Name: 用微计算机断层扫描法对无节段3D 组织学进行固定染色、全尺寸、毫米度试样的刚性嵌入 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-17T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: 学习使用丙烯酸树脂和聚酰亚胺管对毫米级生物样本进行刚性包埋的技术，适用于斑马鱼、果蝇和水蚤等模式生物。该方法支持长期保存和多次微计算机断层扫描成像，为发育生物学和组织学研究提供稳定的三维组织学数据。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨此感谢 Roland Myers 慷慨提供原始的透射电子显微镜（TEM）实验方案。此外，我们还要感谢 John Colbourne 博士提供 Daphnia 标本，Santhosh Girirajan 博士提供 Drosophila 标本，以及 Fadia Kamal 博士提供小鼠胚胎。本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）（项目编号：1R24OD18559-01-A2，项目负责人：KCC）、Jake Gittlen 癌症研究中心、宾夕法尼亚州立大学哈克生命科学研究所和网络科学研究所的前期研究资助项目的资金支持。

所有涉及活体动物的操作均经宾夕法尼亚州立大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 第1天：固定
<ol>
	<li>为提高固定效果并减少肠道内容物的体积，对10 mm的幼鱼至少禁食24小时；对于更大的标本，则需更长时间（例如，14 mm标本禁食72小时）。</li>
	<li>将10%中性缓冲福尔马林（NBF）和2×三卡因-S（MS-222，400 mg/L）预冷至冰上4 °C。</li>
	<li>用预冷的2× MS-222溶液将鱼所处水体体积加倍，以实现快速且人道的安乐死。</li>
	<li>在鱼停止活动后，等待30秒（幼体）至60秒（幼鱼）。</li>
	<li>将鱼浸入预冷的10% NBF中固定10分钟。</li>
	<li>将鱼置于平底容器中，在室温下用预冷的10% NBF溶液固定过夜。 
	注意：必须使用平底容器以尽量减少标本弯曲。除非另有说明，所有后续步骤中固定液及其他溶液的体积应至少为样品体积的20倍。对于1–5条斑马鱼幼体，建议溶液体积至少为1 mL。固定液不足会导致固定效果不佳，而试剂体积过量不会对本方案的结果产生负面影响。对于较大的鱼，为实现完全固定，应从肛孔稍前方开始沿腹部切开。剪切时使用剪刀或刀具轻微刺入，并在远离鱼体的方向施加轻柔力量，以尽量减少对内脏器官的损伤。其他研究者已描述过相关固定方案31,32,33。</li>
</ol>
2. 第2天：脱水 &amp;#38; 染色
<ol>
	<li>用 pH 7.4 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）将固定后的样本冲洗 3 次，每次 10 分钟。</li>
	<li>将样本浸入 35% 乙醇（EtOH）中，在室温下轻轻振荡 20 分钟。 
	注意：所有需要轻轻振荡的步骤均使用台式摇床，调节至混合效果，同时小心避免样本与容器表面发生碰撞或摩擦。</li>
	<li>将样本浸入 50% EtOH 中，在室温下轻轻振荡 20 分钟。</li>
	<li>将磷钨酸（PTA）粉末溶于水中，配制 1% w/v 的储备液。</li>
	<li>将 1% PTA 储备液按 3:7 的比例用 100% EtOH 稀释，得到 0.3% PTA 染色液。</li>
	<li>在室温下用 0.3% PTA 染色液对样本染色过夜，并保持轻轻振荡。</li>
</ol>
3. 第3天：浸润
<ol>
	<li>配制体积比为1:1的100%乙醇与LR White丙烯酸树脂混合液，备用。</li>
	<li>用70%乙醇漂洗3次，每次10分钟。</li>
	<li>将样品浸入90%乙醇中，在室温下轻轻振荡处理30分钟。</li>
	<li>将样品浸入95%乙醇中，在室温下轻轻振荡处理30分钟。</li>
	<li>将样品浸入100%乙醇中两次，每次在室温下轻轻振荡处理30分钟。</li>
	<li>将样品浸入1:1的乙醇与LR White丙烯酸树脂混合液中，在室温下轻轻振荡过夜。</li>
</ol>
4. 第4天：包埋
<ol>
	<li>将样品浸入100% LR White树脂中，在室温下轻轻振荡处理2小时。</li>
	<li>将步骤4.1中的树脂更换为新鲜的100% LR White树脂，于室温下轻轻振荡孵育1小时。</li>
	<li>组装包埋装置（图1).</li>
	<li>剪裁适当直径和长度的聚酰亚胺管。 
	注意：建议使用内径比样本直径至少大 0.1 mm 的套管。对于典型样本，每个样品使用标准长度为 30 mm 的套管。如需要，可通过使用更长的套管来容纳较长的样本。
	<ol>
		<li>将P1000移液器连接至包埋适配器的宽端，并将聚酰亚胺管插入适配器的窄端（图1C）。如果无包埋适配器，请转至步骤 4.3.3；否则，继续至步骤 4.4。</li>
		<li>将微量移液器吸头末端横向剪断，使聚酰亚胺管能够紧密贴合。从200 µL黄色微量移液器吸头宽端起44 mm处剪断，适用于0.0403&#34; 管路以及1 mL蓝色吸头底部向上59 mm处，用于0.105&#34; 管路。根据需要进行裁剪。</li>
		<li>将剪断的微量移液器吸头连接到微量移液器上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将样品转移至小型称量舟或V形溶液皿中，并用100% LR White树脂完全浸没样品。</li>
	<li>使用4.3步骤中的包埋装置，将套管对准固定样品的宽端（对于动物标本则对准头部方向），缓慢用移液器将样品注入套管中。将样品置于套管中央，并确保样品上下两端的套管内均充满树脂。
	<ol>
		<li>将样品用移液器加入管路中，确保样品沿自然的正向流动。 
		注意：缓慢移液可避免因标本与管壁摩擦而产生的气泡及标本损伤。液体回流进入管内时，可能轻易损伤末端结构（如肢体、翅膀、鳍等）。 等等建议在包埋装置中留出一些树脂溢出，以便在后续取出时空气不会进入管路中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>立即用油性软质雕塑粘土密封开口端。
	<ol>
		<li>将黏土压成厚度为1毫米的薄片。</li>
		<li>用食指和中指固定管道。</li>
		<li>用拇指将黏土缓慢按压在管端。</li>
		<li>去除多余的黏土。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从移液管上取下包埋装置。</li>
	<li>通过轻柔旋转拔出导管，并用黏土封住另一端。
	<ol>
		<li>用手指抵住密封端，以防止黏土被挤出。</li>
		<li>缓慢地将未封口的管端插入黏土中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将管子水平放置，在 65 °C 下聚合树脂 24 小时。 
	注意：水平放置可避免聚合过程中样本移动。如果在步骤4.8中残留少量空气，可略微抬高含气泡的一端，以防止气泡向样本方向移动。但需注意，聚合期间过度抬高可能导致样本因重力作用向较低一端滑落。图中展示了正确包埋的样本与含气泡样本的对比，应避免出现气泡，因为空气/树脂界面的折射会影响成像质量（图2).</li>
</ol>
5. 第5天：收集
<ol>
	<li>在第5天结束时收集样本用于图像采集。 
	注意：成像时可移除聚酰亚胺管，但并非必需。斑马鱼样本的同步辐射显微CT成像在美国伊利诺伊州莱蒙特的阿贡国家实验室先进光子源（APS）2-BM线站完成。对于PTA染色的斑马鱼样本，确定最佳X射线能量范围为5–30 keV，成像时采用13.8 keV的X射线能量。在180度范围内（每0.12度采集一幅投影图像），以2048×2048像素的相机共采集1501幅投影图像。此外，还采集了两幅平场（增益）图像（分别在采集开始和结束时）和一幅暗场图像。平场与暗场校正、环形伪影抑制及图像重建均使用开源的TomoPy工具包34完成。PTA染色的Daphnia和Drosophila样本在X射线显微镜上进行成像12,35。具体的显微CT参数设置取决于样本本身及染色质量。例如，Drosophila样本的扫描条件为40 kVp、74 mA、15 s，体素分辨率为3.10 × 3.10 × 3.10 µm3。</li>
</ol>

<ol><li>Cheng, K. C., Katz, S. R., Lin, A. Y., Xin, X., Ding, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-organism+cellular+pathology%3A+a+systems+approach+to+phenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Whole-organism cellular pathology: a systems approach to phenomics.</a> Advances in Genetics. 95, 89-115 (2016).</li>
<li>Cheng, K. C., Xin, X., Clark, D., La Riviere, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-animal+imaging%2C+gene+function%2C+and+the+zebrafish+phenome+project%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Whole-animal imaging, gene function, and the zebrafish phenome project.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 620-629 (2011).</li>
<li>Vågberg, W., Larsson, D. H., Li, M., Arner, A., Hertz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+phase-contrast+tomography+for+high-spatial-resolution+zebrafish+muscle+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">X-ray phase-contrast tomography for high-spatial-resolution zebrafish muscle imaging.</a> Scientific Reports. 5, 16625(2015).</li>
<li>Bruneel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+zebrafish+dentition%3A+from+traditional+approaches+to+emerging+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Imaging the zebrafish dentition: from traditional approaches to emerging technologies.</a> Zebrafish. 12 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Charles, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+quantitative+micro-computed+tomographic+analysis+in+zebrafish+to+define+gene+function+during+skeletogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis.</a> Bone. 101, 162-171 (2017).</li>
<li>Silvent, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+skeleton+development%3A+High+resolution+micro-CT+and+FIB-SEM+block+surface+serial+imaging+for+phenotype+identification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zebrafish skeleton development: High resolution micro-CT and FIB-SEM block surface serial imaging for phenotype identification.</a> PLoS One. 12 (12), e0177731(2017).</li>
<li>Hur, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT-based+phenomics+in+the+zebrafish+skeleton+reveals+virtues+of+deep+phenotyping+in+a+distributed+organ+system%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">MicroCT-based phenomics in the zebrafish skeleton reveals virtues of deep phenotyping in a distributed organ system.</a> eLife. 6, e26014(2017).</li>
<li>J, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+imaging+of+a+hypercholesterolemic+female+zebrafish+by+using+synchrotron+X-ray+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Whole-body imaging of a hypercholesterolemic female zebrafish by using synchrotron X-ray micro-CT.</a> Zebrafish. 12 (1), 11-20 (2015).</li>
<li>Hasamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+tea+extract+suppresses+adiposity+and+affects+the+expression+of+lipid+metabolism+genes+in+diet-induced+obese+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Green tea extract suppresses adiposity and affects the expression of lipid metabolism genes in diet-induced obese zebrafish.</a> Nutrition and Metabolism. 9 (1), 73(2012).</li>
<li>Meguro, S., Hasumura, T., Hase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Body+fat+accumulation+in+zebrafish+is+induced+by+a+diet+rich+in+fat+and+reduced+by+supplementation+with+green+tea+extract%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Body fat accumulation in zebrafish is induced by a diet rich in fat and reduced by supplementation with green tea extract.</a> PLoS One. 10 (3), e0120142(2015).</li>
<li>Dyer, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+mesoscale+neuroanatomy+using+X-ray+microtomography%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Quantifying mesoscale neuroanatomy using X-ray microtomography.</a> eNeuro. 4 (5), (2017).</li>
<li>Busse, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+virtual+histology+enabled+through+cytoplasm-specific+X-ray+stain+for+microscopic+and+nanoscopic+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional virtual histology enabled through cytoplasm-specific X-ray stain for microscopic and nanoscopic computed tomography.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 115 (10), 2293-2298 (2018).</li>
<li>Perilli, E., Parkinson, I. H., Reynolds, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+examination+of+human+bone%3A+from+biopsies+towards+the+entire+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Inst+Super+Sanita%22%5BJournal%5D)">Micro-CT examination of human bone: from biopsies towards the entire organ.</a> Ann Inst Super Sanita. 48 (1), 75-82 (2012).</li>
<li>Watz, H., Breithecker, A., Rau, W. S., Kriete, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-CT+of+the+human+lung%3A+imaging+of+alveoli+and+virtual+endoscopy+of+an+alveolar+duct+in+a+normal+lung+and+in+a+lung+with+centrilobular+emphysema+-+initial+observations%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Micro-CT of the human lung: imaging of alveoli and virtual endoscopy of an alveolar duct in a normal lung and in a lung with centrilobular emphysema - initial observations.</a> Radiology. 236 (3), 1053-1058 (2005).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+developmental+biology%3A+A+versatile+tool+for+high-contrast+3D+imaging+at+histological+resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">MicroCT for developmental biology: A versatile tool for high-contrast 3D imaging at histological resolutions.</a> Developmental Dynamics. 238 (3), 632-640 (2009).</li>
<li>Metscher, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroCT+for+comparative+morphology%3A+simple+staining+methods+allow+high-contrast+3D+imaging+of+diverse+non-mineralized+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Physiology%22%5BJournal%5D)">MicroCT for comparative morphology: simple staining methods allow high-contrast 3D imaging of diverse non-mineralized animal tissues.</a> BMC Physiology. 9, 11(2009).</li>
<li>Pauwels, E., Van Loo, D., Cornillie, P., Brabant, L., Van Hoorebeke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exploratory+study+of+contrast+agents+for+soft+tissue+visualization+by+means+of+high+resolution+X-ray+computed+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">An exploratory study of contrast agents for soft tissue visualization by means of high resolution X-ray computed tomography imaging.</a> Journal of Microscopy. 250 (1), 21-31 (2013).</li>
<li>Kün-Darbois, J. D., Manero, F., Rony, L., Chappard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contrast+enhancement+with+uranyl+acetate+allows+quantitative+analysis+of+the+articular+cartilage+by+microCT%3A+Application+to+mandibular+condyles+in+the+BTX+rat+model+of+disuse%5BTitle%5D)+AND+%22Micro%22%5BJournal%5D)">Contrast enhancement with uranyl acetate allows quantitative analysis of the articular cartilage by microCT: Application to mandibular condyles in the BTX rat model of disuse.</a> Micro. 97, 35-40 (2017).</li>
<li>Tang, S. Y., Vashishth, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-invasive+in+vitro+technique+for+the+three-dimensional+quantification+of+microdamage+in+trabecular%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">A non-invasive in vitro technique for the three-dimensional quantification of microdamage in trabecular.</a> Bone. 40 (5), 1259-1264 (2007).</li>
<li>Elliott, J. C., Dover, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microtomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">X-ray microtomography.</a> Journal of Microscopy. 126 (Pt 2), 211-213 (1982).</li>
<li>Johnson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virtual+histology+of+transgenic+mouse+embryos+for+high-throughput+phenotyping%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping).</a> PLoS Genetics. 2 (4), e61(2006).</li>
<li>Larsson, D. H., Vågberg, W., Yaroshenko, A., Yildirim, A. Ö, Hertz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+short-exposure+small-animal+laboratory+x-ray+phase-contrast+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-resolution short-exposure small-animal laboratory x-ray phase-contrast tomography.</a> Scientific Reports. 6, 39074(2016).</li>
<li>Pleissis, A., Broeckhoven, C., Guelpa, A., Roux, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+x-ray+micro-computed+tomography%3A+a+user+guideline+for+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22GigaScience%22%5BJournal%5D)">Laboratory x-ray micro-computed tomography: a user guideline for biological samples.</a> GigaScience. 5, 1011(2017).</li>
<li>Wong, M. D., Spring, S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+stabilization+of+tissue+for+embryo+phenotyping+using+micro-CT+with+iodine+staining%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Structural stabilization of tissue for embryo phenotyping using micro-CT with iodine staining.</a> PLoS One. 8 (12), e84321(2013).</li>
<li>Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, L. P., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+pipeline+for+anatomical+phenotyping+of+mouse+embryos+using+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-CT.</a> Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).</li>
<li>Hsu, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+microCT+imaging+of+mouse+development+from+early+post-implantation+to+early+postnatal+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional microCT imaging of mouse development from early post-implantation to early postnatal stages.</a> Developmental Biology. 419 (2), 229-236 (2017).</li>
<li>Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+epoxy+resin+embedding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Improvements in epoxy resin embedding methods.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 409-414 (1961).</li>
<li>Hayat, M. A., Giaquinta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+fixation+and+embedding+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapid fixation and embedding for electron microscopy.</a> Tissue Cell. 2 (2), 191-195 (1970).</li>
<li>Handschuh, S., Baeumler, N., Schwaha, T., Ruthensteiner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+correlative+approach+for+combining+microCT%2C+light+and+transmission+electron+microscopy+in+a+single+3D+scenario%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Zoology%22%5BJournal%5D)">A correlative approach for combining microCT, light and transmission electron microscopy in a single 3D scenario.</a> Frontiers in Zoology. 10, 44(2013).</li>
<li>Bushong, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+microscopy+as+an+approach+to+increasing+accuracy+and+efficiency+of+serial+block-face+imaging+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">X-ray microscopy as an approach to increasing accuracy and efficiency of serial block-face imaging for correlated light and electron microscopy of biological specimens.</a> Microscopy and Microanalysis. 21 (1), 231-238 (2015).</li>
<li>Tsao-Wu, G. S., Weber, C. H., Budgeon, L. R., Cheng, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose-embedded+tissue+arrays+for+histologic+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Agarose-embedded tissue arrays for histologic and genetic analysis.</a> Biotechniques. 25 (4), 614-618 (1998).</li>
<li>Sabaliauskas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+zebrafish+histology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput zebrafish histology.</a> Methods. 39 (3), 246-254 (2006).</li>
<li>Copper, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+fixation+and+embedding+techniques+for+optimized+histological+preparation+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of fixation and embedding techniques for optimized histological preparation of zebrafish.</a> Comparative Biochemistry and Physiology. 208, 38-46 (2018).</li>
<li>Gürsoy, D., De Carlo, F., Xiao, X., Jacobsen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TomoPy%3A+a+framework+for+the+analysis+of+synchrotron+tomographic+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Synchrotron+Radiat%22%5BJournal%5D)">TomoPy: a framework for the analysis of synchrotron tomographic data.</a> J Synchrotron Radiat. 21 (Pt 5), 1188-1193 (2014).</li>
<li>Merkle, A. P., Gelb, J. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/services/aop-cambridge-core/content/view/D51E7CBC17A920747A14E277DD8E6395/S1551929513000060a.pdf/div-class-title-the-ascent-of-3d-x-ray-microscopy-in-the-laboratory-div.pdf">The ascent of 3D X-ray microscopy in the laboratory.</a> Microscopy Today. 21 (2), 10-15 (2013).</li>
<li>Thomas, G. K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22A+molecular+and+systems+biology+analysis+of+pleiotropic+vertebrate+phenotypes+%28Doctoral+%29%22">A molecular and systems biology analysis of pleiotropic vertebrate phenotypes (Doctoral dissertation)</a>. , Retrieved from the Penn State Electronic Theses and Dissertations Database (2009).</li>
<li>Walton, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characterisation+of+unstained+and+intact+tissue+micro-architecture+by+X-ray+computed+micro-+and+nano-+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Morphological characterisation of unstained and intact tissue micro-architecture by X-ray computed micro- and nano- tomography.</a> Scientific Reports. 5, 10074(2015).</li>
</ol>

所有作者均声明不存在利益冲突。

本文中，我们介绍了一种用于微计算机断层扫描（micro-CT）成像的、对固定并染色的毫米级（直径0.5至2.5 mm）样本进行刚性固定的详细实验方案。鉴于micro-CT技术在分辨率和成像速度方面的迅速发展，一种能够长期保存样本并支持重复成像的方法显得尤为理想。传统上，电子显微镜中常使用高密度包埋树脂，以提供结构支撑，便于切出超薄切片，并最大限度减少对样本的损伤。本方法借鉴了该技术，用于在无损成像过程中实现样本的刚性固定。为尽量减少因过量树脂存在而引起的成像伪影，我们采用X射线透明的聚酰亚胺管来制备无边缘的圆形样本，并限制树脂在样本周围的体积。
包埋过程的最佳结果取决于对若干关键步骤的仔细操作，并在整个过程中注意保持样品的完整性。事实上，若在操作中损坏了标本，无论成像执行得多么成功，最终图像质量都将受到影响。由于低温有助于减轻疼痛反应，且未固定的组织在较高温度下会更快降解，因此我们使用预先冷却的试剂。较大的标本可能需要切割，以便固定剂能够进入标本内部，从而使肝脏、胰腺和肠道等内部器官得到完全固定。未固定的组织会迅速退化并丧失结构完整性，破坏生物学结构。另一个关键步骤是保持标本处于其自然对齐状态。因此，我们推荐使用平底容器，该类容器在整个操作过程中均被采用，尤其在固定阶段尤为重要。应避免使用聚丙烯管或通常具有V形底部的锥形管进行固定，因为这类容器可能导致较长的样本发生弯曲，从而扭曲标本的天然形态。此外，为尽量减少树脂的使用量，聚酰亚胺管的内径仅略大于标本的宽度。标本弯曲还可能在进入管材时造成损伤。建议以自然向前的方式将标本转移至管中，以避免损伤末端结构。充分脱水是另一个关键步骤。该过程通过逐步增加乙醇（EtOH）浓度的小幅梯度来实现，以缓慢地用水溶性更佳的乙醇替代组织中的水分。乙醇浓度的大幅跃升会导致组织收缩，可通过增加乙醇孵育梯度使浓度过渡更加平缓，从而缓解此问题。最后，为尽量减少标本移动或气泡的存在（如有），在树脂聚合期间（第4天结束时）将样品水平放置。若气泡或密封材料紧邻标本，在X射线成像中会引起边缘衍射相关的光学伪影，降低图像质量。
关于该方案可能的修改，可分别使用其他包埋树脂和金属染色剂替代LR White丙烯酸树脂和PTA。Embed812是一种常用于电子显微镜的环氧树脂，其黏度较高，转移较为困难，可能导致样品变形，并且与丙烯酸或乙二醇甲基丙烯酸酯类树脂相比背景信号更高。JB4 Plus是一种乙二醇甲基丙烯酸酯树脂，其黏度低于Embed812且背景信号较低，但样品周围常出现随机的气泡空腔。如前所述，气泡会降低图像质量，对于珍贵样品尤为不利。值得注意的是，另一种乙二醇甲基丙烯酸酯树脂Technovit 7100会干扰PTA染色，导致最终图像对比度较差。相比之下，LR White丙烯酸树脂具有类似水的黏度、背景信号低，且不干扰PTA染色。在我们的实验中，使用LR White进行包埋且不造成样品损伤或产生气泡的成功率超过95%。基于上述原因，我们推荐将LR White作为组织微计算机断层扫描（micro-CT）的包埋树脂。关于染色剂方面，四氧化锇、碘和PTA等不同金属染色剂在micro-CT成像中的效果已有其他研究进行比较和讨论15,16,17，不在本论文的讨论范围之内。
样本量是当前方案的主要局限性。由于我们采用负压吸引的方式将标本转移至导管内，因此能否观察到标本对于定位以及确认标本确实进入导管至关重要。因此，亚毫米级的样本，例如 缓步动物 (即，水熊）极难包埋，因为需要使用显微镜才能观察。一旦施加负压，显微样本极易偏离焦平面，难以重新定位，因此难以判断其是否已过度穿过导管的附着端。对于较大样本（如小鼠胚胎，3 - 10 mm），可通过略微修改包埋方案进行包埋图 4D）。具体而言，先将聚酰亚胺管填充至三分之一体积的液态树脂，并在包埋前进行预聚合。将固定并染色的样品置于预聚合的树脂上方，随后用未聚合的树脂完全填充聚酰亚胺管，再进行第二次聚合。
我们的包埋方案具有多重重要意义。刚性固定的完整动物或组织样本之所以理想，原因包括：（1）建立难以生成或制备的样本的长期保存库；（2）实现数据的重新获取；（3）支持使用多种成像模式进行连续成像；（4）为校准和技术创新提供标准样本。采用本方案制备的样本被包裹在坚固耐损的树脂中，因此可长期稳定保存，甚至可能无限期储存。长期保存对于稀有或制备耗时的样本尤为重要，例如与表型组学项目相关的样本。此外，若数字数据丢失，仍可从原始样本重新生成数据。长期重复成像的能力意味着未来可利用更先进的成像技术对同一样本进行再次检测。由于样本在多次成像之间保持物理稳定性，每次成像均来自同一标本且方向一致，从而便于前后数据集之间的图像配准。例如，低分辨率图像可能仅能实现斑马鱼幼体中组织的分割，而同一幼体后续可在更高分辨率下重新成像，以实现细胞水平的更详细计算分析。这种对配准扫描结果进行直接比较的能力，提示树脂包埋样本有望成为微计算机断层扫描（micro-CT）技术开发的潜在标准。通过成像同一样本，可评估成像方法任何改动的影响，从而在样本制备步骤中控制所有变量。最后，树脂包埋的标准样本还可用于仪器校准，以检验成像结果的一致性。
我们先前对突变体和患病鱼类组织学的研究表明，细胞分辨率能够检测到组织结构中的细微异常，而这些异常在使用解剖显微镜36或低倍体视显微镜进行大体检查时容易被忽略。我们希望将高分辨率分析方法扩展至人类样本。斑马鱼幼体是本研究开发工作的主要对象，其在脆弱性、细胞及细胞间组织异质性、尺寸（直径1-3 mm）和细长形态方面与人类穿刺活检样本相似。基于我们在斑马鱼方面的丰富经验，以及已有研究证明显微CT能够成功对人类组织进行染色和扫描（尽管分辨率较低）37，我们预计本方法将为穿刺活检样本的成像与分析带来额外价值。我们估算，制备一套足以处理最多20个相同条件下样本的试剂盒成本可能低于30美元。采用本嵌入法处理的样本具有抗物理损伤的特性，因而易于运输。低成本和易运输的特点提示有可能从全球各地收集样本，特别是那些难以便捷获取显微CT细胞分辨率成像技术的地区。我们的愿景是，通过穿刺活检样本的高分辨率数字文件（大小范围从0.1 TB到数TB），构建一个人类组织的数字图谱，同时使研究人员能够在所扫描组织的完整三维背景下，优化和提升现有分析流程，实现对细胞和组织结构的定位及定量表征。

表型是生物体可观察到的特征，反映了其遗传背景与环境之间独特相互作用的结果。这些特征可能包括行为、生化、形态、发育和（或）生理特性。重要的是，野生型生物体与基因突变体之间在性状上的差异，可为受影响基因的机制与功能提供关键见解。在形态学方面，组织病理学是细胞水平上评估表型的金标准，但存在机械性假象，且无法实现精确的定量体积分析1。本实验室致力于克服将组织学诊断能力应用于亚微米分辨率下完整组织体积时所面临的技术障碍。
现有技术的调研表明，X射线显微计算机断层扫描（micro-CT）成像可能具备实现毫米尺度全动物三维（3D）组织学所需的理想能力。micro-CT可实现无损、各向同性、三维的可视化，并能够对组织结构进行定量分析1,2。近年来，利用micro-CT对未染色及金属染色的斑马鱼进行三维成像的应用日益广泛，已被用于肌肉、牙齿、骨骼和脂肪组织等多个组织的体积分析3,4,5,6,7,8,9,10。其他模式生物和组织样本也适用于micro-CT成像。例如，已有研究建立了通过同步辐射micro-CT成像小鼠大脑以量化致密介观神经解剖结构的分析流程11。类似地，基于伊红的染色方案已被证明适用于整只小鼠器官的软组织micro-CT成像12。对未染色的人类L3椎骨进行形态计量学分析，以及利用micro-CT对银染人类肺组织进行可视化，均展示了该技术在人类样本中的应用价值13,14。
为了充分发挥微计算机断层扫描（micro-CT）在完整小动物及组织样本形态学表型分析中的巨大潜力，必须克服若干技术障碍，包括通量、分辨率、视场范围、全面的细胞染色以及长期保存等方面的问题。尽管上述每一项因素都至关重要，但本文的重点是优化包埋流程，并附带讨论样本固定与染色方法。由于不同软组织在micro-CT图像中的本征对比度较低，因此重金属染色具有重要价值。已有研究探讨了多种金属染色剂（如四氧化锇、碘、磷钨酸（PTA）和棓氰染料-铬矾）在增强micro-CT成像对比度方面的效果15,16,17。醋酸铀酰也曾被用作骨和软骨micro-CT成像的对比剂18,19。本方案中所采用的PTA可对整条斑马鱼样本中几乎所有组织和细胞实现一致性的染色，所得图像可用于对整个组织体积进行类似组织学的三维研究。
在进行显微CT图像采集时，样品每次旋转不到一度的角度，采集一幅二维（2D）投影图像，并重复该过程直至样品完成180°或360°旋转，从而生成数千幅2D投影图像，用于重建三维体积数据20。在此过程中，样品的任何扰动都会导致相应的2D投影图像无法对齐，从而造成三维体积重建质量差。样品固定是解决该问题的一种方法，目前一些常用策略包括将样品浸入酒精中，或将其包埋于聚丙烯管或微量移液器吸头中的琼脂糖内3,5,15,16,21,22。液体浸泡法并不理想，因为在图像采集过程中，不同成像序列之间可能发生样品移动，导致三维体积重建图像发生偏移23。此外，众所周知，由于化学不稳定以及样品与容器壁接触点因移动而引起的表面磨损，液体保存的组织样品在数月到数年的尺度上物理稳定性较差（基于对固定后的动物和人类组织样品的个人观察）。
为了减少成像过程中样品移动的可能性，可将样品包埋于琼脂糖中24,25,26，但这种方法存在染料扩散至琼脂糖中的风险，从而降低图像对比度26。此外，液体或琼脂糖制备的样品容易受到物理损伤，并且会随时间降解，因此不适合长期保存样品。我们推测，一种可能成功且简便的样品固定方法可借鉴电子显微镜样本处理技术。例如，聚合树脂（如已停产并被EMbed 812取代的EPON 812）常用于提供制备电子显微镜超薄切片所需的硬度27,28。事实上，已有若干X射线成像与电子显微镜的比较研究表明，树脂包埋的样品也可用于X射线显微成像29,30。然而，电子显微镜中的一些标准操作并不能直接适用于显微CT成像。例如，对具有典型树脂块方形边缘的样品或从这些块中切割出的样品进行显微CT成像时，常伴随边缘衍射伪影，可能干扰成像效果。虽然可以通过修整使树脂边缘平滑，但该过程费力且耗时。
尽管电子显微镜中使用多种塑料包埋树脂，但较硬的树脂（如Embed 812）常伴随较高的背景信号，促使我们测试其他替代树脂。我们选择LR White，因其具有低黏度、低收缩率、聚合过程中不易产生气泡以及背景信号较低等优点。为了制备无边缘的样品，并尽量减少样品周围树脂的用量，我们开发了一种在聚合前将液态树脂中的样品吸入聚酰亚胺管中的操作流程。聚酰亚胺因其具有高热稳定性和高X射线透过性而被选用，因此成像时无需去除管材。最后，我们为样品包埋技术设计了一种定制的微量移液器适配器，以可靠地固定聚酰亚胺管并防止移液器污染。该适配器可通过CAD图像文件进行3D打印。综上所述，本文所介绍的样品制备方法旨在使小样品的包埋过程更加简便，实现更强的染色对比度、刚性固定，以及毫米级完整样品的长期保存。

<table><tbody><tr><td>10X 中性缓冲福尔马林</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>磷钨酸</td><td>VWR</td><td>MK282402</td><td></td></tr><tr><td>三卡因-S（MS-222）</td><td>Western Chemical</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>LR White 树脂</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14380</td><td></td></tr><tr><td>聚酰亚胺管（内径 0.04&quot;）</td><td>Nordson Medical</td><td>141-0065</td><td>文中所述确切规格的聚酰亚胺管目前已无法获得，此处提供相近替代品。可根据需求定制不同直径的管材。</td></tr><tr><td>200 证明乙醇</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>油性软质雕塑粘土</td><td>Sculpey</td><td>S302 001</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器 P1000</td><td>Gilson</td><td>F123502</td><td></td></tr><tr><td>玻璃小瓶</td><td>VWR</td><td>66015-042</td><td></td></tr><tr><td>V 形培养皿</td><td>VWR</td><td>89094-676</td><td></td></tr><tr><td>称量舟</td><td>VWR</td><td>10803-148</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;mu;L 黄色移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-500</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 蓝色移液器吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-163</td><td></td></tr><tr><td>台式摇床</td><td>Thermolyne</td><td>M71735</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>Photometrics</td><td>CoolSNAP HQ2 CCD</td><td></td></tr><tr><td>X 射线显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Xradia 520 Versa</td><td></td></tr></tbody></table>

通过显微计算机断层扫描实现固定与染色后毫米级完整样本的刚性包埋，用于无切片三维组织学研究

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

一百多年来，组织的组织学研究一直是医学诊断的金标准，因为组织学能够识别和表征每种组织中的所有细胞类型。我们的实验室正在积极推动X射线显微计算机断层扫描（micro-CT）的技术进步，旨在将组织学的诊断能力应用于全组织体积的细胞分辨率研究即一种X射线组织断层成像模式）。为此，我们对样品制备流程进行了有针对性的改进。其中一项关键优化，也是本研究的重点，是一种用于刚性包埋经固定和染色的毫米级样品的简便方法。目前已发表的许多关于样品固定及关联显微CT成像的方法，依赖于将样品置于石蜡、琼脂糖或酒精等液体中。我们的方法在此基础上进行了拓展，开发了定制化流程，并设计了一种可3D打印的装置，用于将样品直接包埋于聚酰亚胺管内的丙烯酸树脂中，该材料对X射线具有相对较高的通透性。本文所述的样品制备流程适用于直径在0.5至10 mm范围内的样品，适用于完整的斑马鱼幼体和稚鱼，或其他尺寸相似的动物或组织样品。作为概念验证，我们已对来自 斑马鱼, 果蝇, 水蚤以及小鼠胚胎；其中三个样本的三维扫描代表性图像如图所示。重要的是，我们的方法具有多项优势，包括实现刚性固定、长期保存耗费大量人力构建的资源，以及能够对样本进行重复检测。

上述方案详细描述了用于显微CT成像的整条斑马鱼幼体和稚鱼的样品制备流程。值得注意的是，该方法可轻松适用于其他类型的样品（例如，Drosophila、Daphnia、Arabidopsis、小鼠器官）。各步骤中的孵育时间适用于斑马鱼幼体及类似尺寸的样品；较大的样品可能需要更长的孵育时间。为协助样品包埋操作，我们设计了一种可连接到1 mL移液器上的适配器，并可根据不同尺寸的聚酰亚胺管进行定制（图1）。该定制适配器由与本文相关的CAD文件通过3D打印制成，可从 http://publications.chenglab.com/LinEtAlJOVE/ 下载获取。考虑到并非所有读者都能使用3D打印机，本方案中也描述了利用移液器吸头自制包埋装置的组装方法（步骤4.3）。图2展示了成功包埋的斑马鱼幼体与含有气泡的样品的对比，后者可能会降低图像质量。为展示该包埋方法的通用性，我们展示了多种模式生物（即，Danio、Drosophila、Daphnia、小鼠胚胎）经过样品制备流程后的结果（图3）。图4展示了通过显微CT成像获得的整只Danio、Daphnia和Drosophila标本的三维重建图像。重要的是，如Danio样品所示，这些标本可长期保存，并可用于多次成像实验（图5）。
<img alt="光谱比色皿装置；示意图、照片、组装步骤；光学研究、吸收分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1. 包埋装置。 （A）设计了一种适配器，以利用常见的实验工具辅助包埋操作。（B）适配器的横截面示意图。（C）将聚酰亚胺管插入适配器位置（a）并将微量移液管连接至适配器位置（c）后的包埋装置。适配器部分（b）为一个溢流腔，用于容纳多余的树脂，并防止微量移液管受到污染。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜图像，显示流动模式的微流控通道；用于流体动力学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2. 成功包埋的样品中无气泡。 （A）一只无气泡的已包埋受精后3天（dpf）斑马鱼幼体。（B）一只包埋过程中带有气泡的3 dpf斑马鱼。若样品在聚合过程中未水平放置，则包埋时滞留的空气可能移向样品。比例尺 = 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="斑马鱼、果蝇和小鼠胚胎的显微镜图像，展示发育生物学。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图3. 多种多样的样本均可使用本实验方案进行包埋。 （A）7 日龄斑马鱼幼体。（B）成年Drosophila。（C）成年Daphnia。（D）小鼠胚胎。对于小鼠胚胎等较大样本，可通过对该实验方案进行若干修改来实现包埋。简言之，先将聚酰亚胺管填充至其长度的三分之一处，加入树脂并进行预聚合；然后将固定并染色的样本置于预聚合的树脂之上，再向管中加满未聚合的树脂，并进行第二次聚合。为便于在本图中更好地观察样本，成像前已去除聚酰亚胺管；但在进行显微CT成像时，无需去除该管材即可成功获取图像。比例尺：标本图像为 5 mm；放大插图为 1 mm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="果蝇的微尺度三维成像；视觉数据重建，体绘制。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. 包埋样品的三维重建图像。 （A）在0.743 × 0.743 × 0.743 µm3体素分辨率下重建的3天龄斑马鱼幼体。（B）重建的成年Daphnia（3 × 3 × 3 µm3体素分辨率）。（C）重建的成年Drosophila（3.1 × 3.1 × 3.1 µm3体素分辨率）。如左列所示，可在任意角度生成数字横截面。右侧显示的是使用商业软件进行渲染的表面重建图像。在所有扫描图像中，样品外部可见包埋树脂（以*标注），但不影响样品本身。斑马鱼幼体在中国阿贡国家实验室基于同步辐射的先进光子源（Advanced Photon Source）进行成像。Daphnia或Drosophila样品则使用商用X射线显微镜进行成像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="MRI对比分析，图中显示图像A和B、强度图D以及信噪比图表E。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58293/58293fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5. 采用本实验方案包埋的样品可使用显微CT进行重复成像。 同一条5天龄斑马鱼幼体分别于（A）2011年和（B）2013年成像，图像以矢状面的平均强度投影形式呈现。两次扫描在储存后进行图像比对，结果显示解剖结构特征得以良好保存。（C）展示了两次扫描中肌肉区域的局部放大图，其中分段线标示了用于（D）生成强度分布曲线的对应区域。将两条线上的强度分布曲线分别归一化至其对应平均值后，显示两次扫描中空间位置匹配的局部峰值。（E）选取A和B图中属于背景（Bg，紫色）、神经元核（N，绿色）、白质（W，蓝色）和肌肉（M，橙色）区域的平均强度值，除以背景（白色）的平均值，用于计算信噪比（SNR），两次扫描间的信噪比结果高度一致。比例尺 = 100 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58293/58293fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

我们开发了相关方案并设计了一种定制装置，以实现毫米级样本的包埋。本文介绍了样本制备流程，重点阐述了使用丙烯酸树脂和聚酰亚胺管进行包埋的方法，以实现样本的刚性固定和长期保存，从而便于通过显微CT对组织结构和细胞形态进行研究。

一百多年来，组织的组织学研究一直是医学诊断的金标准，因为组织学能够揭示组织中的所有细胞类型……

该方法可使您从小型毫米级样本（包括小型模式生物）中生成三维组织学图像。该技术的主要优势在于，包埋后的样本非常稳定，可长期保存，并能进行多次成像，例如在多年内使用不同的成像方法反复观察。该方法的输出结果将对高通量模式系统表型组学、毒理学研究，甚至人类组织诊断具有重要价值。初学者通常会遇到困难，因为样本相对较小，难以定位或操作。视觉演示至关重要，需要格外注意以避免损伤样本。对于幼年或成年斑马鱼，在固定前应至少禁食24小时，以减少肠道内容物的体积。将预冷至4摄氏度的10%中性缓冲福尔马林（NBF）和2倍浓度的Tricaine-S置于冰上。用预冷的2倍浓度MS-222溶液将鱼水体积加倍，以实现快速且人道的安乐死。在鱼停止活动后60秒，即人道安乐死后，将鱼放入平底玻璃小瓶中，瓶中盛有预冷的10% NBF溶液，并在室温下固定过夜。第二天，用 1x PBS（pH 7.4）将固定的鱼标本冲洗三次，每次 10 分钟。洗涤后，将样品浸入 35% 乙醇中，在室温下轻轻振荡孵育 20 分钟。然后用 50% 乙醇重复此步骤。将样品在新配制的0.3%磷钨酸（PTA）溶液中于室温下轻轻振荡孵育过夜，以进行染色。第三天开始时，配制体积比为1:1的100%乙醇与LR White丙烯酸树脂混合液。将样品在70%乙醇中清洗三次，每次10分钟，随后将样品在室温下用90%乙醇轻轻振荡孵育30分钟。在相同条件下重复孵育，但使用95%乙醇，然后用100%乙醇再重复两次。最后，将样品浸入等体积的乙醇与LR White丙烯酸树脂混合液中，于室温下轻轻振荡孵育过夜。第四天，从瓶中移除混合液，加入100% LR White树脂以完全浸没样品。在室温下轻轻振荡孵育两小时。两小时后，将树脂更换为新鲜的100% LR White树脂，在室温下继续轻轻振荡孵育一小时。组装包埋装置时，使用直径比样品直径至少大0.1毫米的聚甲基丙烯酸甲酯（poly MI）管，并将其切割至30毫米的标准长度。然后将P1000微量移液头连接到包埋适配器的白色末端，并将聚甲基丙烯酸亚乙酯（poly MI）导管插入其狭窄端。样品在100% LR白色树脂中孵育一小时后，将其转移至小型称量舟中，并完全浸入100% LR白色树脂中。将包埋装置的导管对准固定样品的宽端，或朝向头部，缓慢将样本移入导管中。将样品置于管子中央，确保标本上下两端的管内均充满树脂。随后立即用油性软质雕塑粘土密封管子的开口端：先将一小块粘土压成约一毫米厚的薄片，并用食指和中指固定住管子，然后用拇指缓慢将粘土压紧在管口，去除多余的粘土。从微管头部取下包埋装置。通过轻轻旋转将管子抽出。在用手指抵住密封端以防止黏土弹出的同时，将管子的未密封端缓慢推入黏土中，以封闭另一端。将管子水平放置在试管架上，置于烘箱中于 65 摄氏度下使树脂聚合 24 小时。次日结束后，收集样品进行图像采集。成功包埋的斑马鱼幼鱼应无任何被困住的气泡。如果在包埋过程中有空气残留，在聚合过程中若样品未水平放置，空气可能向样本移动，从而降低成像质量。本方案已成功用于多种模式生物的包埋，例如斑马鱼、果蝇、水蚤和小鼠胚胎。通过微计算机断层扫描（micro-CT）对斑马鱼、水蚤和果蝇进行成像，获得重建的三维渲染图像，可证明包埋的成功。在所有扫描图像中，均可观察到样本外部的包埋树脂，但其并不干扰样本本身。这些标本可长期保存，并可用于多次成像实验，例如2011年成像的斑马鱼幼体即展示了此特性。2013年再次进行了扫描。储存后解剖结构特征仍得以保存，如两次扫描中肌肉局部放大图像所示。此外，将沿分段线条的强度分布归一化至各自平均值后，显示两次扫描中的局部峰值在空间上相吻合。两次扫描中选定区域的平均强度值除以背景平均值，用于计算信噪比，两次扫描之间的信噪比结果高度一致。在实施该方法时，需轻柔操作以避免样品损伤，并仔细操作以防止引入气泡。完成此步骤后，可进一步采用组织学或电子显微镜等其他方法，以研究蛋白质表达模式，或在二维层面实现对感兴趣区域的更高分辨率观察。我们希望本出版物能帮助您掌握高分辨率组织显微CT的强大功能。

rigid-embedding-fixed-stained-whole-millimeter-scale-specimens-for

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用微计算机断层扫描法对无节段3D 组织学进行固定染色、全尺寸、毫米度试样的刚性嵌入

只有通过断层扫描技术才能实现无损的体积可视化，其中最有效的方法是X射线显微计算机断层扫描（CT）。...

Ex-Vivo 生物样本的显微CT高分辨率三维成像

我们提出了一种用于三维（3D）组织学体积重建的图像配准方法，该方法有助于在由细胞构成的宏观结构水平上研究器官的变化。利用该方法，我们研究了野生型与Igfbp7基因敲除型乳腺组织之间的三维结构差异。...

三维组织学图像体积重建及其在小鼠乳腺研究中的应用

本方案旨在利用扫描电子显微镜（SEM）对组织中特定细胞进行纳米级分辨率的成像。首先在光学显微镜下对来自树脂包埋生物样品的大量连续切片进行成像，以识别目标区域，随后以逐级放大的方式在扫描电子显微镜中进行成像。...

大体积样本中连续切片的多模态分层成像以定位特定细胞靶标

本文介绍了一种利用专为X射线计算机断层扫描设计的X射线特异性染色方法，对微观组织结构进行三维可视化的实验方案。...

利用X射线特异性染色法与纳米级计算机断层扫描对软组织样本进行三维成像

本文提供了详细、可靠且互补的实验方案，用于对厚度从100...

三维类器官和球状体模型的染色与高分辨率成像

利用聚焦离子束铣削技术，从浸冻的生物样品中制备用于冷冻电子断层扫描的玻璃态原位薄片。...

使用双束扫描电子显微镜制备玻璃态生物样品薄片用于冷冻电子断层扫描

冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术提供了一种无需包埋、切片或其他侵入性制备步骤即可观察完整细胞中细胞器的方法。目前该技术获得的三维分辨率可达数纳米，视场范围为数微米，可观察样品厚度约为 1...

细胞器的可视化 原位 通过冷冻扫描透射电子显微镜断层成像技术

本文描述了一种能够在感染期间实现全器官范围内病原菌检测以及荧光报告基因活性定量的实验方法。...

高分辨率三维全器官微生物感染断层成像

本视频方案演示了如何对病毒学样本进行扫描透射电子显微镜断层成像。为获得最佳结果，样本需通过高压冷冻及后续的冷冻置换方法进行制备。...

病毒学中的扫描透射电子显微镜断层成像：高压冷冻-冷冻置换样品的三维成像

本方案通过整合高压冷冻（HPF）与华夫格法、低温聚焦离子束（cryo-FIB）拾取技术以及剂量对称平行采集，实现了厚组织样品冷冻电子断层扫描（cryo-ET）的标准化，可获得均一厚度的薄片和玻璃化样品，从而实现可重复的 原位...

厚组织冷冻电子断层成像工作流程在小鼠海马体中的应用

学习使用丙烯酸树脂和聚酰亚胺管对毫米级生物样本进行刚性包埋的技术，适用于斑马鱼、果蝇和水蚤等模式生物。该方法支持长期保存和多次微计算机断层扫描成像，为发育生物学和组织学研究提供稳定的三维组织学数据。

通过显微计算机断层扫描实现固定与染色后毫米级完整样本的刚性包埋，用于无切片三维组织学研究

探索更多视频