Name: 改进杆状病毒表达载体生产昆虫细胞分泌植物蛋白 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学习利用昆虫细胞和杆状病毒表达系统生产植物分泌蛋白的方法，通过改进载体实现低成本大规模重组蛋白制备。该技术为结构生物学研究中的蛋白质结晶和冷冻电镜分析提供高质量样品。

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本工作获得了北卡罗来纳州立大学为 Guozhou Xu 提供的新进教师启动资金的支持。

注意：采用带有修饰表达载体的昆虫细胞/杆状病毒系统，用于分泌性植物蛋白的表达与结晶。
1. 利用GP67信号肽修饰杆状病毒表达载体以实现植物蛋白分泌表达
<ol>
	<li>合成一个包含5'端BglII酶切位点13、GP67分泌信号序列以及带有NotI、BamHI、EcoRI、StuI、SalI、SpeI、XbaI、PstI和XhoI的多克隆位点的DNA片段（图1A）。 
	注意：由于BglII和BamHI消化后的DNA产生相同的黏性末端，线性化载体可与消化后的DNA片段连接，而在连接后形成的序列中，BglII和BamHI位点均会突变为不能被BglII或BamHI切割的序列14。</li>
	<li>用BglII和XhoI酶切4 µg DNA，同时用BamHI和XhoI酶切4 µg表达载体DNA14。将每种限制性内切酶各10单位与DNA混合于1×浓度的反应缓冲液（50 mM醋酸钾、20 mM Tris-醋酸盐、10 mM醋酸镁和100 µg/mL BSA，pH 7.9，25 °C）中，于37 °C孵育4小时。
	<ol>
		<li>使用DNA凝胶回收试剂盒纯化切除的DNA片段和线性化载体DNA15。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在10 µL连接反应体系中，将100 ng线性化载体DNA与400 ng酶切后的DNA片段混合，体系包含1× T4 DNA连接酶反应缓冲液（50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM ATP和10 mM DTT，pH 7.5，25 °C）及5单位T4 DNA连接酶。将反应体系于16 °C孵育16小时。</li>
	<li>取5 µL连接产物，按照标准转化流程转入100 µL DH5α感受态细胞中，并在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选转化菌落16。挑取5–10个单菌落，分别接种于2 mL含100 µg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，在摇床培养箱中以220 rpm、37 °C振荡培养16小时。</li>
	<li>使用质粒DNA小提试剂盒提取各菌落的质粒DNA17，并使用引物AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG进行DNA测序以确认克隆正确性。</li>
	<li>以合成的TDR基因构建体为模板，通过PCR扩增拟南芥（A. thaliana）TDR基因编码第30–642位氨基酸的片段（正向引物：CATG GCGGCCGC CTCAAGTTTTCACCTCAACTCTTGTC，反向引物：GC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG ACCGTCTATATCTGCATTTCCGGC）。在含有0.5 mM dNTP混合物、0.2 µM引物、0.1 µg模板DNA、0.4 mM MgCl2和1单位DNA聚合酶的DNA聚合酶反应缓冲液中，进行30个循环的扩增。
	<ol>
		<li>PCR循环程序设置如下：95 °C预变性30秒；随后进行30个循环，每个循环包括95 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸1分钟；最后在72 °C延伸5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用NotI和BamHI限制性内切酶对PCR产物片段和修饰后的载体进行双酶切。将基因片段与线性化载体连接：在10 µL连接反应体系中，混合100 ng线性化载体DNA与400 ng酶切后的DNA片段，体系包含T4 DNA连接酶反应缓冲液和5单位T4 DNA连接酶。将反应体系于16 °C孵育16小时。</li>
	<li>取5 µL连接产物，按照标准转化流程转入100 µL DH5α感受态细胞中，并在含氨苄青霉素的LB琼脂平板上筛选转化菌落16。通过DNA测序确认正确克隆。</li>
</ol>
2. 利用昆虫Hemolin信号肽修饰杆状病毒表达载体以实现植物蛋白的分泌表达
<ol>
	<li>合成一个包含5'端BglII酶切位点13、昆虫hemolin分泌信号序列以及带有NotI、BamHI、EcoRI、StuI、SalI、SpeI、XbaI、PstI和XhoI的多克隆位点的DNA片段（图1B）。</li>
	<li>用BglII和XhoI酶切4 µg的DNA，同时用BamHI和XhoI酶切4 µg的表达载体DNA14。将每种限制性内切酶各10单位与DNA混合于1x浓度的反应缓冲液（50 mM醋酸钾、20 mM Tris-醋酸盐、10 mM醋酸镁和100 µg/mL BSA，pH 7.9，25 °C）中，并在37 °C下孵育4小时。
	<ol>
		<li>使用DNA凝胶回收试剂盒15纯化切除的DNA片段和线性化载体DNA。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将100 ng线性化载体DNA与400 ng酶切后的DNA片段混合于10 µL连接反应体系中，体系包含1x T4 DNA连接酶反应缓冲液（50 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、1 mM ATP和10 mM DTT，pH 7.5，25 °C）及5单位T4 DNA连接酶。将反应体系在16 °C下孵育16小时。</li>
	<li>取5 µL连接产物转化至100 µL DH5α感受态细胞中，并在氨苄青霉素-LB琼脂平板上筛选菌落。挑取5–10个单菌落，分别接种于含100 µg/mL氨苄青霉素的2 mL LB培养基中，在摇床培养箱中以220 rpm、37 °C振荡培养16小时。</li>
	<li>使用质粒DNA小提试剂盒17提取质粒DNA，并使用引物AGTATTTTACTGTTTTCGTAACAG通过DNA测序验证克隆。</li>
	<li>以合成的PRK3基因构建体为模板，通过PCR扩增拟南芥（A. thaliana）花粉受体激酶3（PRK3）基因编码第20–237位氨基酸的片段（正向引物：CATG GCGGCCGC CTACAAAACGTTAGTGAATCGGAACC，反向引物：CGC GGATCC CTA GTG GTG ATG GTG GTG GTG TGAAGGTTTCTCATCGCATTCTATATTC）。在含有0.5 mM dNTP混合物、0.2 µM引物、0.1 µg模板DNA、0.4 mM MgCl2和1单位DNA聚合酶的反应缓冲液中进行30个循环的扩增。
	<ol>
		<li>PCR循环程序设置如下：初始变性95 °C 30秒；随后进行30个循环，每个循环包括95 °C变性30秒、55 °C退火30秒、72 °C延伸30秒；最后72 °C延伸5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用NotI和BamHI限制性内切酶对PCR产物片段和修饰后的载体进行双酶切。将基因片段与线性化载体连接：将100 ng线性化载体DNA与400 ng酶切后的DNA片段混合于10 µL连接反应体系中，体系包含T4 DNA连接酶反应缓冲液和5单位T4 DNA连接酶。将反应体系在16 °C下孵育16小时。</li>
	<li>取5 µL连接产物，按照标准转化流程将其转化至100 µL DH5α感受态细胞中，并在氨苄青霉素-LB琼脂平板上筛选转化子16。通过DNA测序确认正确克隆。</li>
</ol>
3. 含重组蛋白表达盒的杆状病毒构建体的制备与扩增
<ol>
	<li>按照杆状病毒表达系统方案1，使用100 ng构建质粒转化40 µL DH10Bac感受态细胞。将转化后的平板在37 °C培养48 h。</li>
	<li>从每个转化平板上挑取两个白色菌落，分别接种至含有50 µg/mL卡那霉素、7 µg/mL庆大霉素和10 µg/mL四环素的2 mL LB培养基中。按照杆状病毒表达系统方案1提取并验证杆粒DNA。将每份DNA分装至两管中，每管20 µL，并于-20 °C保存。 
	注意：以下步骤需进行无菌操作。</li>
	<li>在6孔板中，于27 °C使用含10%胎牛血清（FBS）和100 µg/mL（或100 I.U./mL）青霉素-链霉素抗生素的培养基培养Sf9细胞至80%汇合度。根据组织培养板上覆盖面积的百分比估算细胞汇合度。</li>
	<li>在两个无菌的1.5 mL离心管中分别配制以下溶液。
	<ol>
		<li>管1：每次转染时，将20 µL杆粒DNA加入100 µL不含抗生素的Sf9细胞基础培养基中。通过轻弹管壁轻轻混匀。</li>
		<li>管2：每次转染时，将8 µL脂质转染试剂加入100 µL不含抗生素的Sf9细胞基础培养基中。通过上下吹打6次充分混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将上述两种溶液混合，缓慢上下吹打3次以轻柔混匀，室温孵育20–40分钟。</li>
	<li>用3 mL不含抗生素的Sf9细胞基础培养基将Sf9单层细胞每孔洗涤2次。每次转染时，向含有脂质-DNA混合物的各管中加入0.8 mL不含抗生素的Sf9细胞基础培养基。缓慢上下吹打3次以轻柔混匀管内液体。吸除孔中洗涤液，将转染混合物覆盖于细胞上。</li>
	<li>加入转染混合物后，将转染板于27 °C孵育5小时。随后弃去转染液，更换为含10% FBS和100 µg/mL（或100 I.U./mL）青霉素-链霉素抗生素的完全Sf9细胞培养基。将转染板于27 °C继续孵育4天。</li>
	<li>收集并扩增重组杆状病毒。
	<ol>
		<li>孵育4天后，将感染后的培养板上清液收集至无菌15 mL锥形管中。在1010 × g离心5分钟以去除细胞碎片。弃去沉淀，将上清液转移至洁净管中，4 °C保存可长达1年。 
		注意：此为P0代病毒。可分装后于-80 °C长期保存。</li>
		<li>为扩增每种重组病毒，在150 mm培养皿中培养Sf9细胞至80%汇合度。吸除培养基，向贴壁细胞中加入2 mL P0代病毒，于27 °C培养箱中孵育1小时。每隔15分钟轻轻摇动培养皿以混匀培养基与细胞。
		<ol>
			<li>加入含10% FBS和100 µg/mL（或100 I.U./mL）青霉素-链霉素抗生素的25 mL完全Grace's培养基。于27 °C培养箱中继续孵育3天，获得P1代病毒。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将感染后的培养板上清液收集至无菌50 mL锥形管中，在1010 × g离心5分钟以去除细胞碎片。将上清液转移至洁净管中，4 °C保存可长达1年。 
		注意：P1代病毒可分装后于-80 °C长期保存。</li>
		<li>为将病毒从P1代扩增至P2代，在150 mm培养皿中培养Sf9细胞至90%汇合度，吸除培养基，向培养皿中加入2 mL P1代病毒，于27 °C培养箱中孵育1小时。</li>
		<li>重复步骤3.8.2和3.8.3以获得P2和P3代病毒。P3代病毒保存时间不得超过2个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 蛋白质表达、NiNTA 纯化及结晶
<ol>
	<li>在含有100 µg/mL（或100 I.U./mL）青霉素-链霉素抗生素的培养基中，于27 °C、100 rpm的摇床培养箱中培养1 L Hi5昆虫细胞，使其密度达到2 × 106。在570 × g条件下离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于20 mL新制备的P3病毒液中，室温静置1小时。每15分钟轻轻摇动旋转瓶一次，使细胞充分重悬。</li>
	<li>将细胞转移至含有100 µg/mL（或100 I.U./mL）青霉素-链霉素抗生素的1 L新鲜培养基中，在27 °C、100 rpm的摇床培养箱中继续培养72小时。在1,010 × g条件下离心5分钟，收集上清液。</li>
	<li>使用pH指示试纸，通过添加0.1 M HCl或0.1 M NaOH将上清液的pH调节至8.0，并加入结合缓冲液至终浓度为20 mM Tris缓冲液（pH 8.0）、100 mM NaCl和5 mM咪唑。根据表达的His标签重组蛋白的预估产量，加入适量的NiNTA树脂（10–40 mL）。
	<ol>
		<li>在4 °C下以低速磁力搅拌混合溶液1小时。按照标准NiNTA纯化方案18对树脂进行洗涤并洗脱结合的蛋白。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对纯化后的蛋白进行离子交换层析和凝胶过滤层析，以及其他蛋白纯化方法，以获得均一的样品。 
	注意：对于TDR胞外域，使用20 mM Tris（pH 8）、100 mM NaCl作为凝胶过滤缓冲液；对于PRK3胞外域，推荐使用20 mM bis-Tris（pH 6）、100 mM NaCl作为凝胶过滤缓冲液。</li>
</ol>

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<li>Dohi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+virus-mediated+expression+of+a+foreign+protein+in+suspension-cultured+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Inducible virus-mediated expression of a foreign protein in suspension-cultured plant cells.</a> Archives of Virology. 151, 1075-1084 (2006).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

鉴于生物系统中数千种蛋白质在大小和稳定性方面存在多样性，研究实验室通常需要凭经验决定选择哪种异源表达系统来表达特定蛋白质。E. coli 表达系统由于细菌生命周期短、培养基成本低以及易于放大生产，常常是蛋白质表达的首选19。然而，在表达分子量超过 60 kDa 的大型真核蛋白时，使用 E. coli 系统常常会导致蛋白质在包涵体中形成不溶性沉淀或发生聚集20。对于这类难表达蛋白以及其他分泌型蛋白的表达，杆状病毒-昆虫细胞表达系统可能比 E. coli 系统更具优势。特别是在表达分泌型真核蛋白时，这种改良的杆状病毒-昆虫细胞表达系统可能是更优的选择。
许多分泌型真核生物蛋白，包括植物分泌蛋白，在蛋白质折叠和分泌过程中需要复杂的糖基化、二硫键形成以及其他翻译后修饰21。E. coli系统缺乏加工许多真核蛋白所需复杂修饰的细胞机制22</s...

一个研究实验室必须具备生产大量均一重组蛋白的能力，以进行生物化学和生物物理表征，尤其是X射线晶体学研究。目前已有多种成熟的异源表达系统，例如 大肠杆菌酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物细胞 等等。 其中，杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统是用于蛋白质结晶、生产大量结构正确折叠的大型重组真核蛋白的最常用技术之一1.
杆状病毒表达系统的表达载体经过改造，含有强效的多角体蛋白或P10启动子，以实现重组胞内蛋白的高产量表达2,3。为了构建重组杆状病毒，将目的基因克隆至含有苜蓿银纹夜蛾多核型杆状病毒（Autographa californica multi-nucleopolyhedrovirus）多角体蛋白（polh）位点的昆虫载体中。随后对所获得的构建体进行测序，并验证其正确的开放阅读框（ORF）。将正确的构建体通过转染过程导入宿主昆虫细胞中，目的基因通过同源重组插入病毒基因组。该过程导致重组病毒基因组的产生，随后复制生成重组芽生病毒颗粒1。
表达系统中最常用的昆虫细胞是Sf9细胞和High Five（Hi5）细胞。Sf9细胞是Sf21的一个克隆分离株，来源于Spodoptera frugiperda的蛹期卵巢细胞；Hi5细胞则是来源于亲本Trichoplusia ni卵巢细胞系TN-368的克隆分离株4,5。共转染、病毒扩增和空斑实验通常在Sf9细胞上进行，而Hi5细胞通常被选用于生产更高产量的重组蛋白6。值得注意的是，由于Hi5细胞容易产生突变病毒，因此不适合用于病毒子代的生成与扩增。传统上，25 - 30 °C的温度范围被认为适合昆虫细胞的培养。然而，已有报道指出，27 - 28 °C是昆虫细胞生长和感染的最适温度7,8。
在基因上游引入强信号序列是实现分泌蛋白高效表达所必需的。该信号序列可有效引导翻译后的重组蛋白进入内质网，从而进行蛋白质分泌以及正确折叠和稳定所必需的翻译后修饰3。已有研究选用多种信号肽序列，如杆状病毒包膜蛋白GP64/67、蜜蜂蜂毒肽（melittin）等，以促进杆状病毒介导表达系统中分泌型重组蛋白的表达3。研究表明，与使用目的基因自身固有的信号肽相比，引入GP67信号肽可提高分泌型重组蛋白的表达产量9。Hemolin是巨大蚕蛾Hyalophora cecropia在细菌感染后诱导产生的血淋巴蛋白10。由于其诱导表达水平相对较高，该基因的信号肽序列可用于介导重组蛋白在杆状病毒-昆虫细胞系统中的分泌表达。
A. thaliana 的导管分子分化抑制因子受体（TDR）和花粉受体激酶3（PRK3）均属于植物富含亮氨酸重复序列的类受体激酶（LRR-RLK）蛋白家族11,12。为了研究该类植物受体蛋白的结构与功能，并促进其他植物分泌蛋白的结构与生化表征，已有研究对杆状病毒-昆虫细胞表达系统进行了改造，以提高目标蛋白的质量和产量。TDR和PRK3的胞外结构域已成功利用两种改良的表达载体在杆状病毒-昆虫细胞表达系统中得以表达。TDR和PRK3蛋白的胞外结构域均获得了晶体。本文报道了通过在启动子与多克隆位点之间引入GP67或血清素（hemolin）信号序列的两种改良杆状病毒表达载体，实现大量重组植物分泌蛋白的表达与纯化。

<table><tbody><tr><td>摇床培养箱</td><td>VWR</td><td>型号 Excella E25</td><td>27 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>VWR</td><td>型号 2005</td><td>27 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C</td></tr><tr><td>离心机</td><td>BECKMAN</td><td>型号 J-6</td><td>配有摆桶转子</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA 聚合酶</td><td>Agilent</td><td>600677-51</td><td>用于 DNA 的 PCR 扩增</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>BIO-RAD</td><td>型号 C1000 Touch</td><td>用于 DNA 的 PCR 扩增</td></tr><tr><td>摇床培养箱</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>型号 I 24</td><td>用于细菌培养</td></tr><tr><td>定制 DNA 合成</td><td>GENSCRIPT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3136S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>BglII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0144S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>NotI (HF)</td><td>New England Biolabs</td><td>R3189S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>限制性内切酶</td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>DNA 连接</td></tr><tr><td>QIAquick 凝胶回收试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>从琼脂糖凝胶中纯化 DNA</td></tr><tr><td>QIAprep Spin 质粒小提试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>从细菌培养物中纯化质粒 DNA</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15510-019</td><td>用于 DNA 凝胶电泳</td></tr><tr><td>MAX Efficiency DH5&amp;alpha; 感受态细胞</td><td>Invitrogen</td><td>18-258-012</td><td>用于 DNA 连接产物的转化</td></tr><tr><td>Lennox L LB 肉汤</td><td>Research Product International Corp.</td><td>L24066-5000.0</td><td>用于制备细菌培养物</td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11593-019</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>卡那霉素硫酸盐</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15160-054</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>四环素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>64-75-5</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710-064</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>MAX Efficiency DH10Bac 感受态细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10361-012</td><td>用于制备杆状病毒 DNA（bacmid）</td></tr><tr><td>S.O.C. 培养基</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15544-034</td><td>用于 DNA 转化</td></tr><tr><td>CellFECTIN II 转染试剂</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10362-101</td><td>昆虫细胞转染试剂</td></tr><tr><td>Bac-to-Bac 表达系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10359-016</td><td>杆状病毒-昆虫细胞表达试剂盒</td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15519-028</td><td>用于重组杆状病毒 DNA（bacmid）的筛选</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15529-019</td><td>用于重组杆状病毒 DNA（bacmid）的筛选</td></tr><tr><td>pFastBac1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10360014</td><td>杆状病毒表达载体</td></tr><tr><td>Sf9 细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11496015</td><td>Sf9 单层细胞</td></tr><tr><td>Hi5 细胞</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B85502</td><td>High Five 昆虫细胞</td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s 昆虫培养基（未添加补充物）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11595030</td><td>Sf9 细胞转染基础培养基</td></tr><tr><td>Grace&amp;rsquo;s 昆虫培养基（添加补充物）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11605102</td><td>Sf9 单层细胞培养完全培养基</td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10902104</td><td>不含胎牛血清（FBS）的 Sf9 悬浮细胞培养基</td></tr><tr><td>Express Five SFM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10486025</td><td>Hi5 细胞培养基</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 ml (10,000 I.U./ml)</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>经认证的胎牛血清（FBS）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000-044</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td><td>平底</td></tr><tr><td>150 mm 培养皿</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>353025</td><td>每箱 100 个</td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1415-2500</td><td>每袋 500 支</td></tr><tr><td>15 ml 带螺帽的锥形离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1475-0511</td><td>每袋 25 支</td></tr><tr><td>50 ml 带螺帽的锥形离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1500-1211</td><td>每袋 25 支</td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td>NiNTA 树脂</td></tr><tr><td>pH 指示试纸</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>1.09535.0001</td><td>pH 0 - 14</td></tr></tbody></table>

改造杆状病毒表达载体以在昆虫细胞中产生分泌型植物蛋白

Modifying Baculovirus Expression Vectors to Produce Secreted Plant Proteins in Insect Cells

对于科学家而言，表达用于结构和生化研究的重组分泌型真核蛋白一直是一项挑战。杆状病毒介导的昆虫细胞表达系统是用于表达具有某些翻译后修饰的重组真核分泌蛋白的系统之一。分泌蛋白需要通过分泌途径进行蛋白糖基化、二硫键形成以及其他翻译后修饰。为了改进现有的分泌型植物蛋白的昆虫细胞表达，通过在启动子与多克隆位点之间插入GP67或血啉素（hemolin）信号肽序列，对杆状病毒表达载体进行了改造。这种新设计的改良载体系统成功地高效表达了拟南芥（Arabidopsis thaliana）的可溶性重组分泌植物受体蛋白。其中两种表达的植物蛋白——拟南芥TDR和PRK3质膜受体的胞外结构域——已被结晶，用于X射线晶体学研究。该改良的载体系统是一种改进的工具，未来也有望用于动物界中重组分泌蛋白的表达。

如图1所示，使用两种改造后的pFastBac1杆状病毒表达载体，分别携带GP67或血素蛋白（hemolin）信号序列，以替代目的基因固有的信号序列，从而表达分泌型蛋白。病毒GP67基因和昆虫血素蛋白（hemolin）基因已被证实可在细胞中实现高效的分泌表达。融合这两种信号序列之一的融合蛋白，预期其分泌表达水平将显著提高。这两种改造载体中设计了相同的多克隆位点（MCS）。在MCS的最5'端特意引入了NotI酶切位点，因为NotI具有八核苷酸识别序列，而大多数其他限制性酶切位点通常为六核苷酸序列。因此，与大多数其他限制性酶切位点相比，NotI位点在目的基因中出现的概率更低，从而使得对大多数目的基因进行限制性酶切和克隆操作更为可行。将目的基因克隆至NotI与下游某一限制性酶切位点之间时，仅会在目的基因上游引入三个氨基酸残基GGR。
pBac1-GP67 和 pBac1-Hem 已成功用于分别表达 <...

本文介绍了利用昆虫细胞与杆状病毒蛋白表达系统大量生产植物分泌蛋白以用于蛋白结晶的实验方案。已使用GP67或昆虫血淋巴素（hemolin）信号肽对杆状病毒表达载体进行改造，以实现植物蛋白在昆虫细胞中的分泌表达。

对于科学家而言，表达重组分泌型真核蛋白以进行结构与生化研究一直是一个挑战。

该方法有助于解答生物化学和分泌蛋白结构生物学领域的关键问题，例如通过X射线晶体学和冷冻电镜（cryo-EM）进行蛋白质结构解析。该技术的主要优势在于能够以相对较低的成本大量生产重组分泌蛋白，用于蛋白质结构解析。首先，合成一个DNA片段，该片段包含5'端BglII酶切位点、目标分泌信号序列以及文本方案中所述的多克隆位点。接下来，用 BglII 和 X1 消化 4 微克的 DNA，同时用 BamH1 和 X1 消化 4 微克的表达载体 DNA。将每种限制性内切酶各 10 单位与 DNA 混合于 1X 浓度的反应缓冲液中。在 37 摄氏度下孵育 4 小时。向一个新的 1.5 毫升离心管中加入 10 微升连接反应混合物，其中包含 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液和 5 单位的 T4 DNA 连接酶。然后，加入100纳克线性化载体DNA和400纳克经消化的DNA片段。在16摄氏度下孵育16小时。将5微升连接反应混合物转化至100微升DH5 alpha感受态细胞中，并按照文本方案所述，在氨苄青霉素LB琼脂平板上筛选获得的菌落。挑选5到10个菌落，将每个菌落转移至含有100 µg/mL氨苄青霉素的2 mL LB培养基中。在37°C、220 rpm条件下于摇床中培养16小时。随后，使用质粒小提试剂盒提取各质粒DNA。按照文本方案中所述，使用正向测序引物通过DNA测序确认克隆。取100纳克构建质粒，按照文本方案转化40微升DH10Bac感受态细胞。将转化平板在37摄氏度下孵育48小时。从每个转化平板上挑取两个白色菌落，将每个菌落分别接种于含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的2毫升LB培养基中。按照文本方案所述提取并验证杆状病毒DNA。将每份DNA分装至两个离心管中，每管转移20微升。然后将试管置于 -20 摄氏度保存，直至准备进行后续操作。所有后续步骤均需在无菌条件下进行。在六孔板中，于 27 摄氏度下，使用含 10% 胎牛血清和 100 微克/毫升青霉素-链霉素抗生素的培养基，将 Sf9 细胞培养至 80% 汇合度，形成单层细胞。每次转染时，向一个1.5毫升离心管中加入100微升不含抗生素的未补充Sf9细胞培养基。将20微升bacmid DNA稀释至各管中，轻轻弹动混匀。接着，为每次转染向一个1.5毫升离心管中加入100微升不含抗生素的未补充Sf9细胞培养基。将八微升脂质转染试剂加入每支离心管中，用移液器彻底吹打六次以混匀。将上述两种溶液混合，再用移液器轻柔地上下吹打三次进行混匀。室温孵育20至40分钟。用3毫升未添加补充物且不含抗生素的Sf9培养基，将培养板的每个孔清洗两次。随后，向每管含有脂质-DNA混合物的样品中加入0.8毫升未添加补充物且不含抗生素的Sf9细胞培养基。缓慢吹打混匀3次。吸去孔板中的洗涤液，将样品与转染混合物覆盖。将转染后的孔板在27摄氏度下孵育5小时。之后，用含有10%胎牛血清（FBS）和100微克/毫升青霉素-链霉素抗生素的完全Sf9细胞培养基替换转染液。在 27 °C 下孵育四天。然后，将上清液收集至无菌的 15 毫升锥形管中。在 1,010 ×g 下离心五分钟，以去除细胞碎片。弃去沉淀，将上清液转移至洁净的离心管中。于4 °C保存，可保存长达一年或直至使用前。为扩增每种重组病毒，首先在150毫米培养皿中培养Sf9细胞单层至80%汇合度。然后吸去培养基，向每孔中加入2毫升P0病毒液。在27°C培养箱中孵育1小时，每隔15分钟轻摇培养板一次，以使培养基与细胞充分混合。接着，加入25毫升含10%胎牛血清（FBS）和100微克/毫升青霉素-链霉素抗生素的完全Grace's培养基。将培养板置于27摄氏度培养箱中孵育三天，以获得P1代病毒。随后，将上清液收集至无菌的50毫升锥形管中，于1,010 ×g离心5分钟，以去除细胞碎片。将上清液倒入干净的离心管中，在4°C下可保存长达一年，或保存至准备使用为止。为将病毒从P1代扩增至P2代，首先在150毫米培养皿中培养Sf9细胞单层，使其融合度达到90%。当达到所需融合度后，吸除培养基。加入 2 毫升 P1 病毒，于 27 摄氏度培养箱中孵育 1 小时。重复扩增步骤，获得病毒的 P2 和 P3 代次。本研究中使用两种经修饰的 pFastBac1 杆状病毒表达载体，通过替换目标基因的固有序列信号，分别表达带有 gp67 或血淋巴素（hemolin）信号序列的分泌蛋白。利用PBEC gp67成功表达了α-地中海贫血相关受体TDR的胞外结构域。同时，利用PBEC1天蚕素成功表达了PRK3的胞外结构域。随后，将纯化后的蛋白质浓缩至5毫克/毫升，并进行结晶筛选。针对每种蛋白质，优化产生初步晶体的条件，直至观察到大于20微米的蛋白质晶体。在进行该操作时，需注意他们通过尺寸排阻色谱法、多角度光散射及其他检测方法评估蛋白质的质量，以确认重组蛋白无聚集状态。同时，务必通过银染法检测蛋白质的纯度。采用此方法后，还可进行其他实验技术，如X射线晶体学和冷冻电镜（cryo-EM），以回答更多问题，例如所表达蛋白的三维结构。该技术发展后，为结构生物学领域的研究人员探索植物和哺乳动物中分泌蛋白的结构、功能及生化特性铺平了道路。请注意，使用紫外光观察琼脂糖凝胶上的DNA条带时可能存在极高风险，因此在进行该操作时，必须采取防护措施，例如佩戴紫外防护装置、面罩、护目镜和实验服。配制缓冲液时，操作强酸和强碱需格外小心。

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Biochemistry

生物化学

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