抗原脂质体用于生成特定于疾病的抗体

这种方法可以帮助回答免疫学领域的关键问题，例如白血球是如何激活的，以及对个别过敏原过敏是如何发展？这种坚固且可重复的过敏小鼠模型的主要优点是，可用于减少小鼠与实验人群的方差。控制免疫反应的新免疫疗法需要强大的小鼠模型作为测试体内疗效的初始手段。

因此，这种技术的影响延伸到过敏免疫治疗。虽然这种方法可以提供过敏的洞察力，它也可以应用于其他系统，如自身免疫，其中不需要的抗体反应在疾病中起着关键作用。一般来说，由于缺乏使用脂质纳米粒子的经验，或者缺乏对小鼠工作所需技术缺乏经验，对这种方法的个体将难以为之奋斗。

首先向蛋白质中加入相当于异体功能交联器的2.5摩尔，并在室温下将反应放在振荡摇床上约一小时。在与SPP孵育一小时后，在100毫摩尔醋酸钠的柱子上脱盐蛋白质，并收集分数。确定 280 纳米的吸光度，并汇集顶部的分数。

在PBS中清洗柱，并在池状蛋白质馏中加入25毫摩尔二三丁醇（DTT）进行5至10分钟的孵育。然后，测量蛋白质的280和343纳米吸收度，以便根据蛋白质和链接器的摩尔度计算链接比。接下来，运行 PBS 洗涤列的池分数，并收集 280 纳米和顶部分数池的测量分数，如所证明的。

将适当体积的100x DSPE-PEG2000-Maleimide加入到蛋白质中，通过柔和的涡旋，达到1倍、10倍摩尔多余的最终浓度。然后，在密封的圆底烧瓶中，在氮气下运行一夜的反应。第二天，将蛋白质运行在交联的脱脂凝胶珠柱上，并在四摄氏度下储存最终的脂质相关蛋白，直到其使用。

计算出正确量的每脂质后，将所有脂质混合到12毫升的硅酸盐玻璃试管中，并使用三毫升注射器和管子小心地用氮气将氯仿吹掉。然后，使用 100 微升的 DMSO 一夜之间将溶液冻干。第二天早上，在12毫升脂管中加入一毫升脂质相关蛋白，在声波水浴中，每个声波水浴中30到60秒的声波化溶液声波化3至4次，在声波间至少休息5分钟。

最后一次声波后，将样品装入放入挤出机中的一个挤出注射器中，然后将挤出注射器放入挤出机的另一端。空注射器将填充脂质通过聚碳酸酯 0.8 微米膜挤压。将完全组装的挤出机放入加热块中，轻轻按下柱塞以清空注射器。

最后一次挤出后，将脂质转移到干净的小瓶中，并通过聚碳酸酯0.2和0.1微米膜挤出脂质，正如刚刚演示的。然后，将脂质体储存在摄氏四度。为了监测B细胞对抗原脂体活化的反应，在钙通量加载缓冲液中再向第七个血细胞重新发送1.5倍10倍，并在细胞中加入1.5微摩尔印-1，将溶液在管中多次反转混合。

在37摄氏度下进行30分钟的水浴孵育后，在光线的保护下，加入5倍的钙通量负荷缓冲液，并离心机的印度-1标签细胞。对于B细胞门控，具有抗CD5和抗B220抗体的染色细胞在0.5毫升的加载缓冲液中，在4摄氏度下20分钟，不受光线影响。在孵育结束时，将细胞用新鲜钙通量加载缓冲液中清洗，并在每毫升新鲜钙通量中将颗粒重新暂停1至2倍至第七细胞，以运行缓冲液储存在冰上，防止光线扩散至分析。

接下来，将0.5毫升的细胞加入一个带盖的五毫升圆底聚苯乙烯管中，并在水浴中将细胞加热到37摄氏度。三到五分钟后，将管子转移到连接到再循环水浴的37摄氏度水套室，并在流式圆环仪上的水套中运行管。在收集 5，000 到 10，000 个事件后，让细胞稳定 15 到 30 秒，并重新启动数据采集，收集数据至少 10 秒以建立后台读数。

在10秒标记，迅速从流动细胞仪中去除管，并添加适当的抗原脂质体的实验浓度。然后，脉冲涡旋细胞，并读取细胞仪上的管额外三到五分钟。为使动物敏感，每4至5周大的BALB/c雌性小鼠接受者每周送一次200微升含有霍乱毒素的花生提取物，为期三周，第四周向300微升稀释花生提取物提供。

在第28天，准备花生提取物到PBS中每毫升1毫克的最终浓度，并使用直肠温度计测量每个敏感动物的基线体温。当所有温度都测量好后，通过内皮内注射给每个接受者施用200微升花生提取物，并在注射后1小时用直肠温度计测量体温。体温的下降表明对花生过敏。

在从花生过敏小鼠中隔离血细胞后，使用装有27表、5/8英寸针头的1毫升胰岛素注射器，将1.5倍10至第七提取的过敏性飞毛腿注射到天真、不受污染的动物的尾静脉中。收养转移一天后，静脉注射200微升的阿拉h2抗原脂质体到每只接受过敏性飞溅细胞的BALB/c小鼠的尾静脉。注射脂体两周后，用 i.p 提升小鼠。

注射可溶性 Ara h 2， 然后是 200 微升 Ara h 2 挑战第 61 天。然后，使用直肠探针每 15 分钟测量一次体温，如所证明的。蛋白质结合可以通过运行一种还原凝胶来证明与未结合的蛋白质相比，分子量增加。

为了评估抗原脂体刺激的B细胞钙通量，请对活的单细胞进行闸门，以允许选择B220-阳性CD5阴性B细胞。然后可以分析印度-1紫罗兰与印度-1蓝色荧光的比例，以评估脂体诱导的B细胞活化量。ELISA对花生提取物敏化小鼠血清中的Ara h 2特异性IgE和IgG1进行定量，表明具有赋予敏感性的小鼠在血清中表现出可测量的Ara h 2特异性IgE和IgG1。

Ara h 2 挑战期间记录的体温显示，过敏小鼠在挑战后表现出体温下降，而天真小鼠的体温保持不变。在尝试此程序时，重要的是要记住仔细跟踪脂质相关蛋白在脂质体中被纳入的量，因为太多的蛋白质会使挤出变得困难。按照这个程序，其他方法，如跟踪和排序过敏原特异性B和T细胞可以回答关于这些过敏原特异性细胞如何回应疗法的其他问题。

这项技术将为过敏领域的研究人员探索利用这种小鼠模型对抗过敏性疾病的新免疫疗法铺平道路。不要忘记，使用霍乱毒素可能是危险的，使用指南应遵循您当地的机构生物安全标准。