用微计算机断层扫描法对无节段3D 组织学进行固定染色、全尺寸、毫米度试样的刚性嵌入

我们开发了协议, 并设计了一个定制装置, 以实现毫米级试样的嵌入。我们提出了样品制备程序, 重点是在丙烯酸树脂和聚酰亚胺管中嵌入, 以实现刚性固定化和长期储存标本, 用于审讯组织结构和细胞形态学的显微 CT。

此方法使您能够从小毫米尺度样本（包括小型模型生物体）生成三维组织学图像。此技术的主要优点是嵌入式样本非常稳定，使您能够长时间保留样品，并多次对样本进行成像，例如使用多年来不同的成像方法。这种方法的输出对于高通量模型系统现象学、毒理学，甚至潜在的人体组织诊断都非常有用。

一般来说，由于样品相对较小且难以定位或操纵，因此对这种方法的个体会比较困难。视觉演示至关重要，因为需要注意避免样品损坏。对于幼鱼或年长的斑马鱼，在固定之前至少饿死它们，以减少肠道含量的体积。

将 10%中性缓冲液或 NBF 和 2x 三分素-S 预冷却到 4 摄氏度到冰上。将鱼水体积加倍，使用冷藏2x MS-222，实现快速人道的安乐死。鱼停止移动60秒后，人道安乐死后，将鱼放在冰镇10%NBF溶液中，在室温下放在平底玻璃瓶中，并在夜间修复。

第二天，在1x PBS pH 7.4中冲洗固定鱼标本三次，每次冲洗10分钟。洗涤后，将样品淹没在35%乙醇中，并在室温下用温和的搅拌孵育20分钟。然后用50%乙醇重复此步骤。

在室温下将新鲜准备好的0.3%磷酸或PTA溶液中孵育，并轻轻搅拌以染色。开始第三天，准备100%乙醇和LR白色丙烯酸树脂的一对一体积混合物。在70%乙醇中冲洗样品三次，每次10分钟，然后在室温下将样品孵育为90%乙醇，温和搅拌30分钟。

在相同的条件下重复孵育，但95%乙醇，然后用100%乙醇再重复两次。最后，将样品淹没在一对一乙醇和LR白色丙烯酸树脂混合物中，并在室温下孵育过夜，轻轻搅拌。第四天，从小瓶中去除混合物，加入100%LR白色树脂，将样品淹没。

在室温下孵育两小时，轻轻搅拌。两小时后，用新鲜的100%LR白色树脂更换树脂，并在室温下用温和的搅拌孵育一小时。要组装嵌入装置，请使用直径至少为 0.1 毫米的聚 MI 管，并将其切割为 30 毫米的标准长度。

然后将 P1000 微管头连接到嵌入适配器的白色端，并将聚 MI 管插入其窄端。样品在100%LR白色树脂中孵育一小时后，将其转移到一艘小型称重船上，将其完全淹没在100%LR白色树脂中。将嵌入装置的管子对对在固定样品的宽端或朝向头部，然后缓慢地将试样移入管子中。

将样品放置在油管中间，确保样品上方和下方的管子充满树脂。紧接着，为了密封管子的开端，将一块油基软建模粘土压扁成一块约一毫米厚的薄片，并在食指和中指之间稳定管子。然后用拇指慢慢将粘土压在管子的端端，并去除多余的粘土。

从微管头上拆下嵌入装置。通过轻轻的旋转拉出管子。在用手指对着密封端以防止粘土弹出时，通过缓慢地将未密封的管子端推入粘土中来密封另一端。

将管子水平放在管架上，使树脂在烤箱中 65 摄氏度下聚合 24 小时。在第二天结束时，收集样本以进行图像采集。成功嵌入的斑马鱼幼虫没有气泡捕获。

如果空气在嵌入过程中被捕获，如果在聚合过程中样品未水平放置，则空气可能会向样品移动，从而降低图像质量。该协议成功地嵌入了各种模型生物体。如斑马鱼、果蝇、达芙尼亚和老鼠胚胎。

成功的嵌入可以通过重建的 3D 渲染显示出来，通过微 CT 扫描对斑马鱼、达芙尼亚鱼和果蝇进行成像。在样品外的所有扫描中都可以看到嵌入树脂，但不会干扰样品本身。这些标本可以长期储存，并重复使用用于多次成像，如2011年成像的斑马鱼幼虫所示。

然后在 2013 年再次。解剖特征在储存后保留，从两次扫描的肌肉特写镜头中可以看到。此外，沿分段线与相应平均值规范化的强度剖面显示两次扫描中的空间匹配局部峰值。

两次扫描中选定区域的平均强度值除以背景的平均值，用于生成信号与噪声比，这些比率在扫描之间非常对应。在尝试此方法时，必须轻轻工作以避免样品损坏，并仔细工作以防止气泡的引入。按照此过程，其他方法，如组织学或电子显微镜，可用于研究蛋白质表达模式，或实现更高的分辨率，在2D感兴趣的区域。

我们希望，本出版物将帮助您获得高分辨率组织微CT的力量。