冻保存液。将细胞以每平方厘米40,000至50,000个细胞的密度接种至预先包被的培养皿中，加入分化培养基进行培养。将细胞在 37 摄氏度、5% CO2 条件下培养，每周更换三次分化培养基。在 Laminin-521 上，未分化的高质量无饲养层人多能干细胞首先形成边界清晰的独立克隆，随着融合逐渐发展为均一的单层细胞。在基础诱导培养基中培养，并添加 5 微摩尔的 blebbistatin 培养 24 小时，通常可形成大小不一但结构紧密、形态规则的拟胚体悬浮物；而在悬浮状态下进行表面外胚层诱导期间，拟胚体的形态不应发生显著变化。当将拟胚体接种至含 IV 型胶原和 Laminin-521 组合基质的分化培养基中后，很快即可观察到克隆样外延生长。分化21至25天后，细胞形成典型的上皮细胞样多边形形态的融合均一单层。这些细胞可冷冻保存以供后续使用，因为冻存后细胞的活力和形态均能得到良好维持。在分化第24天，绝大多数细胞表达眼部发育关键调控因子配对盒蛋白PAX6以及广泛认可的角膜缘上皮干细胞标志物p63α。在大多数p63α阳性细胞中可共同表达Delta Np63，证实了最具角膜特异性的Delta Np63α阳性细胞表型。部分其他标志物有表达，而另一些在此阶段则无法检测到，表明分化已向单能性角膜缘上皮前体细胞方向进展，但尚未发生向成熟角膜上皮细胞的终末分化。平均而言，每个未分化的无饲养层人多能干细胞在第25天时可产生0.7个细胞。到第24天时，预计至少有65%的细胞群体呈delta Np63 alpha阳性。冻存过程可进一步纯化细胞群体。总体而言，本文所述方法相对简单，但有几个关键点对成功至关重要。起始材料的高质量至关重要，同时通常还需要轻柔、流畅的细胞培养技术。本方案提供了可靠的手段，可用于临床应用以及各种研究目的的角膜缘上皮干细胞的制备。此外，该方法还可经简单修改，用于视网膜色素上皮细胞的分化。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

高效可扩展的人多潜能干细胞临床相容角膜缘上皮干细胞的定向分化

由干细胞衍生的视网膜色素上皮（RPE）细胞可用于多种应用，包括针对视网膜变性的细胞治疗、疾病建模以及药物研究。本文介绍一种简单且可重复地从干细胞分化获得RPE细胞的实验方案。...

高效诱导干细胞分化为视网膜色素上皮细胞

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人胚胎干细胞或诱导性多能干细胞向视网膜色素上皮细胞的快速定向分化

关键词：视网膜色素上皮细胞，人胚胎干细胞，诱导性多能干细胞，定向分化，干细胞分化，眼发育，细胞治疗

本方案详细描述了一种单层、无血清的方法，可在18天内高效地将人多能干细胞（hPSCs）诱导生成肝细胞样细胞。该过程包括六个阶段，hPSCs...

高效分化人多能干细胞为肝细胞

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利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化

采用自组织方法，我们开发了一种通过添加COCO显著提高感光细胞生成的方案。...

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人多能干细胞向造血内皮细胞的定向分化

本文介绍了一种优化的视网膜类器官诱导系统，该系统适用于多种人类多能干细胞系，可高效且高重复性地生成视网膜组织。...

人多能干细胞衍生三维视网膜组织的视网膜类器官诱导系统

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角膜缘微环境细胞的分离与鉴定

本文介绍一种通过胶原酶A和胰蛋白酶序贯消化从小鼠完整角膜获取高质量单细胞悬液的实验方案。该方法获得的单细胞具有较高的RNA完整性和活性，适用于单细胞RNA测序和流式细胞术等下游应用。y.

从小鼠角膜获取单细胞悬液的实验方案

学习无饲养层细胞培养技术，将人多潜能干细胞高效分化为角膜缘上皮干细胞。该方法支持大规模生产临床级细胞，用于角膜细胞替代治疗，推动再生医学发展。

高效且可扩展的临床兼容性角膜缘上皮干细胞从人多能干细胞的定向分化

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