改进杆状病毒表达载体生产昆虫细胞分泌植物蛋白
2018年8月20日
在这里, 我们提出了利用昆虫细胞和杆状病毒蛋白表达系统来产生大量植物分泌蛋白的蛋白质结晶的协议。用 GP67 或昆虫 hemolin 信号肽对昆虫细胞中植物蛋白分泌表达进行了改进, 并对杆状病毒表达载体进行了修正。
该方法可以帮助回答生物化学和分泌蛋白结构生物学领域的关键问题，例如通过晶体学和冷冻电镜确定蛋白质结构。该技术的主要优点是它可以以相对较低的蛋白质结构测定成本产生大量重组分泌蛋白。首先，合成一个包含五个主要 BglII 切割位点的 DNA 片段，即文本方案中概述的多克隆位点中感兴趣的分泌信号序列。
接下来，用 BglII 和 X1 消化 4 μg DNA，用 BamH1 和 X1 消化 4 μg 表达载体 DNA。将 10 单位的每种限制性内切酶与 DNA 混合，加入 1X 浓度反应缓冲液中。在 37 摄氏度下孵育 4 小时。将 10 μL 含有 1X T4 DNA 连接酶反应缓冲液和 5 单位 T4 DNA 连接酶的连接反应混合物加入到新鲜的 1.5 mL Eppendorf 管中。
然后，加入 100 ng 线性化载体 DNA 和 400 ng 消化的 DNA 片段。在 16 摄氏度下孵育 16 小时。将 5 微升连接混合物转化到 100 微升 DH5 α 感受态细胞中，并按照文本方案中的概述在氨苄青霉素 LB 琼脂平板上选择所得菌落。
挑选 5 到 10 个菌落，每个菌落转移到 2 毫升含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中。在振荡培养箱中以 220 rpm 的速度在 37 摄氏度下培养这些菌落 16 小时。在此之后，使用 DNA 小量制备试剂盒提取每个质粒 DNA。
使用文本方案中概述的正向测序引物通过 DNA 测序确认克隆。使用 100 ng 构建质粒，按照文本方案中的概述转化 40 μL 的 DH10Bac 感受态细胞。将转化板在 37 摄氏度下孵育 48 小时。
从每个转化板中挑选两个白色菌落，并将每个菌落接种在含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的 2 mL LB 培养基中。按照文本方案中的概述提取并验证杆粒 DNA。将每个 DNA 分装到两个试管中，每个试管中转移 20 μL。
然后将试管存放在零下 20 摄氏度，直到准备好继续。所有后续步骤都必须在无菌条件下进行。在六孔板中，在含有 10% 胎牛血清和 100 μg/ml 青霉素-链霉素抗生素的培养基中培养单层 Sf9 细胞，在 27 摄氏度至 80% 汇合
。对于每次转染，将 100 μL 未添加添加剂的 Sf9 细胞培养基（不含抗生素）添加到 1.5 mL 离心管中。将 20 μL 杆粒 DNA 稀释到每管中，然后轻轻弹动混合。接下来，每次转染，将 100 μL 未添加添加剂的不含抗生素的 Sf9 细胞培养基添加到 1.5 mL 试管中。
将 8 μL 脂质体转染试剂稀释到每个试管中，并通过上下彻底吹打 6 次进行混匀。将这两种溶液混合，轻轻地缓慢上下吹打 3 次来混合。在室温下孵育 20 至 40 分钟。
每次洗涤使用 3 毫升未补充的不含抗生素的 Sf9 培养基洗涤培养板的每个孔两次。接下来，向每个含有脂质 DNA 混合物的试管中加入 0.8 mL未添加抗生素的 Sf9 细胞培养基。慢慢上下吹打 3 次以混合。
从板中吸出洗涤培养基，并将转染混合物覆盖在样品上。将转染板在 27 °C 下孵育 5 小时。在此之后，用含有 10% FBS 和 100 μg/mL 青霉素-链霉素抗生素的完整 Sf9 细胞培养基替换转染培养基。
在 27 摄氏度下孵育 4 天。然后，将上清液收集在无菌的 15 毫升锥形管中。以 1， 010 x g 离心 5 分钟以去除细胞碎片。
弃去沉淀，将上清液倒入干净的试管中。在 4 摄氏度下储存长达一年或直到可以使用。为了扩增每种重组病毒，首先在 150 毫米板上培养单层 Sf9 细胞至 80% 汇合。
然后吸出培养基，并向每个孔中加入 2 mL P0 病毒。在 27 摄氏度的培养箱中孵育 1 小时，每 15 分钟摇动一次培养板，使培养基与细胞混合。接下来，加入 25 毫升含有 10% FBS 的 Grace 完全培养基，以及每毫升 100 微克青霉素-链霉素抗生素。
将板在 27 摄氏度培养箱中孵育 3 天，以获得 P1 传代病毒。之后，将上清液收集在无菌 50 毫升锥形管中。以 1， 010 x g 离心 5 分钟以去除细胞碎片。
将上清液倒入干净的试管中，并在 4 摄氏度下储存长达一年或直到准备好使用。为了从 P1 到 P2 传代扩增病毒，首先在 150 毫米平板上培养单层 Sf9 细胞至 90% 汇合。达到所需的汇合点后，吸出培养基。
加入 2 毫升 P1 病毒，在 27 摄氏度的培养箱中孵育 1 小时。重复扩增步骤以获得病毒的 P2 和 P3 传代。在本研究中，使用两种修饰的 pFastBac1 杆状病毒表达载体，通过替换靶基因的内在信号序列，用 gp67 或 hemolin 信号序列表达分泌蛋白。
PBEC gp67 成功用于表达 a-thal-leano 受体 TDR 的胞外结构域。而 PBEC1 hemolin 成功用于表达细胞外结构域 PRK3。接下来，将纯化的蛋白质浓缩至每毫升 5 毫克，并进行结晶筛选。
优化产生每种蛋白质的初步晶体的条件，直到观察到大于 20 微米的蛋白质晶体。在尝试此程序时，重要的是要记住他们通过尺寸排阻色谱、多角度光散射和其他检测方法来检查蛋白质的质量，以确定重组蛋白的非聚集状态。不要忘记，也要通过银染检查蛋白质的纯度。
按照此程序，可以执行其他方法，如 X 射线晶体学和冷冻电镜，以回答其他问题，例如所产生蛋白质的三维结构。开发后，这项技术为结构生物学领域的研究人员探索植物和哺乳动物分泌蛋白的结构、功能和生化特性铺平了道路。不要忘记，使用紫外线观察琼脂糖凝胶上的 DNA 条带可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如佩戴紫外线防护装置、面罩、护目镜、实验室外套。
此外，在制备缓冲液时，处理强酸和强碱时要小心。
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概览
本文介绍了使用昆虫细胞和杆状病毒蛋白表达系统来生产大量用于结晶的植物分泌蛋白的协议。该方法在低成本下生产重组蛋白方面具有优势，有助于结构生物学研究。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 结构生物学
- 蛋白质结晶
背景
- 利用昆虫细胞进行蛋白表达。
- 杆状病毒表达载体的修改。
- 分泌蛋白在结构研究中的重要性。
- 该方法在大规模蛋白生产中的成本效益。
研究目的
- 提供生产植物分泌蛋白的协议。
- 通过晶体学和冷冻电子显微镜法促进蛋白质结构测定。
- 增进对分泌蛋白功能的理解。
使用的方法
- 合成具有特定切割位点的DNA片段。
- 用限制性内切酶消化DNA。
- 将DNA片段连接到表达载体。
- 在昆虫细胞中孵育和转化。
主要结果
- 成功生产重组分泌蛋白。
- 展示了低成本的蛋白表达。
- 适合结构分析的高产量潜力。
- 已在研究环境中验证了协议的可重复性。
结论
- 昆虫细胞和杆状病毒系统在蛋白生产中有效。
- 该方法支持结构生物学的进步。
- 未来的应用可能增进对蛋白质功能的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method addresses the bottleneck in producing recombinant secretory proteins for structural and biochemical studies by enabling high-yield secretion in insect cells. It supports target validation and assay development by providing soluble, post-translationally modified plant receptor proteins suitable for crystallization and functional screening. The approach enhances predictive confidence in early discovery by generating biophysically characterized extracellular domains of membrane receptors.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through production of secreted plant receptor extracellular domains for structural analysis.
- Operational Value: Supports biological de-risking by yielding soluble, glycosylated proteins with correct disulfide bond formation.
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking via crystallization-ready proteins that enable atomic-level target insight.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated secreted protein systems for downstream binding and inhibition assays.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible protein outputs essential for assay standardization and screening readiness.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation through homogeneous, monodisperse protein preparations verified by SEC-MALS and silver stain.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant systems using Arabidopsis thaliana receptor extracellular domains as models for kinase and signaling pathway studies.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery to preclinical work by producing proteins amenable to biophysical characterization.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantitative quality control of recombinant protein batches.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through structural elucidation and enabling lead identification via structure-guided design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by providing secreted receptor domains for functional and structural studies.
- Screening: Delivers assay-ready proteins with high solubility and homogeneity, enabling reliable screening campaign execution.
- Analytics: Generates quantitative biophysical readouts (SEC-MALS, silver stain) that inform protein quality and batch consistency.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through production of structurally characterized extracellular domains relevant to signaling pathways.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for secreted protein production across multiple targets using modular signal peptide swapping.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by delivering structurally validated secreted proteins with correct post-translational modifications.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized baculovirus amplification and secretion into supernatant.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing late-stage failure risk via early structural and functional target de-risking.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization through high-yield, crystallizable protein production supporting structural genomics initiatives.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, baculovirus handling, and insect cell culture techniques.
- Dependent on restriction enzyme digestion, ligation, and transfection infrastructure for recombinant virus generation.
- Necessitates standardization across teams for signal peptide selection (GP67 vs. hemolin) and bacmid verification protocols.
- Involves adaptation considerations when extending the system to mammalian or other plant secretory proteins beyond Arabidopsis thaliana targets.
- Limited by the need for aseptic technique during transfection and virus amplification steps to prevent contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Modification of a Baculovirus Expression Vector with either the GP67 Signal Peptideor the Insect Hemolin Signal Peptidefor Plant Protein Secretion Expression
2:24
Production and Amplification of Baculovirus Constructs Harboring the Recombinant Protein Expression Cassette
7:02
Results: Analysis of Plant Proteins Secreted by Insect Cells
7:57
Conclusion
