Name: 抗肿瘤药物对抗癌抗体疗效的潜力: 用组合指数方程检测抗体-药物协同作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 4 s
Description: 了解如何使用Chou-Talalay组合指数方程评估抗癌抗体与抗肿瘤药物的协同作用。本方案提供临床前模型中的定量分析方法，帮助研究人员优化联合治疗方案并提高疗效。

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基金支持：南特大学项目基金会（Fondation de Projet de L'Université de Nantes）、les Bagouz' à Manon、卢瓦尔-大西洋省抗癌联盟（La Ligue contre le Cancer comité de Loire-Atlantique）、莫尔比昂省分会（comité du Morbihan）和旺代省分会（comité de Vendée）、une rose pour S.A.R.A.H、L'Etoile de Martin 以及法国儿童与青少年癌症和白血病防治协会（Société Française de Lutte contre les Cancers et les leucémies de L'Enfant et de L'adolescent, SFCE）。&#160;M.B. 和 J.F. 由法国抗癌联盟（La Ligue Contre Le Cancer）提供资助。作者感谢弗朗索瓦·博纳米联合研究结构（Structure Fédérative de Recherche François Bonamy）的UTE技术平台。作者还感谢巴黎国家健康与医学研究院（Inserm）的 S. Suzin 博士提供 IMR5 细胞，以及 H. Estéphan 女士的技术协助。

动物饲养和实验程序已获得法国政府批准（许可协议编号：#C44-278 和 #APAFIS 03479.01）。动物护理和操作均依据欧盟指令 EU 2010/63/EU 以及法国关于用于科研目的动物保护的法律 #2013-118 进行。
1. 单克隆抗体8B6与拓扑替康药物相互作用的评估 体外
<ol>
	<li>96孔板样品制备 
	警告：请咨询所在机构的健康与安全委员会，并遵守与实验室安全相关的当地法规。在使用任何培养基、细胞系或试剂前，应查阅材料安全数据表。操作时应采用适当的无菌技术，并在超净工作台内进行。所有用于细胞操作的溶液和设备必须无菌。 
	注意：以下方案适用于贴壁细胞。若应用于悬浮生长的非贴壁细胞，需进行相应修改；本方案中每个实验条件设置四个重复。
	<ol>
		<li>在T75培养瓶中培养IMR5细胞。</li>
		<li>第一天（第0天），在显微镜下观察细胞培养状态，检查细胞汇合度。吸除培养瓶中的培养基，用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次，加入3 mL含0.05%乙二胺四乙酸（EDTA）的PBS溶液。将培养瓶放回培养箱孵育3分钟（37 °C，5% CO2）。</li>
		<li>在显微镜下观察细胞是否脱落。 
		注意：如有必要，可根据肿瘤细胞类型将培养瓶继续放回培养箱额外孵育3至5分钟。</li>
		<li>向培养瓶中加入10 mL完全培养基，将细胞悬液转移至无菌的15 mL锥形离心管中。以300 × g 离心5分钟。使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
		<li>吸除并弃去上清液。将细胞沉淀重悬于完全生长培养基中，调整体积使最终细胞浓度为1 × 105 个/mL。</li>
		<li>向96孔培养板中接种84个孔，每孔加入100 µL细胞悬液，含104 个细胞。按照 图2 所示的实验布局进行加样。</li>
		<li>将细胞在培养箱中孵育18小时（37 °C，5% CO2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>药物溶液配制 
	注意：对于药物/单克隆抗体（mAb）敏感性研究，应根据具体药物或mAb调整处理时间、持续时间和浓度。注意初始浓度为最终浓度的3倍。
	<ol>
		<li>次日早晨（第1天），使用完全生长培养基配制以下药物溶液。
		<ol>
			<li>单克隆抗体溶液配制
			<ol>
				<li>将mAb用500 µL完全生长培养基稀释，配制成终浓度为240 µg/mL的抗体工作液。</li>
				<li>按照 图2 所示进行五次两倍连续稀释。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>拓扑替康溶液配制
			<ol>
				<li>同上，将药物用500 µL完全生长培养基稀释，配制成终浓度为120 nM的药物工作液。</li>
				<li>按照 图2 所示进行五次两倍连续稀释。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>抗体与药物联合溶液配制
			<ol>
				<li>将药物和mAb溶液用500 µL完全生长培养基稀释，配制成含120 nM药物和240 µg/mL mAb的联合工作液。</li>
				<li>按照 图2 所示进行五次两倍连续稀释。</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>为达到最终浓度，按照实验布局（图2）将每种药物溶液各50 µL加入相应孔中。 
		注意：按照 图2 所示，向未处理细胞孔中加入50 µL完全生长培养基。</li>
		<li>将细胞在培养箱中孵育72小时（37 °C，5% CO2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MTT检测
	<ol>
		<li>向每孔加入10 µL MTT试剂溶液。</li>
		<li>在37 °C孵育4小时。</li>
		<li>使用多通道移液器向每孔加入100 µL裂解液（含10% SDS的0.01 M HCl溶液），并通过反复吹打充分混匀。</li>
		<li>在加湿培养箱（95%湿度）中37 °C孵育4小时。</li>
		<li>使用分光光度计读取570 nm（A570）和620 nm（A620）处的吸光度。 
		注意：读取吸光度前需再次通过吹打混匀各样品；620 nm处的吸光度可用于校正非特异性背景值。</li>
		<li>计算校正后的吸光度：校正吸光度 = A570 - A620。</li>
		<li>按下式计算细胞活力：细胞活力 = 100 ×（样品校正吸光度均值 / 对照组校正吸光度均值）。</li>
		<li>使用以下公式计算效应分数（Fa）值：1 -（样品校正吸光度均值 / 对照组校正吸光度均值）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>单药及联合用药研究的药物相互作用分析模拟软件
	<ol>
		<li>运行模拟软件，打开起始窗口。</li>
		<li>点击 新建实验 按钮，打开 主界面。</li>
		<li>在 名称 窗口中输入实验名称。 
		注意：可在 日期 窗口中添加日期。</li>
		<li>点击 新建单药 按钮。</li>
		<li>在 全称 窗口中输入名称。</li>
		<li>在 缩写 窗口中输入缩写。</li>
		<li>在 单位 窗口中输入药物浓度单位。</li>
		<li>输入 数据点1剂量 和 Fa值，按 回车。</li>
		<li>重复此步骤，直至所有数据点输入完毕。</li>
		<li>点击 完成 按钮。</li>
		<li>按照相同步骤输入mAb的数据点。 
		注意：使用与药物相同的浓度单位。</li>
		<li>点击 新建药物组合 按钮。</li>
		<li>选择 药物 和 mAb。</li>
		<li>选择 恒定比例，然后点击 确定。</li>
		<li>在 全称 窗口中输入名称。</li>
		<li>在 缩写 窗口中输入缩写。</li>
		<li>在 比例 窗口中输入药物/mAb的比例。</li>
		<li>输入 数据点1剂量，按 回车。 
		注意：程序将自动计算mAb和联合用药的剂量。</li>
		<li>输入 数据点1 Fa 值，按 回车。</li>
		<li>重复此步骤，直至所有数据点输入完毕。</li>
		<li>点击 完成 按钮，然后点击 生成报告 按钮。</li>
		<li>选择药物和mAb，然后点击 确定。</li>
		<li>选择 组合，然后点击 确定。</li>
		<li>选择 页眉、CI表 和 汇总表，然后点击 确定。</li>
		<li>输入分析文件的文件名，点击 保存 以生成报告。 
		注意：点击 确定 后，报告将自动在计算机默认的网页浏览器中打开。</li>
		<li>如需打印报告，请在网页浏览器的文件菜单中选择 打印。报告包含汇总表部分，内容包括标题、日期、文件名、描述性备注、参数（m、Dm和r）、单药或联合用药的ED50，以及在ED50、ED75、ED90 和 ED95 处的CI表。 
		注意：CI值&#60;1表示协同作用，CI值=1表示相加作用，CI值&#62;1表示拮抗作用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 在非肥胖型糖尿病 NOD Scid Gamma 小鼠（NSG 小鼠）中建立人神经母细胞瘤异种移植模型
注意：避免细胞培养过程中任何污染。由于基底膜基质在高于 5 °C 时会形成凝胶，所有与基底膜基质试剂接触的培养器具或培养基都应预先冷却或保持冰冻状态。在整个操作过程中，基底膜基质应始终置于冰上。
<ol>
	<li>IMR5细胞悬液的制备
	<ol>
		<li>解冻基底膜基质试剂&#160;使用前，将小瓶浸入冰中，于4 °C冰箱内过夜。</li>
		<li>第0天，按照上述方法收获培养的IMR5细胞。</li>
		<li>将细胞转移至15 mL锥形管中，以300 x g离心 g 5 分钟。</li>
		<li>弃去上清液。用15 mL预冷的PBS洗涤细胞2次，并制备浓度为5 × 10⁶个/mL的细胞悬液。7 细胞/mL，置于预冷的PBS中 
		注意：如有必要，将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。</li>
		<li>轻轻旋转基底膜基质小瓶。 
		注意：基底膜基质试剂应解冻并分散。</li>
		<li>加入一倍体积的基底膜基质试剂，用移液器吹打混匀，得到浓度为 2.5 x 10 的细胞悬液7 细胞/mL</li>
		<li>将细胞悬液置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠的准备 
	注意：小鼠应为六至七周龄。
	<ol>
		<li>在特定无病原体条件下饲养小鼠。</li>
		<li>小鼠到达后，给予3至5天的适应期。</li>
		<li>接种当天，剃除将要进行注射部位的 flank 区域毛发（参见步骤 2.3.6）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肿瘤细胞注射的制备 
	注意：整个操作过程中须保持冰上预冷的基底膜基质细胞悬液处于无菌状态。
	<ol>
		<li>将细胞混匀，小心吸取细胞悬液至装有21 G针头的1 mL注射器中。</li>
		<li>检查注射器内是否有气泡。</li>
		<li>用消毒液对小鼠的接种区域进行消毒。</li>
		<li>用手指轻轻捏住小鼠侧腹部注射部位的皮肤。</li>
		<li>将针头准确刺入皮褶内。切勿将针头深入组织，以确保进行皮下注射。</li>
		<li>注射100 µL IMR5细胞悬液（即，2.5 × 106 将细胞皮下接种于小鼠右下腹侧。</li>
		<li>旋转注射器以防止泄漏，然后拔出针头。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>体重变化与肿瘤生长的监测
	<ol>
		<li>使用游标卡尺测量肿瘤的长度（A）和宽度（B）。</li>
		<li>使用公式（A × B）计算肿瘤体积2) × 0.5</li>
		<li>当肿瘤体积达到约50–60 mm³时开始治疗3.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 小鼠的药物和抗体给药
<ol>
	<li>单克隆抗体8B6的静脉注射
	<ol>
		<li>使用装有25 G针头的1 mL注射器，小心吸取单克隆抗体溶液。</li>
		<li>将小鼠置于加热灯下10分钟，以扩张尾静脉。</li>
		<li>将小鼠固定在啮齿类动物固定器中。</li>
		<li>用消毒液对小鼠接种部位进行消毒。</li>
		<li>将针头平行于尾静脉插入，针尖斜面朝上，穿刺进入管腔深度为2–4 mm（图3A）。</li>
		<li>静脉注射（i.v.）100 µL抗体溶液。</li>
		<li>注射完成后，轻压注射部位以防止出血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>拓扑替康的腹腔注射
	<ol>
		<li>用装有25 G针头的1 mL注射器抽取药物溶液。</li>
		<li>将小鼠呈仰卧位固定，后端略抬高。</li>
		<li>用消毒液对小鼠接种部位进行消毒。</li>
		<li>定位小鼠腹部中线，并在脑海中将腹部划分为四个象限，选择右下或左下象限作为注射部位（图3B）。</li>
		<li>在右下或左下象限，以约10°角将针头插入腹部，深度约为5 mm。</li>
		<li>腹腔注射（i.p.）100 µL药物溶液。</li>
		<li>对接种部位进行消毒。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Chou, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+basis%2C+experimental+design%2C+and+computerized+simulation+of+synergism+and+antagonism+in+drug+combination+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Theoretical basis, experimental design, and computerized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies.</a> Pharmacological Reviews. 58 (3), 621-681 (2006).</li>
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</ol>

S.Fa.、J.F. 和 S.B. 被列为正在申请的专利的发明人，这些专利涉及抗O-乙酰化GD2治疗性抗体的临床应用。

为了预测药物相互作用的效果，可以采用三种方法：等效图法17、非线性混合模型18以及联合指数法1。其中，联合指数分析应用最为广泛，因其可通过一个用户友好的计算机程序简化操作。为此，我们首先通过MTT实验19，对单独使用或联合使用的每种药物的剂量-效应关系进行了表征。该方法基于活细胞将四唑盐还原为紫色甲臜产物的能力，该产物在570 nm处具有最大吸光度19。细胞死亡后，失去将MTT转化为甲臜的能力。因此，生成的有色甲臜产物的量与培养物中活细胞的数量成正比19。事实上，我们选择该方法作为测量细胞增殖的非放射性替代方案，以取代将氚标记的胸苷掺入DNA的方法19。因此，MTT实验已被广泛采用，并在学术实验室中保持流行，已有数千篇发表文章为证。虽然甲臜的量通常通过使用酶标仪在570 nm处测定吸光度来获得，有时也会使用...

传统上，针对多种不同类型癌症的治疗方法主要基于单一疗法。尽管该方法在许多情况下仍在使用，但其遇到了若干障碍，从而促使人们转向联合治疗策略2。特别是，癌细胞在单药治疗时更容易通过激活替代性生存机制而产生耐药性3，导致患者治疗失败4。此外，在单一疗法中，药物通常以高剂量给药，这种情况常常引发严重的剂量依赖性副作用，可能无法耐受，迫使医生终止治疗2。基于这些原因，目前更倾向于采用抗癌药物联合治疗而非单一疗法。
理想的药物组合应能协同作用于肿瘤细胞，同时不增加对正常细胞的毒性。协同作用是指两种或多种药物相互作用所产生的治疗效果大于各药物单独作用效果的总和。此类相互作用可能增强临床治疗效果2。它可限制治疗耐药性的产生，提高疗效，并可能降低毒性2。事实上，通过靶向不同通路，每种药物的剂量均可减少，从而降低其副作用。此外，其中一种分子还可作为对癌细胞的致敏剂。在已被致敏的细胞中，第二种药物的作用可能增强，因而可使用更低的剂量5。
联合治疗可包括两种或两种以上的化疗药物和/或生物制剂，例如单克隆抗体6这些单克隆抗体特异性靶向表达特定细胞表面抗原的细胞，并可通过免疫效应细胞参与的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）等免疫途径杀伤肿瘤细胞。7，以及补体依赖性细胞毒性（CDC）6。它们还可以发挥以下作用 通过 一种由细胞凋亡介导的非免疫学机制8,9,10,11在这种情况下，诱导程序性细胞死亡过程可使癌细胞增敏，削弱其功能，并使相关化疗药物在较低剂量下更有效。因此，促凋亡单克隆抗体是设计与抗肿瘤药物联合治疗方案的良好候选。
已有多种数学模型被用于评估药物协同作用，其中之一是基于联合指数法1。该方法基于赵（Chou）提出的中效原理1。中效方程将药物剂量与药物效应关联如下。
<img alt="扩散公式 D=Dm[Fa/(1-Fa)]^(1/m) 方程，教育研究。" src="/files/ftp_upload/58291/58291eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 1">
其中，D 为药物剂量；Dm 为中效剂量；Fa 为受剂量影响的细胞分数；m 为表示剂量-效应曲线形状的指数1。中效剂量可用于计算药物抑制或杀死“x”百分比细胞所需的剂量 Dx。随后按如下公式计算 CI 值，以评估药物组合的相加效应1。
<img alt="用于药物相互作用分析的CI方程；使用公式 CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2。" src="/files/ftp_upload/58291/58291eq2.jpg" style="font-size: 14px;" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2">
CI 值为 1 表示具有相加效应，而 CI 值为 &lt;1 表示具有协同效应，而 CI 值为 &gt;1 表示拮抗作用1该方法的应用因可使用计算机程序CompuSyn而更加便捷，该程序可自动模拟并确定所有剂量或效应水平下的协同作用与拮抗作用12.
我们课题组已开发出针对O-乙酰基-GD2神经节苷脂（OAcGD2）神经母细胞瘤抗原的单克隆抗体8B613 并进一步证明该单克隆抗体能够诱导具有凋亡特征的细胞死亡11为了检测单克隆抗体8B6是否能够增强神经母细胞瘤细胞对抗癌药物拓扑替康的敏感性，我们采用了上述由Chou建立的方法1首先，我们确定半数有效剂量（ED₅₀）50mAb 8B6 与拓扑替康的 ED 值。随后，根据两种化合物等效比例处理神经母细胞瘤细胞50 通过上述模拟软件暴露数值以确定CI值。该方法使我们能够证明单克隆抗体8B6与拓扑替康之间的协同作用。 体外接下来，我们描述一种用于进一步评估该联合治疗方案有效性和安全性的实验方案 体内该方案可轻松应用于临床前研究中，以筛选高效且安全的抗癌单克隆抗体与化疗药物的联合用药组合。本研究的示意图如下所示： 图1.

<table><tbody><tr><td>细胞增殖检测试剂盒（MTT）</td><td>Roche</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>CompuSyn 软件</td><td>ComboSyn</td><td></td><td>CompuSyn 可在 http://www.combosyn.com 免费下载</td></tr><tr><td>电动剃须刀</td><td>Bioseb</td><td>BIO-1556</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVFF00-01</td><td>RPMI 1640 培养基中含 10% 经热灭活的胎牛血清</td></tr><tr><td>Firefox&amp;nbsp;</td><td>Mozilla Corporation</td><td></td><td>Firefox 可在 http://www.mozilla.org/en-US/firefox/ 免费下载</td></tr><tr><td>加热灯</td><td>Verre&amp;Quartz</td><td>4003/1R</td><td></td></tr><tr><td>人神经母细胞瘤 IMR-5 细胞系</td><td>Accegen Biotechnology</td><td>ABC-TC0450</td><td>IMR-5 是人神经母细胞瘤细胞系 IMR32 5459762 的一个克隆。IMR-5 细胞由法国巴黎 U.872 的 Santos Susin 博士慷慨提供</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td>RPMI 1640 培养基中含 2 mM L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>裂解液&amp;nbsp;</td><td>Roche&amp;nbsp;</td><td>11-465-007-001</td><td></td></tr><tr><td>mAb 8B6</td><td>南特大学</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354248</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan FC</td><td>Thermofischer Scientific&amp;nbsp;</td><td>N08625</td><td></td></tr><tr><td>21G 1 &amp;frac12;&amp;nbsp;针头</td><td>BD Microlance</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>25G 1 针头</td><td>Terumo</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>NSG 小鼠</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 孔微孔板</td><td>Thermofisher</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>L182-10</td><td></td></tr><tr><td>含 0.05% EDTA 的 PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>运行 Windows 7 操作系统的个人电脑</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Windows 7 可在 http://www.microsoft.com/en-gb/software-download/windows7 购买</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>RPMI 1640 培养基中含 100 单位/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素</td></tr><tr><td>试剂储液槽</td><td>Thermofischer Scientific</td><td>8094</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物固定器</td><td>Bioseb</td><td>TV-150-SM</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>拓扑替康</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2705</td><td></td></tr></tbody></table>

增强抗肿瘤药物对抗癌抗体疗效的协同作用：利用联合指数方程检测抗体-药物协同效应

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

通过化疗药物增强具有细胞毒性的单克隆抗体（mAb）的疗效，是设计高效且安全抗癌治疗方案的重要策略。本文提供了一种在临床前阶段筛选合理药物组合的实验方案。首先，我们描述了一种基于细胞的检测方法，用于评估抗肿瘤单克隆抗体与细胞毒性药物之间的协同作用，该方法采用Chou和Talalay的联合指数方程进行分析。1包括使用MTT法测定肿瘤细胞对药物和抗体的敏感性，随后通过计算机自动分析计算联合指数（CI）值。CI值小于 &lt;1 表明所测试的单克隆抗体与细胞毒药物之间存在协同作用1. 为了证实这一点 体外 研究结果 体内我们进一步描述了一种在异种移植肿瘤模型中评估联合用药方案疗效的方法。在该模型中，联合用药方案显著延缓了肿瘤生长，与单药对照组相比，显著延长了生存期。重要的是，该 体内 实验结果表明，该联合用药方案耐受性良好。本方案可有效评估抗癌药物组合在临床前模型中的效果，并筛选出合理的药物组合，用于后续临床试验的评价。

代表性结果和图示经许可改编自先前发表的研究14。
抗O-乙酰化GD2单克隆抗体8B6协同增强拓扑替康对神经母细胞瘤细胞系生长的抑制作用：
为确定用于评估拓扑替康与单克隆抗体8B6之间协同作用的药物和抗体浓度，首先采用MTT法检测人IMR5神经母细胞瘤细胞对药物和抗体的敏感性。单独暴露于单克隆抗体8B6或拓扑替康72小时后，IMR5细胞活力均呈浓度依赖性抑制（图 4A。剂量-反应曲线可用于计算ED50 每个化合物的数值。为此，使用分析模拟软件计算了Fa值。计算得到的ED50 发现拓扑替康的值为 10 nM ± 1<strong class="xfig"...

本方案描述了如何通过使用Chou和Talalay的联合指数方程，在临床前模型中评估抗癌抗体与抗肿瘤药物之间的协同作用。

化疗药物增强具有细胞毒性的单克隆抗体（mAb）的疗效，是一种设计高效且更安全治疗方案的重要策略……

免疫治疗联合化疗是一种开发高效癌症治疗方案的创新方法。其主要目标是实现协同治疗效应、降低药物剂量与毒性，并最小化或延缓耐药性的产生。然而，由于实际和伦理原因，无法在患者中直接确定药物协同作用。因此，在开展临床试验前，应先进行体外和/或动物水平的预临床联合研究，以获得支持临床研究的理论依据。一种简单且可靠的药物协同作用定量方法基于Shouan Talalay提出的联合指数方程，本视频将对此进行演示。利用该方法及其计算机模拟，我们在此证明了针对O-乙酰化GD2神经节苷脂神经母细胞瘤抗原的单克隆抗体8B6与化疗药物拓扑替康在神经母细胞瘤细胞中的协同作用。简要而言，在测定各化合物对人IMR-5神经母细胞瘤细胞系的50%有效剂量（ED50）后，将这两种化合物按等比比例共同处理细胞，并通过自动化计算机模拟计算联合指数值。随后，我们在IMR-5肿瘤异种移植小鼠模型中验证了这些结果。在T75培养瓶中培养IMR-5细胞，并在显微镜下观察细胞融合度。从培养瓶中吸除培养基，用5 mL PBS洗涤。加入3 mL 0.05% EDTA/PBS溶液。将培养瓶放回培养箱中孵育3分钟。在显微镜下检查细胞脱落情况。向培养瓶中加入10 mL完全培养基，将细胞悬液转移至无菌的15 mL锥形管中。以300 g离心5分钟。使用血细胞计数板计数细胞。弃去上清液。将细胞重悬于完全生长培养基中。调整培养基体积，使细胞终浓度为100,000个细胞/mL。向96孔板的84个孔中每孔接种10,000个细胞，即每孔加入100微升细胞悬液。将细胞在细胞培养箱中孵育18小时。将单克隆抗体用500微升完全生长培养基稀释，配制终浓度为240微克/毫升的工作液。按照实验方案进行5次两倍系列稀释。将药物用500微升完全生长培养基稀释，配制终浓度为120纳摩尔的工作液。按照实验方案进行5次两倍系列稀释。以相同方式对药物与单克隆抗体的混合溶液进行稀释。根据实验设计图示，向相应孔中加入50微升各药物溶液，以达到终浓度。将细胞在培养箱中孵育72小时。每孔加入10微升MTT试剂溶液。在37摄氏度下孵育4小时。使用多通道移液器向每孔加入100微升裂解液，并通过反复吹打充分混匀。在37摄氏度、湿润环境中孵育4小时。使用分光光度计测定570和620纳米处的吸光度。按如下方法计算细胞存活率。使用以下公式计算受影响分数（FA）值。运行模拟软件，点击“新建实验”按钮进入主界面。输入实验名称。点击“新建单药”。输入药物名称。输入缩写。输入药物浓度单位。输入第一组剂量及FA值。按回车键。重复此步骤直至所有数据点输入完毕。点击“完成”。以相同步骤输入单克隆抗体的数据点。点击“新建药物组合”。选择药物和单克隆抗体。选择“恒定比例”。点击“确定”。输入组合名称。输入缩写。输入药物与单克隆抗体的比例。输入第一组剂量。按回车键。程序将自动计算单克隆抗体8B6及组合中的各剂量。输入第一组FA值。按回车键。重复此步骤直至所有数据点输入完毕。点击“完成”。然后点击“生成报告”。选择药物和单克隆抗体，点击“确定”。选择“组合”，点击“确定”。选择“标题”、“CI表”和“汇总表”，点击“确定”。输入文件名和分析名称，点击“保存”以生成报告。报告将在默认网页浏览器中自动打开。报告包含一个汇总表部分，其中包括标题、日期、最终名称、描述性备注、m、Dm和r参数、各药物单独使用或联合使用时的50%有效剂量，以及在50%、75%、90%和95%有效剂量下的联合指数表。联合指数小于1表示协同作用；等于1表示相加作用；大于1表示拮抗作用。使用前将基底膜基质小瓶置于冰上，在4摄氏度冰箱中过夜解冻。所有接触基底膜基质的培养器皿或培养基均需预先冷却。收获IMR-5细胞培养物。将细胞转移至15 mL锥形管中，以300 g离心5分钟。弃去上清液。用15 mL预冷PBS洗涤细胞两次。用预冷PBS配制每毫升含500万个细胞的细胞悬液。将细胞悬液转移至1.5 mL微量离心管中。轻轻旋转基底膜基质小瓶。加入等体积的基底膜基质试剂，通过吹打混匀，获得每毫升含250万个细胞的细胞悬液。将细胞悬液置于冰上保持低温。剃除将要注射部位的 flank 区域毛发。混匀细胞后，小心将细胞悬液吸入装有21号针头的1 mL注射器中。检查确认注射器内无气泡。用消毒液对小鼠接种区域进行消毒。在注射部位，用手指轻轻捏住小鼠 flank 处皮肤。将针头准确插入皮肤皱褶中。注意不要将针头深入组织，以确保为皮下注射。皮下注射100微升IMR-5细胞悬液。旋转注射器以防止液体扩散，然后拔出针头。监测小鼠体重及肿瘤生长情况。使用游标卡尺测量肿瘤的长径和短径。使用以下公式计算肿瘤体积。当肿瘤平均体积达到50至60 mm³时开始治疗

potentiation-anticancer-antibody-efficacy-antineoplastic-drugs

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科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

抗肿瘤药物对抗癌抗体疗效的潜力: 用组合指数方程检测抗体-药物协同作用

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高通量、实时、双读数检测细胞内抗菌活性与真核细胞毒性

协同药物组合通过实验方法鉴定往往困难且耗时。本文中，我们描述了一种用于鉴定和验证协同作用小分子的方法。...

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在本方案中，我们描述了如何基于Loewe可加性进行成对及三联药物组合的药物相互作用测定。...

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