Name: 切片中石蜡嵌入组织的切割和漂浮方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min
Description: 学习石蜡切片中切割与漂浮相结合的新方法，利用恒温槽避免传统转移步骤，提高小鼠海马、肾脏及斑马鱼眼组织切片的完整性与效率。该技术可加速组织形态学分析。

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本工作得到国家自然科学基金（项目编号：31400936，31460260）和江西省自然科学基金（20171BAB215020）的资助。我们还感谢南昌大学与伦敦玛丽女王大学联合项目对本工作的支持。

本文所述所有方法均已获得南昌大学动物护理与使用委员会的批准。
1. 组装设备并连接切片机
<ol>
	<li>根据要求设计参数（补充 图1）。</li>
	<li>将参数提交至本地工厂以制造亚克力板。</li>
	<li>按顺序组装所有部件：使用氯仿将7块商用亚克力板组合成一个带有切片通道和水浴槽的容器（图1）。 
	警告：氯仿在接触光和氧气时会产生有毒物质。应在通风橱内组装装置。</li>
	<li>通过亚克力板#1上的孔安装管状电加热元件（图2A，箭头所示）。</li>
	<li>安装温度控制器时，使用电钻在亚克力板#2上钻一个小孔，并安装温度传感器（图2A，箭头所示）。在容器上安装数字恒温器（图2A）。 
	注意：温度传感器应位于水面以下1 cm范围内。</li>
	<li>为确保供电安全，开启设备前应先将电压调节至24 V以下。</li>
	<li>从切片机上取下切片废料盘。</li>
	<li>使用中性硅酮密封胶将切片通道与切片机刀片夹连接（图2B）。 
	注意：不要将中性硅酮密封胶涂抹至刀片顶部以上，以便于更换旧刀片。</li>
	<li>静置过夜，使氯仿和中性硅酮密封胶充分固化。</li>
	<li>将刀片安装至刀片夹上。向水浴槽中注水（图2C），水面应刚好接触刀片顶端（图2D，箭头所示）。</li>
</ol>
2. 石蜡切片
注意：蜡块的上边缘或下边缘以及水面常会积聚碎屑，应定期清除。
<ol>
	<li>进行常规石蜡切片10
	<ol>
		<li>将包埋有石蜡的样本固定在旋转式切片机上，并将刀片安装至刀片夹中。</li>
		<li>转动转轮，对样本进行切片。</li>
		<li>将切下的石蜡带转移至38.5 °C的温水浴中。</li>
		<li>待切片在水面上展平后，将其捞取至显微镜载玻片上。</li>
		<li>将载玻片置于42 °C烘箱中过夜干燥。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>改进的石蜡切片法（图3）
	<ol>
		<li>开启设备电源。</li>
		<li>打开带温度检测开关的加热器，提前1小时将水浴温度设定在38.0 °C至40.0 °C之间，以预热水浴。</li>
		<li>修整经石蜡包埋获得的组织块；然后将组织块放置于切片机的样品夹中并锁紧。 
		注意：应水平修整石蜡块的上下边缘，以防止切片带形成弧形，无法顺利通过狭窄的切片通道。</li>
		<li>通过切取较厚的切片快速接近目标区域。</li>
		<li>调整至合适的切片厚度（成年小鼠脑、成年小鼠肾脏及胚胎小鼠脑为10 µm，斑马鱼眼球为4 µm）。转动转轮，切片将自动进入切片通道并进入水浴。</li>
		<li>以缓慢且均匀的切割动作进行切片（图3A）。 
		注意：转轮停止数分钟后，再次开始切片时首片厚度会发生变化。当切片出现连续划痕时，应更换一次性刀片。</li>
		<li>引导切片进入水浴腔，使其呈直线漂浮（图3B、3C）。 
		注意：若前端切片粘附于腔壁，可用毛刷引导使其保持漂浮状态。</li>
		<li>将切片贴附于显微镜载玻片上。待切片在水浴中完全展平后，用镊子分离若干切片，然后从水浴中将其捞取至载玻片上（图3D）。 
		注意：应从水浴后部捞取切片，因为位于切片通道及水浴前部的切片尚未完全展平。</li>
		<li>将载玻片置于42 °C烘箱中过夜干燥。干燥后的载玻片可于室温长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用苏木精-伊红（HE）染色法对改进方法的效果进行评估8。</li>
</ol>

<ol><li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23722210">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Fujita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+neuron+differentiation+in+the+central+nervous+system+by+tritiated+thymidine+autoradiography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Analysis of neuron differentiation in the central nervous system by tritiated thymidine autoradiography.</a> Journal of Comparative Neurology. 122 (3), 311-327 (1964).</li>
<li>Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+Computer-aided+jet-based+3D+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Organ printing: Computer-aided jet-based 3D tissue engineering.</a> Trends in Biotechnology. 21 (4), 157-161 (2003).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryosectioning+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cryosectioning tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 3 (8), (2008).</li>
<li>Viebahn, C., Luttenberg, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+anti-roll+plate+as+a+remedy+for+the+ill-effects+of+electrical+charge+during+cryosectioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A modified anti-roll plate as a remedy for the ill-effects of electrical charge during cryosectioning.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 37 (7), 1157-1160 (1989).</li>
<li>Onozato, M. L., Hammond, S., Merren, M., Yagi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+completely+automated+tissue-sectioning+machine+for+paraffin+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a completely automated tissue-sectioning machine for paraffin blocks.</a> Journal of Clinical Pathology. 66 (2), 151-154 (2013).</li>
<li>Sabaliauskas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+zebrafish+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput zebrafish histology.</a> Methods. 39 (3), 246-254 (2006).</li>
<li>Chen, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid-Cut%3A+An+Improved+Sectioning+Method+for+Recalcitrant+Plant+Tissue+Samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54754(2016).</li>
<li>Kucherenko, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin-Embedded+and+Frozen+Sections+of+Drosophila+Adult+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2438(2010).</li>
<li>Cornell, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+Embedding+and+Thin+Sectioning+of+Microbial+Colony+Biofilms+for+Microscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57196(2018).</li>
<li>Whiteland, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+T-cell+subsets+and+other+leukocytes+in+paraffin-embedded+rat+and+mouse+tissues+with+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of T-cell subsets and other leukocytes in paraffin-embedded rat and mouse tissues with monoclonal antibodies.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (3), 313-320 (1995).</li>
<li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sectioning+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Lesion+Identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Sectioning Mammary Gland Whole Mounts for Lesion Identification.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e55796(2017).</li>
<li>Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analysis+and+Characterization+of+Atherosclerotic+Lesions+in+the+Murine+Aortic+Sinus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus.</a> Journal of Visualized Experiments. (82), e50933(2013).</li>
<li>Lau, S. K., Chu, P. G., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD163%3A+A+specific+marker+of+macrophages+in+paraffin-embedded+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD163: A specific marker of macrophages in paraffin-embedded tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 122 (5), 794-801 (2004).</li>
<li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+Protocols+for+Human+Pancreatic+Islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining Protocols for Human Pancreatic Islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e4068(2012).</li>
</ol>

作者们拥有该设备的专利，且声明无竞争利益。

为了改善石蜡切片的形态并解决传统石蜡切片过程中耗时浪费的问题，我们建立了一种结合切片与展片的改进型石蜡切片方法。该改进方法依赖于一套简单的设备，包括切片通道、水浴槽以及带有温度检测开关的加热器。切片带通过切片通道进入水浴槽，在切片的同时自动展平。因此，该方法提高了石蜡切片的质量与效率，这一点已通过成年小鼠海马、成年小鼠肾脏、E15.5小鼠脑组织以及成年斑马鱼眼睛的石蜡切片实验得到验证。
为避免常规石蜡切片过程中出现切片卷曲，已采取多种调整措施，例如润湿组织表面、冷却蜡块、增加湿度以及结合冷冻切片技术6,7,8；然而，这些调整使石蜡切片过程更加繁琐。一种依赖液态水的商业化切片转移系统取得了更好的效果。在该系统中，切片在切割后立即接触水面，由电动机驱动的水流将切片从刀架转移至下方的温水浴9。由于其工作原理可避免静电对切片的干扰，从而提高了切片质量。此外，...

形态学研究在生物学研究中具有重要意义。尽管新技术已使研究人员能够直接从完整组织或生物体中观察其目标，1,2,3 但将样本切成薄片并进行染色，仍然是研究组织形态以及直接在组织内定位蛋白质的主要方法。光学显微镜使用三种类型的切片：石蜡切片、冰冻切片和半薄切片。尽管冷冻切片常用于保护组织抗原性，且样本制备过程简便，但其保持的组织形态较差，不适合制作薄切片。4,5 石蜡切片是展示良好保存形态最常用的方法。由于样本经过完全脱水并包埋于石蜡中，石蜡块可长期保存。此外，石蜡切片可产生薄切片，有利于后续实验中生物探针的渗透，并减少Z方向上的细胞层重叠。
然而，传统的石蜡切片过程繁琐，且对操作者的技术要求较高。石蜡切片需经过固定、脱水、包埋、切片和展片等步骤。其中，将切片带从刀架转移至水浴的过程至关重要，但对初级操作者而言较为困难。尤其在干燥空气中，切片带容易因静电而扭曲，难以在温水表面展平。为提高切片质量，建议在切片过程中用润湿剂湿润组织表面、将石蜡块浸入冰水中冷却，或在切片机附近使用加湿器提高环境湿度6，7。近年来改进石蜡切片的方法包括混合石蜡包埋、冷冻切片8以及借助商用切片转移系统9。尽管这些方法在一定程度上提高了石蜡切片的速度和质量，但使操作过程更加复杂，且商用切片转移系统价格昂贵。
在本实验方案中，我们逐步演示如何制作一种简单、廉价且灵活的设备，该设备可连接至旋转式切片机的刀片架。该设备由切片通道、水浴槽以及带有温度检测开关的加热器组成。切片完成后，数十片切片流入切片通道并直接进入水浴槽，从而自动展开。该方法提高了石蜡切片的效率，使该技术更加便捷。使用此方法，可在更短时间内获得更多完整形态的成年小鼠海马切片、成年小鼠肾脏切片、胚胎15.5天（E15.5）小鼠脑切片以及成年斑马鱼眼球切片。该方法也可用于其他需要加快石蜡切片速度并避免切片辨识丢失的组织样本。

<table><tbody><tr><td>培养箱</td><td>Boekel Scientific</td><td>133000-2</td><td></td></tr><tr><td>乙醇&amp;nbsp;</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯&amp;nbsp;</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>石蜡包埋剂（Paraplast）</td><td>Leica</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>加热式石蜡包埋模块</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>商用亚克力板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三氯甲烷</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>管状电加热元件（12 V 200 W）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>温度控制器（12 V 120 W）</td><td>Mingsuo</td><td>XH-W3002</td><td></td></tr><tr><td>旋转式切片机&amp;nbsp;</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中性硅酮密封胶</td><td></td><td></td><td>连接水槽与切片机刀架</td></tr><tr><td>电压变压器</td><td>Dearll</td><td>S-250-12</td><td></td></tr><tr><td>一次性刀片</td><td>Accu-Edge</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>宝斯捷诊断技术有限公司</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>伊红&amp;nbsp;</td><td>宝斯捷诊断技术有限公司</td><td>BA-4025</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Sail Brand</td><td>7105</td><td></td></tr><tr><td>中性树胶</td><td>国药集团化学试剂有限公司</td><td>10004160</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片&amp;nbsp;</td><td>Citoglas</td><td>10212424C</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>西陇化工</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>石蜡切片水浴槽</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HistoCore Arcadia C&amp;nbsp; - 冷却板</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>防蜡喷雾剂&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>9990420</td><td></td></tr></tbody></table>

石蜡包埋组织切片的切割与漂浮法

The Cutting and Floating Method for Paraffin-embedded Tissue for Sectioning

石蜡包埋组织切片在组织学和病理学中被广泛应用，但该过程较为繁琐。为改进这一方法，一些商业公司开发了使用液体水的复杂切片转移系统。为了简化该技术，我们创建了一种使用自制设备的简便方法，该方法在简单的恒温室内结合了切片与漂浮步骤，从而使切片自动进入水浴的水面上。本研究分别采用传统石蜡切片法和本方法对成年小鼠脑中的海马、成年小鼠肾脏、胚胎小鼠脑以及成年斑马鱼眼睛进行切片，并进行比较。统计分析表明，我们改进的方法节省了时间，并获得了更高质量的切片。此外，初级操作人员也能在短时间内轻松完成整个样本的石蜡切片。

改进后的方法增加了完整石蜡切片的数量。我们已在成年小鼠海马组织、成年小鼠肾脏、胚胎小鼠脑组织以及斑马鱼眼睛上测试了这一新方法。向水浴槽中加水，并将水温维持在 38.0 °C 至 40.0 °C 之间。在连续制备组织样本后，对其进行切片，并与传统切片方法进行比较。新方法避免了切片丢失，提高了成年小鼠海马、成年小鼠肾脏、E15.5 小鼠脑组织以及成年斑马鱼眼睛中完整切片的比例（图 4A、4C、4E、4G）。综上所述，本方法通过防止切片丢失，提高了每个样本可收获的完整切片数量，从而改善了切片效果。
改进后的方法缩短了每个样本的处理时间。通过比较传统方法与改进后方法所需时间，我们对成年小鼠海马、成年小鼠肾脏、E15.5小鼠脑组织以及成年斑马鱼眼球进行了全系列切片（从器官的第一个切片到最后一个切片）。结果表明，改进后的方法在所有测试样本中均加快了石蜡切片速度（<stro...

本文介绍了一种改进的石蜡切片技术。该方法结合了切片与漂片过程，使用一个简单的恒温舱，避免了传统方法中所需的转移步骤。结果显著提高了石蜡切片的效率和完整切片的数量。

石蜡包埋组织切片在组织学和病理学中广泛应用，但该过程较为繁琐。为改进这一方法，已有多种商用……

该方法有助于回答形态学领域的关键问题，例如石蜡切片。此技术的主要优势在于，它将切割和折叠步骤合而为一，避免了传统方法中所需的转移过程。首先，在通风橱中收集所有预先制备好的部件。使用氯仿将七块亚克力板连接在一起，如图所示。最终产品将是一个带有分流通道和水浴装置的水箱。通过2号亚克力板上的孔安装管状电加热元件。使用电钻在第七块丙烯酸板上钻一个小孔，并在水浴槽上安装数字恒温器，确保其位置至少低于预期水位线1厘米，水位线由水浴槽上的黑点标示。在开启设备前，调节电压使其低于24伏。从切片机上取下废料接盘。接下来，使用中性硅酮密封剂将切片通道与切片机刀片架连接，注意不要将密封剂涂至刀片顶部以上。让装置静置过夜，使氯仿和中性硅酮密封剂有足够时间固化。第二天，将刀片安装到刀片架中。向水浴中加水，确保水面刚好接触到刀片的顶部。完成常规石蜡切片后，打开设备以开始改进的石蜡切片操作。使用温度检测开关启动加热器。将目标温度设定在 38 摄氏度至 40 摄氏度之间，持续一小时以加热水。使用刀片修整经石蜡包埋获得的石蜡块。然后，将石蜡块放置于切片机的样本盒夹具上，并固定锁紧。切下较厚的切片以快速接近样本。根据样本调整至合适的切片厚度。转动手动轮会自动将切片送入切片通道和水浴中。接下来，以缓慢且均匀的切割动作对样本进行切片。将切下的片状样本引导至浴槽中，使其呈直线漂浮。如果头部切片粘附在槽壁上，可使用毛刷引导，使其保持漂浮状态。待切片在水浴中完全展开后，用镊子分离出数片，然后将其转移至载玻片上。将载玻片置于42摄氏度的烘箱中过夜干燥。此后，载玻片可长期室温保存，直至准备进行分析。准备分析时，采用苏木精-伊红染色法，利用改进的方法对切片进行评估。本研究使用一种改进的方法制备成年小鼠海马组织、成年小鼠肾脏、胚胎小鼠脑组织以及斑马鱼眼睛的石蜡切片。如图所示，该新方法可避免切片脱落，并提高每种被检组织中完整切片的比例。在进行全系列切片时，该方法在所有测试样本中均显示出可加快石蜡切片速度。换言之，与传统方法相比，该方法能在更短时间内获得更高质量的石蜡切片。随后通过苏木精-伊红染色观察斑马鱼视网膜的连续切片。与传统的石蜡切片方法相比，改进方法所获得的切片具有更好的完整性。尽管在大多数切片的质量方面，这两种方法之间没有显著差异，但一些采用传统方法获得的切片质量相对较低。请务必注意，氯仿的操作可能具有极高危险性，在进行该操作时应始终采取预防措施，例如使用通风橱。进行此操作时，务必牢记：小心加水，避免加得过多。

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神经科学

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