Name: tchip-seq: 细胞专用表观体分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: 学习tChIP-Seq技术用于分析神经元特异性组蛋白修饰，通过小鼠神经元细胞分离染色质，实现细胞类型特异性表观遗传调控研究。该方法可应用于其他细胞类型和模型生物。

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感谢岩崎实验室所有成员对本文稿的审阅。本工作部分得到了日本文部科学省（MEXT）创新性科研领域资助（#26113005 资助 S.N.，JP17H05679 资助 S.I.）；青年科学家（A）资助项目（JP17H04998 资助 S.I.）；以及理化学研究所（RIKEN）的“细胞进化”开拓项目&#34;和所有理化学研究所项目&#34;疾病与表观基因组&#34;&#34;（资助 S.N. 和 S.I.）的支持。

本文所述所有方法均已获得理化学研究所安全委员会（H27-EP071）的批准，并遵循相关指南和法规进行。
1. 组织解剖
<ol>
	<li>使用精细的弹簧剪将感兴趣的组织剪成小块（约 &#60;3 mm2）。 
	注意：较大的组织碎片冻结所需时间更长，而过小的组织块会携带更多的缓冲液体积，这两种情况均可能影响实验结果。</li>
	<li>将剪好的组织碎片加入装有液氮的洁净容器中，并收集至预先装有液氮的 2 mL 离心管中（每管 1 块）。 
	注意：建议在该步骤中使用具有亲水表面的离心管。</li>
	<li>将离心管敞口置于 -80 °C 环境中超过 &#62; 5 分钟，以挥发残留的液氮。 
	注意：关闭管盖后，组织碎片可在 -80 °C 条件下保存一个月，以备后续使用。</li>
</ol>
2. 细胞固定
注意：此步骤我们使用了一款便捷的冷冻研磨仪。也可使用其他替代设备。
<ol>
	<li>将含有组织样本的2 mL低吸附蛋白管置于用液氮预冷的金属冰架上。</li>
	<li>将一个金属弹丸放入1.5 mL离心管中，并用液氮预冷，然后将其放置在金属冰架上。</li>
	<li>打开2 mL离心管，将预冷的金属弹丸放入管内，盖紧管盖，将2 mL离心管装入便携式低温研磨仪的管架中，并立即将组装好的管架浸入液氮中1分钟。</li>
	<li>将冷冻的管架插入便携式低温研磨仪的外层卡匣中，剧烈振荡60次，持续30秒。</li>
	<li>拆开管架，取出金属弹丸，将2 mL离心管置于预先在-20 °C预冷的样本冷却器上。</li>
	<li>将样本冷却器在-20 °C放置15分钟，以防止下一步固定液结冰。</li>
	<li>将样本冷却器移至实验台，打开管盖，立即向管内滴加900 µL的1%甲醛溶液。反复吹打数次后，将悬液转移至另一含有900 µL 1%甲醛的新2 mL离心管中，在23 °C孵育箱中轻轻旋转固定10分钟。 
	注意：甲醛具有毒性且有害健康。</li>
	<li>为终止固定反应，向每管中加入100 µL 2.5 M甘氨酸溶液，在4 °C、3,000 x g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>加入1 mL预冷的磷酸盐缓冲液（PBS），在4 °C、3,000 x g条件下离心5分钟，弃去上清液。重复此步骤两次（共洗涤3次）。 
	注：固定后的样本可用液氮速冻，并在-80 °C保存。</li>
	<li>向沉淀中加入500 µL裂解缓冲液1（50 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）-KOH（pH 7.5），140 mM NaCl，1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）（pH 8.0），10% w/v甘油，0.5% w/v NP-40，0.25% w/v Triton X-100，以及0.1x蛋白酶抑制剂混合物），反复吹打数次，在4 °C旋转孵育10分钟。 
	注意：裂解缓冲液1应在使用前过滤并保存于4 °C。</li>
	<li>在4 °C、3,000 x g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向沉淀中加入1 mL裂解缓冲液2（10 mM Tris-HCl（pH 8.0），200 mM NaCl，1 mM EDTA（pH 8.0），0.5 mM EGTA，以及0.1x蛋白酶抑制剂混合物），涡旋混匀，在4 °C旋转孵育10分钟。 
	注意：裂解缓冲液2应在使用前过滤并保存于4 °C。</li>
	<li>在4 °C、3,000 x g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向沉淀中加入800 µL含1x蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液，通过移液重悬沉淀。</li>
	<li>在4 °C、3,000 x g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向沉淀中加入500 µL含1x蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液。</li>
	<li>在4 °C、3,000 x g条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向沉淀中加入1 mL含1x蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液。立即进行下一步操作。</li>
</ol>
3. 染色质剪切
<ol>
	<li>将裂解液转移至超声破碎管中，然后将管子置于超声破碎仪上。</li>
	<li>使用以下参数剪切染色质：温度：4 °C；峰值入射功率：175 W；占空比：10%；每脉冲循环次数：200；时间：2,400 s。</li>
	<li>将样品转移至1.5 mL低吸附蛋白管中，在4 °C下以20,000 × g离心5分钟。</li>
	<li>将上清液收集至新的低吸附蛋白管中。 
	注意：样品可在液氮中快速冷冻，并于-80 °C保存。</li>
</ol>
4. DNA 质量检测（逆转交联）
<ol>
	<li>在聚合酶链式反应（PCR）管中混合 20 µL 裂解液和 180 µL ChIP 洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、300 mM NaCl、5 mM EDTA (pH 8.0) 和 1% w/v 十二烷基硫酸钠（SDS））。将样品置于热循环仪中，65 °C 孵育 6 小时，热循环仪盖保持打开状态。保持热循环仪盖打开以避免过度变性。 
	注意：ChIP 洗脱缓冲液使用前应过滤并室温保存。此孵育步骤可延长至过夜。</li>
	<li>加入 1 µL 10 mg/mL RNase A，涡旋混匀，37 °C 孵育 30 分钟。</li>
	<li>加入 6.5 µL 15 mg/mL 蛋白酶 K，涡旋混匀，55 °C 孵育 60 分钟。</li>
	<li>将反应液转移至低吸附 DNA 管中，加入 4 µL 5 mg/mL 甘油，涡旋混匀。然后加入 200 µL 酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），室温下以 18,000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>将上清液转移至新的低吸附 DNA 管中。向残留的酚/氯仿/异戊醇溶液中加入 200 µL Tris-EDTA-NaCl 缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA (pH 8.0) 和 200 mM NaCl），室温下以 18,000 × g 离心 5 分钟。收集上清液并与第一次的上清液混合。</li>
	<li>加入 900 µL 冰乙醇，-20 °C 孵育 1 小时。 
	注意：此孵育时间可延长至 4–6 小时。</li>
	<li>4 °C 下以 18,000 × g 离心 30 分钟。</li>
	<li>弃去上清液。向沉淀中加入 1 mL 冰冷的 75% 乙醇，4 °C 下以 18,000 × g 离心 30 分钟。重复此步骤（共洗涤两次）。</li>
	<li>彻底弃去上清液，在室温下空气干燥 1 分钟。</li>
	<li>加入 50 µL Tris-EDTA（TE）缓冲液，通过室温孵育 30 分钟或 4 °C 过夜溶解 DNA。避免涡旋或反复吹打。将此 DNA 作为“input”保存，必要时用于文库构建。</li>
	<li>根据制造商说明书使用荧光计测定 DNA 浓度（参见 材料表），并使用微流控电泳仪检测片段大小分布（代表性数据见 图 2A）。本实验使用 10 ng 或更少的 DNA。 
	注意：DNA 中应有 50% 或以上的片段长度在 100–500 碱基对（bp）范围内。</li>
</ol>
5. 利用抗FLAG抗体进行亲和纯化
注意：对于神经元tChIP-Seq实验，通常使用8只小鼠的脑组织制备一个tChIP-Seq样本，通过串联免疫纯化获得2 ng纯化DNA（见步骤7.1）。据我们经验，0.1 ng DNA仍可制备出高质量的ChIP-Seq文库（Kaduta，未发表）。因此理论上，单只小鼠可能足以完成神经元tChIP-Seq。所需组织量应根据具体研究的组织和细胞类型进行优化。在免疫纯化实验的阴性对照中，应制备并使用不表达H2B-FLAG的小鼠脑组织裂解液。
<ol>
	<li>将200 µL与羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）偶联的磁珠移液至低蛋白结合管中。</li>
	<li>将管子置于磁力架上，静置1分钟，待上清液变澄清后弃去上清液，加入1 mL预冷的PBS缓冲液，涡旋振荡。重复此步骤（共洗涤两次）。</li>
	<li>加入20 µL浓度为1 mg/mL的抗FLAG抗体，在4 °C下旋转孵育5小时。 
	注意：此孵育时间可延长至过夜。</li>
	<li>按照步骤5.2的方法洗涤磁珠，然后将磁珠转移至一个15 mL管中。</li>
	<li>用1110 µL RIPA裂解缓冲液重悬磁珠，随后加入900 µL 10x封闭试剂、180 µL 50x Denhardt溶液、10 µL 100x蛋白酶抑制剂混合液，以及6.8 mL在步骤3中制备的裂解液。将该混合物均分至5个低蛋白结合管中，在4 °C下旋转孵育6小时。 
	注意：此孵育时间可延长至过夜。</li>
	<li>将管子置于磁力架上，静置1分钟，待上清液变澄清后弃去上清液，加入1 mL RIPA缓冲液，轻轻混匀。重复此步骤5次（共洗涤6次），最后将所有磁珠合并至同一个低蛋白结合管中。</li>
	<li>加入200 µL ChIP洗脱缓冲液，在室温下旋转孵育15分钟。按照步骤4.11所述方法检测DNA质量（参见图2B和C中的代表性数据）。随后立即进行下一步操作。</li>
</ol>
6. 使用抗H3K4me3抗体进行亲和纯化及逆转交联
注意：以下珠子制备步骤（6.1–6.4）应在步骤 5.7 之前进行。
<ol>
	<li>将40 µL与羊抗小鼠IgG偶联的磁珠加入2 mL低吸附蛋白管中。</li>
	<li>将管子置于磁力架上，静置1分钟，待上清液变澄清后弃去上清液，加入1 mL预冷的PBS缓冲液，轻轻混匀。重复此步骤（共洗涤两次）。</li>
	<li>加入4 µL浓度为1 mg/mL的抗H3K4me3抗体，在4 °C下旋转孵育6小时。</li>
	<li>按照步骤6.2洗涤磁珠，将磁珠转移至2 mL低吸附蛋白管中。</li>
	<li>将磁珠重悬于1558 µL RIPA缓冲液中，然后加入200 µL 10x封闭试剂、40 µL 50x Denhardt溶液、2 µL 100x蛋白酶抑制剂混合液以及200 µL步骤5.7中制备的洗脱液，在4 °C下旋转孵育过夜。 
	注意：ChIP洗脱缓冲液中的SDS在此孵育步骤中被稀释了10倍以上。</li>
	<li>将管子置于磁力架上，静置1分钟，待上清液变澄清后弃去上清液，加入1 mL RIPA缓冲液，轻轻混匀。重复此步骤4次（共洗涤5次）。最后一次洗涤后，将磁珠转移至DNA低吸附管中，弃去上清液。</li>
	<li>加入200 µL ChIP洗脱缓冲液，在室温下旋转孵育15分钟，将洗脱液转移至新的DNA低吸附管中。 
	注意：洗脱液可在-80 °C长期保存。</li>
	<li>按照步骤4进行DNA的去交联处理。将纯化后的DNA重悬于20 µL TE缓冲液中。</li>
	<li>按照步骤4.11所述方法检测DNA质量（见图2D中的代表性数据）。可选：按照先前描述的方法进行定量PCR富集分析2，应观察到10倍或更高的富集。</li>
</ol>
7. 文库构建
<ol>
	<li>针对每个输入样本和ChIP DNA样本，使用微流控电泳仪配套软件的smear分析功能，计算100–500 bp区段DNA所占比例。估算获得2 ng 100–500 bp DNA所需的样本体积。以100–500 bp范围内20 ng DNA作为“输入”样本。</li>
	<li>将DNA样本移入8联排PCR管中，并加入H2O使总体积达到10 µL。（可选）若DNA体积超过10 µL，则按比例放大后续的末端修复反应和片段大小选择步骤。</li>
	<li>配制末端修复主混合液（参见材料表）。向DNA中加入4 µL末端修复主混合液，在20 °C孵育30分钟。</li>
	<li>加入36 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8.5）和0.6倍体积（30 µL）的固相可逆固定化（SPRI）磁珠，在室温孵育5分钟。</li>
	<li>将管子置于磁力架上，静置至溶液上清澄清。</li>
	<li>将上清转移至新管中，加入1.2倍体积（60 µL）SPRI磁珠，在室温孵育5分钟。</li>
	<li>将管子置于磁力架上，静置至溶液上清澄清。</li>
	<li>用200 µL 80%乙醇洗涤磁珠两次，洗涤过程中保持管子固定在磁力架上。</li>
	<li>短暂离心管子，使残留乙醇聚集于管底，再放回磁力架，彻底去除残留乙醇。</li>
	<li>打开管盖静置1–2分钟，使乙醇充分挥发。</li>
	<li>盖上管盖并将管子置于冰上。 
	注意：此时已在磁珠上获得100–500 bp大小选择后的DNA。有关双重大小选择的更多细节，请参见制造商网站（www.beckman.com）。</li>
	<li>配制A尾修饰主混合液（参见材料表）。</li>
	<li>用10 µL A尾修饰主混合液重悬磁珠（来自步骤7.10），在30 °C孵育30分钟。</li>
	<li>加入1.8倍体积（18 µL）聚乙二醇（PEG）/NaCl溶液，在室温孵育5分钟。</li>
	<li>按照步骤7.7–7.11纯化DNA。</li>
	<li>配制连接缓冲液混合液（参见材料表）。</li>
	<li>将8 µL连接缓冲液混合液加入磁珠（来自步骤7.14），加入1 µL 1 µM接头并重悬磁珠。输入样本使用1 µL 5 µM接头。若需多重测序，可为每个样本使用不同的接头。</li>
	<li>加入1 µL DNA连接酶，在20 °C孵育15分钟。</li>
	<li>加入1.0倍体积（10 µL）PEG/NaCl溶液，重悬磁珠，在室温孵育5分钟。</li>
	<li>按照步骤7.7–7.10纯化DNA。</li>
	<li>向管中加入25 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8.5），重悬磁珠。</li>
	<li>加入1.0倍体积（25 µL）PEG/NaCl溶液，在室温孵育5分钟。</li>
	<li>按照步骤7.7–7.10纯化DNA。</li>
	<li>向管中加入11 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8.5），重悬磁珠。</li>
	<li>将管子置于磁力架上，静置至溶液上清澄清。</li>
	<li>将上清收集至新的8联排PCR管中。</li>
	<li>配制实时PCR主混合液（详见材料部分）。</li>
	<li>在384孔定量PCR（qPCR）板中加入8.5 µL实时PCR主混合液，再加入1.5 µL接头连接后的DNA（来自步骤7.26）。</li>
	<li>在空孔中各加入10 µL荧光标准品。</li>
	<li>执行以下程序进行实时PCR：(98 °C 45 s) × 1个循环，(98 °C 15 s，60 °C 30 s，72 °C 30 s) × 20个循环，以及(72 °C 60 s) × 1个循环。</li>
	<li>确定达到荧光标准品2荧光强度所需的PCR循环数。</li>
	<li>配制PCR主混合液（参见材料表）。</li>
	<li>向剩余的接头连接DNA（来自步骤7.26）中加入11.5 µL PCR主混合液，并按照步骤7.30的程序，使用步骤7.31确定的PCR循环数进行PCR扩增。</li>
	<li>加入1.0倍体积（20 µL）PEG/NaCl溶液，在室温孵育5分钟。</li>
	<li>按照步骤7.7–7.10纯化DNA。</li>
	<li>向管中加入20 µL 10 mM Tris-Cl（pH 8.5），重悬磁珠。</li>
	<li>将管子置于磁力架上，静置至溶液上清澄清。</li>
	<li>将上清收集至新的1.5 mL低吸附DNA管中。</li>
	<li>按照步骤4.11所述方法检测文库质量（参见图2E和F中的代表性数据）。使用1 µL文库DNA样本。（可选）按前述方法通过qPCR进行富集分析2，应观察到10倍或更高的富集。</li>
</ol>
8. 测序
<ol>
	<li>在下一代测序仪中对文库进行测序（参见图3所示的代表性数据）。 
	注意：用于数据分析的测序深度将根据生物体的基因组大小而有所不同3。对于人和小鼠，我们建议至少获得2000万至4000万条单端读长。根据读长产量，多重测序可能更具成本效益。</li>
</ol>

<ol><li>Mito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+survey+of+epigenetic+modifications+by+tandem+chromatin+immunoprecipitation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific survey of epigenetic modifications by tandem chromatin immunoprecipitation sequencing.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1143(2018).</li>
<li>Kadota, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+binding+landscape+in+jawless+fish+with+reference+to+Hox+cluster+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CTCF binding landscape in jawless fish with reference to Hox cluster evolution.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4957(2017).</li>
<li>Jung, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sequencing+depth+in+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Impact of sequencing depth in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Research. 42 (9), (2014).</li>
<li>Becker, P. B., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+remodeling+and+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleosome remodeling and epigenetics.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (9), a017905(2013).</li>
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<li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+crosslinking%3A+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> The Journal of Biological Chemistry. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本实验方案已针对小鼠脑内神经元进行优化，在该模型中，通过注射他莫昔芬诱导表达带FLAG标签的H2B。H2B表达所用的启动子、起始组织材料及其用量是影响tChIP-Seq成功的关键参数。因此，针对每种目标细胞类型，均需对这些因素进行优化。
本方案所用步骤中的一个关键环节是DNA片段化，以获得长度为100–500 bp的染色质5。通常情况下，超声破碎步骤的标准化较为困难，因为它高度依赖于多种因素，包括固定条件、所用组织、超声设备及其参数设置等。因此，针对不同实验需通过反复试验对该DNA片段化步骤进行优化。除了超声破碎外，使用微球菌核酸酶处理也是一种可选方案，可用于分离单核小体大小的DNA片段，这在传统的ChIP方法中已有应用6。尽管理想的DNA片段应具有均一的尺寸分布，但片段化的DNA仍可能出现多个不同大小的片段群体，如图2A所示。如上所述，采用SPRI磁珠进行两次尺寸筛选有助于去除较长的DNA片段。
<p class="j...

动物的组织由多种不同类型的细胞组成。每种细胞中的基因调控决定了其细胞类型。染色质修饰——包括DNA甲基化和组蛋白修饰——是基因表达具有细胞类型特异性的基础。因此，人们一直希望测量每种细胞类型中的表观遗传调控，但这一直是一个技术难题。
为了研究特定细胞类型的表观遗传学，近期开发了串联染色质免疫沉淀测序技术（tChIP-Seq）(图1)1。在tChIP中，表位标签标记的核心组蛋白H2B在细胞类型特异性启动子驱动下表达。该特性使得可以从目标细胞中分离染色质，即使起始材料来源于多种细胞类型的混合物。在通过修饰组蛋白标记进行染色质纯化，并对分离的DNA进行下一代深度测序（即ChIP-Seq）后，我们能够以全基因组范围监测目标细胞类型的表观遗传状态。
利用该技术，我们近期研究了神经元特异性的组蛋白H3在赖氨酸4位点的三甲基化（H3K4me3）修饰。在该研究中，我们构建了一种基因敲入小鼠模型，通过Cre介导的重组，可在其细胞中表达C端带有FLAG标签的H2B蛋白（Rosa26CAG floxed-pA H2B-FLAG）。通过与在CamK2a启动子驱动下表达Cre-内质网（ER）基因的小鼠杂交，所获得的小鼠品系在注射他莫昔芬后可在活跃神经元中诱导H2B-FLAG的表达（Camk2aH2B-FLAG）1。基于该稳定小鼠品系的脑组织，我们使用抗H3K4me3抗体进行了tChIP-Seq实验。由于H3K4me3修饰通常位于启动子区域，因此我们成功鉴定了数百种在神经元中特异性表达的mRNA1。
本文介绍了一种典型的组织染色质免疫沉淀测序（tChIP-Seq）方法，涵盖了从组织解剖到文库构建的各个步骤(图1)。本实验方案的最终目标是分享我们在开展tChIP-Seq实验中的最佳实践，并推动该方法未来在其他细胞类型及组蛋白修饰研究中的应用。

<table><tbody><tr><td>蛋白质 LoBind 管，2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&amp;nbsp;0030108132</td><td>用于细胞裂解</td></tr><tr><td>蛋白质 LoBind 管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&amp;nbsp;0030108116</td><td>用于染色质免疫沉淀（ChIP）和文库制备</td></tr><tr><td>DNA LoBind 管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>No.&amp;nbsp;0030108051</td><td>用于染色质免疫沉淀（ChIP）和文库制备</td></tr><tr><td>8联排 PCR 管</td><td>BIO-BIK</td><td>3247-00</td><td>用于染色质免疫沉淀（ChIP）和文库制备</td></tr><tr><td>SK 磨粉机</td><td>TOKKEN</td><td>SK-200</td><td>便携式低温研磨仪，用于制备细胞粉末以进行固定</td></tr><tr><td>金属弹丸</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-DLC10</td><td>SK 磨粉机的配件</td></tr><tr><td>2 mL 不锈钢管</td><td>TOKKEN</td><td>TK-AM5-SUS</td><td>细胞裂解的可选方案</td></tr><tr><td>2 mL 不锈钢管架</td><td>TOKKEN</td><td>SK-100-TL</td><td>细胞裂解的可选方案</td></tr><tr><td>16% 甲醛（w/v），无甲醇</td><td>Pierce</td><td>28906</td><td>用于固定细胞。使用前配制成 1% 溶液。</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Nacalai Tesque</td><td>17109-35</td><td>配制 2.5 M 储存液</td></tr><tr><td>D-PBS (-)(1x)</td><td>Nacalai Tesque</td><td>14249-24</td><td>用于洗涤裂解物和纯化 DNA</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Nacalai Tesque</td><td>02443-05</td><td>用于裂解缓冲液 1。配制 1 M，pH 7.5 储存液。</td></tr><tr><td>5 M NaCl，分子生物学级</td><td>Nacalai Tesque</td><td>06900-14</td><td>用于裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、ChIP 洗脱缓冲液和 Tris-EDTA-NaCl 缓冲液</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA，分子生物学级</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>311-90075</td><td>用于裂解缓冲液 1、裂解缓冲液 2、ChIP 洗脱缓冲液和 Tris-EDTA-NaCl 缓冲液</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>072-04945</td><td>用于裂解缓冲液 1</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25223-75</td><td>用于裂解缓冲液 1</td></tr><tr><td>Triton X-100，分子生物学级</td><td>Nacalai Tesque</td><td>12967-32</td><td>用于裂解缓冲液 1</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-91</td><td>用于裂解缓冲液 2、ChIP 洗脱缓冲液和 Tris-EDTA-NaCl 缓冲液。配制 1 M，pH 8.0 储存液。</td></tr><tr><td>0.1 M EGTA，pH 中性</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08947-35</td><td>用于裂解缓冲液 2</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物（100x）</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25955-24</td><td>用于阻止蛋白质降解</td></tr><tr><td>RIPA 缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89900</td><td>用于细胞裂解和洗涤</td></tr><tr><td>milliTUBE 1 mL AFA 纤维管</td><td>Covaris</td><td>520130</td><td>超声破碎管。聚焦式超声破碎仪的配件</td></tr><tr><td>聚焦式超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>S220 或 E220</td><td>将 DNA 消化至适合 ChIP-Seq 的大小</td></tr><tr><td>UltraPure 10% SDS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15553-027</td><td>用于 ChIP 洗脱缓冲液</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Nacalai Tesque</td><td>30141-14</td><td>用于从裂解物中纯化 DNA</td></tr><tr><td>蛋白酶 K，重组型，PCR 级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115887001</td><td>用于从裂解物中纯化 DNA</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>054-07225</td><td>配制 70% 溶液</td></tr><tr><td>小鼠来源的单克隆抗 FLAG M2 抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td>用于纯化目标细胞中表达的染色质</td></tr><tr><td>Dynabead M-280 羊抗小鼠 IgG 磁珠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11201D</td><td>可用于抗 FLAG 免疫沉淀和抗 H3K4me3 免疫沉淀</td></tr><tr><td>抗三甲基化组蛋白 H3（K4）小鼠单克隆抗体</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>301-34811</td><td>任何适用于 ChIP 分析的其他抗体亦可使用</td></tr><tr><td>10x 封闭试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11096176001</td><td>亲和纯化过程中的封闭剂</td></tr><tr><td>Denhardt&amp;rsquo;s 溶液</td><td>Nacalai Tesque</td><td>10727-74</td><td>亲和纯化过程中的封闭剂</td></tr><tr><td>糖原（5 mg/ml）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9510</td><td>用于从裂解物中纯化 DNA</td></tr><tr><td>Qubit 2.0 荧光计</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32866</td><td>用于定量分离的 DNA</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS 检测试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32851</td><td>用于定量分离的 DNA</td></tr><tr><td>0.5 mL 管</td><td>Axygen</td><td>10011-830</td><td>用于 Qubit 定量</td></tr><tr><td>苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）</td><td>Nacalai Tesque</td><td>25970-56</td><td>用于从裂解物中纯化 DNA</td></tr><tr><td>AMPure XP 磁珠</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>用于文库制备的 SPRI 磁珠</td></tr><tr><td>金属冰盒</td><td>Funakoshi</td><td>IR-1</td><td>用于保持细胞裂解物处于冷冻状态</td></tr><tr><td>样品冷却器</td><td>New England Biolabs</td><td>T7771S</td><td>有助于在最小损伤下固定细胞</td></tr><tr><td>2100 生物分析仪</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>用于检测分离 DNA 片段的质量。也可使用其他片段分析仪。</td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100 专家软件</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2946CA</td><td>随生物分析仪提供</td></tr><tr><td>高灵敏度 DNA 检测试剂盒</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>用于检测分离 DNA 片段的质量</td></tr><tr><td>KAPA LTP 文库制备试剂盒</td><td>Roche</td><td>07961898001</td><td>包含 10x KAPA 末端修复缓冲液、KAPA 末端修复酶混合物、KAPA A-尾化缓冲液、KAPA A-尾化酶、KAPA 连接缓冲液、KAPA DNA 连接酶和 PEG/NaCl 溶液</td></tr><tr><td>NEXTflex DNA 条形码</td><td>BIOO Scientific</td><td>NOVA-514101</td><td>文库制备用接头。包含 DNA 条形码接头和引物混合物。</td></tr><tr><td>KAPA 实时文库扩增试剂盒</td><td>Roche</td><td>07959028001</td><td>包含 2x KAPA HiFi HS 实时 PCR 预混液、PCR 引物混合物和荧光标准品</td></tr><tr><td>2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Roche</td><td>KM2602</td><td>用于文库制备。此外，该酶可能也是 KAPA 实时文库扩增试剂盒所需</td></tr><tr><td>Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td>10 mM Tris-Cl，pH 8.5，用于 DNA 洗脱</td></tr><tr><td>386 孔 qPCR 板</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309849</td><td>用于实时 PCR</td></tr><tr><td>QuantStudio 7 Flex 实时 PCR 系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485701</td><td>用于定量 DNA</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学密封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>用于实时 PCR</td></tr><tr><td>MicroAmp 透明密封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4306311</td><td>用于板密封</td></tr><tr><td>末端修复主混合液</td><td></td><td></td><td>混合 1.4 &amp;micro;L 10x KAPA 末端修复缓冲液、1 &amp;micro;L KAPA 末端修复酶混合物和 1.6 &amp;micro;L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>A-尾化主混合液</td><td></td><td></td><td>混合 1 &amp;micro;L KAPA A-尾化缓冲液、0.6 &amp;micro;L KAPA A-尾化酶和 8.4 &amp;micro;L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>连接缓冲液混合液</td><td></td><td></td><td>混合 2 &amp;micro;L KAPA 连接缓冲液和 6 &amp;micro;L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>实时 PCR 主混合液</td><td></td><td></td><td>混合 5 &amp;micro;L 2x KAPA HiFi HS 实时 PCR 预混液、0.35 &amp;micro;L PCR 引物混合物（正向引物 AATGATACGGCGACCACCGAG 和反向引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 各 10 &amp;micro;M）以及 3.15 &amp;micro;L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PCR 主混合液</td><td></td><td></td><td>混合 10 &amp;micro;L 2x KAPA HiFi Ready Mix、0.9 &amp;micro;L PCR 引物混合物和 0.6 &amp;micro;L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>整合基因组浏览器（Integrative Genomics Viewer）</td><td>Broad Institute</td><td>IGV_2.3.88</td><td>用于可视化测序数据的基因组浏览器</td></tr><tr><td>DNA 寡核苷酸：5&amp;prime;-GCCTACGCAGGTCTTGCTGAC-3&amp;prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>用于扩增 GAPDH 启动子区域的引物</td></tr><tr><td>DNA 寡核苷酸：5&amp;prime;-CGAGCGCTGACCTTGAGGTC-3&amp;prime;</td><td>Eurofins Genomics</td><td></td><td>用于扩增 GAPDH 启动子区域的引物</td></tr><tr><td>SYBR Premix Ex Taq</td><td>Takara</td><td>RR420L</td><td>用于定量对应于 GAPDH 启动子区域的 DNA</td></tr><tr><td>Thermal Cycler Dice</td><td>Takara</td><td>TP870</td><td>用于定量对应于 GAPDH 启动子区域的 DNA</td></tr></tbody></table>

tchip-seq：细胞类型特异性表观基因组分析

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenome Profiling

表观遗传调控在基因表达中发挥着核心作用。自20世纪60年代发现组蛋白修饰以来，其生理与病理功能已得到广泛研究。事实上，通过特异性组蛋白修饰抗体进行染色质免疫沉淀（ChIP）并结合下一代深度测序技术的出现，彻底改变了我们对全基因组范围内表观遗传调控的认识。然而，组织通常由多种细胞类型组成，其复杂的混合状态为研究特定细胞类型的表观基因组带来了分析上的挑战。为在全基因组范围内解析特定细胞类型的染色质状态，我们近期开发了串联染色质免疫沉淀测序技术（tChIP-Seq），该技术基于从目标细胞类型中利用标记的核心组蛋白蛋白选择性纯化染色质，随后进行ChIP-Seq分析。本实验方案旨在介绍tChIP-Seq的最佳操作实践。该技术为在多种组蛋白修饰及模式生物中开展组织特异性的表观基因组研究提供了灵活有效的工具。

本文介绍了组织解剖、固定、细胞裂解、染色质串联纯化以及用于下一代测序仪的DNA文库制备方法。在实验过程中，可在多个步骤中检测DNA的质量，这是成功测序的关键（图2）。由于单个核小体通常被约147 bp的DNA包裹4，因此剪切后的DNA长度不应短于该尺寸。超声处理后，立即分离DNA并使用微流控电泳仪进行分析（图2A）。尽管我们已尽力优化片段大小范围，但仍有一部分DNA（约2 kbp）未能充分剪切。在此步骤中，长度在100–500 bp范围内的DNA片段应占总DNA的50%或以上。随后依次使用抗FLAG抗体（图2B）和抗H3K4me3抗体（图2D）进行亲和纯化，并再次利用微流控电泳仪检测所分离DNA的质量，评估100–500 bp DNA片段的含量。尽管在此阶段常观察到DNA片段向2 kbp大...

我们描述了一种串联染色质免疫沉淀测序（tChIP-Seq）的逐步实验方案，该方法可用于分析特定细胞类型的全基因组组蛋白修饰。

TChIP-Seq：细胞类型特异性表观基因组分析

表观遗传调控在基因表达中发挥着核心作用。自20世纪60年代组蛋白修饰被发现以来，其生理与病理功能……

该方法有助于解答表观遗传学领域的关键问题，例如在基因组范围内，不同细胞类型中染色质修饰的调控程度如何。该技术的主要优势在于，我们能够从特定靶细胞中分离染色质，随后进行常规的gypsy下游分析。因此，该方法可为神经元特异性的trimincil、lysinc 4及opisoncilly提供深入见解。该方法也可应用于其他组蛋白修饰、其他细胞类型以及其他模式生物。演示该实验步骤的是我实验室的技术员 Mari Mito。首先，使用精细的弹簧剪将目标组织剪切成小块。将组织碎片加入装有液氮的洁净容器中。然后，将组织碎片转移至装有液氮的2毫升离心管中。打开管盖，在-80°C条件下保存5分钟，以使液氮挥发。将含有组织样本的离心管置于预冷的金属冰架上。然后，将一个金属弹丸放入1.5毫升离心管中，并用液氮预冷。将预冷的金属弹丸放入其中一个样本管中。盖上管盖，将试管放入冷冻研磨机的试管架中。立即把组装好的试管架浸入液氮中一分钟。将冷冻的试管架插入冷冻研磨机的外盒中。然后用力振荡30秒，共60次。之后，拆开冷冻研磨仪，取出金属研磨珠，并将离心管放入预冷的样品冷却器中。将冷却器在负20摄氏度下保存15分钟。然后，向管中加入900 µL的1%甲醛，并用移液器混匀。将悬浮液转移至含有900 µL 1%甲醛的新2 mL管中。接下来，在23摄氏度下轻轻旋转孵育10分钟以固定悬液。为终止固定反应，向管中加入100微升2.5摩尔的甘氨酸。然后在4摄氏度下以3,000 × g离心5分钟。此后，弃去上清液。向离心管中加入一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），涡旋混匀。在4°C条件下，以3,000 × g离心5分钟。重复此洗涤步骤，再进行两次。接着，向沉淀中加入500 µL裂解缓冲液一，并用移液器吹打混匀。将离心管在4 °C、3,000 ×g条件下离心5分钟，弃去上清液。向沉淀中加入1毫升裂解缓冲液二，涡旋混匀。然后，在4°C条件下以3,000 × g离心5分钟，弃去上清液。随后，向沉淀中加入800微升含有蛋白酶抑制剂混合物的放射免疫沉淀分析缓冲液，用移液器吹打混匀。将悬液在4°C条件下以3,000 × g离心5分钟，弃去上清液。接着，向沉淀中加入500 µL含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液。然后，将悬液在4°C条件下以3,000 × g离心5分钟，弃去上清液。加入1 mL含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液。加入含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解缓冲液后，立即将裂解液转移至超声破碎管中，并将管子置于超声破碎仪上。根据文本方案中所述的设置，对染色质进行超声剪切。然后将样品转移至一个1.5毫升的低吸附蛋白管中，并在4°C条件下以20,000 × g离心5分钟。收集样品的上清液，并转移至新的低吸附蛋白管中。本方案中介绍并演示了串联染色质免疫沉淀测序技术。在实验过程中，于多个步骤对DNA的质量进行了检测。超声处理后立即分离剪切的DNA，并使用微流控电泳仪进行检测。使用抗FLAG抗体和抗H3K3me3抗体进行亲和纯化后，再次检测DNA质量。通过阴性对照样本验证了H2B-FLAG上DNA免疫纯化的特异性。当检测到的DNA量可忽略不计时。在后续实验步骤中，对测序文库的质量进行了验证。通过使用靶向GAPDH基因启动子区域的引物进行富集分析，证实了ChIP和T-ChIP实验的成功。获得了沿三个神经元基因的代表性重分布结果。观察到神经元T-ChIP-seq相对于全脑T-ChIP-seq在基因5'端出现读段富集。该技术稳定后，将为表观遗传学领域的研究人员广泛探索小鼠神经元中细胞类型特异性的组蛋白修饰铺平道路。请注意，接触甲醛可能具有极高危险性，进行此操作时务必采取预防措施，例如穿戴橡胶防护服和护目镜。

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科研

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Biology

生物学

tchip-seq: 细胞专用表观体分析

染色质免疫沉淀与超深度高通量测序（ChIP-seq）相结合，可识别并定位特定组织或细胞系中的蛋白质-DNA 相互作用。本文以转录因子 TCF7L2 为例，概述了如何制备高质量的 ChIP...

高质量染色质免疫沉淀DNA模板的制备用于高通量测序（ChIP-seq）

用于定位的方法 在体 蛋白质-DNA 相互作用对于基因组研究的各个方面正变得至关重要，但这类实验通常耗时、费力且成本高昂。本文介绍了一种市售的自动化液体处理系统，可实现染色质免疫沉淀的自动化操作，用于绘制 体内...

自动化 ChIP-seq 实验以在 10,000 个 HeLa 细胞中生成表观遗传谱型

基因转录的精细调控是胚胎细胞命运决定的基础。本文描述了染色质免疫沉淀实验，用于研究干细胞向心肌细胞分化以及小鼠胚胎心脏发育过程中的表观遗传调控机制。...

胚胎干细胞和组织心肌分化的表观遗传调控

本研究介绍了一种利用成熟小鼠T细胞系进行染色质免疫沉淀（ChIP）的实验方案。该方案适用于研究特定组蛋白修饰在特定启动子区域或全基因组范围内的分布情况。...

小鼠T细胞系中的染色质免疫沉淀（ChIP）

我们提出一种改进的天然染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）方法，用于生成适用于核小体密度ChIP-seq分析框架的序列数据集，该框架整合了微球菌核酸酶（MNase）可及性与组蛋白修饰检测。...

用于核小体密度分析的天然染色质免疫沉淀测序文库的构建

本文介绍了一种优化的高通量染色质免疫沉淀测序（ChIP-sequencing）实验方案及相应的计算分析流程，用于从冻存的肿瘤组织和细胞系中确定全基因组范围内的染色质状态模式。...

利用高通量ChIP-测序在肿瘤组织中进行全基因组染色质状态作图的整合平台

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CARIP-Seq 与 ChIP-Seq：在胚胎干细胞中鉴定染色质相关 RNA 及蛋白质-DNA 相互作用的方法

精确测定蛋白质在整个基因组上的结合位点对于理解基因调控至关重要。本文描述了一种 基因组定位方法，该方法对染色质免疫沉淀获得的DNA进行外切酶消化处理（ChIP-exo），随后进行高通量测序。该方法可在哺乳类神经元中以接近单碱基对分辨率和高信噪比检测蛋白质-DNA相互作用。...

利用染色质免疫沉淀-外切酶技术（ChIP-Exo）在小鼠干细胞来源的神经元中进行蛋白质-DNA相互作用的高分辨率作图

本文介绍了一种半自动化的微量染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）方案，该方案利用ChIP液体处理平台，针对与特定组蛋白修饰（H3K27ac）相关的DNA区域进行检测，随后采用标签化片段化（tagmentation）方法构建文库。该流程包含对产物质量和数量的质量控制评估步骤，且可适用于其他组蛋白修饰或转录因子的研究。...

一种用于大规模表观遗传学研究的半自动化ChIP-Seq实验流程

本研究提出了一种空间Trekker–CUT&amp;#38;Tag多组学方案，将组织切片的直接空间条形码技术与单细胞多组学分析相结合。该方法能够同时实现基因表达和组蛋白H3K27ac修饰的空间解析单细胞谱型分析，为在组织微解剖背景下理解基因调控机制提供了深入见解。...

空间分辨的、整合式单细胞多组学分析：在冷冻组织切片中对转录组与表观基因组靶标进行联合检测

学习tChIP-Seq技术用于分析神经元特异性组蛋白修饰，通过小鼠神经元细胞分离染色质，实现细胞类型特异性表观遗传调控研究。该方法可应用于其他细胞类型和模型生物。

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