tchip-seq: 细胞专用表观体分析
2019年1月23日
我们描述了串联染色质免疫沉淀测序 (tchip-seq) 的分步协议, 该协议可分析细胞类型特异性基因组蛋白的全组蛋白修饰。
此方法可以帮助回答表观遗传学领域的关键问题，例如以细胞类型特定方式与基因组一起调节的色度修饰。这项技术的主要优点是，我们可以从目标细胞中分离出染色质，然后跟随典型的吉普赛人下游。因此，此方法可以提供对神经元特异性三丁酸的见解，lysinc 4，蛋白石。
它也可以应用于其他组蛋白修饰，其他细胞类型，然后其他模型生物体。演示这个程序的将是玛丽米托，一个技术员从我的实验室。首先，使用细弹簧剪刀将感兴趣的组织解剖成小块。
将组织碎片添加到装满液氮的清洁容器中。然后，将组织片段转移到两个充满液氮的毫升管中。将管子存放在零下80摄氏度下5分钟，盖子打开以蒸发液氮。
将含有组织样品的管子放在冰冷的金属冰架上。然后，将金属子弹放在1.5毫升的管子中，然后用液氮冷却。将冷冻金属子弹放在其中一个样品管上。
合上盖子，将管子放入低温研磨机的管架上。立即将组装好的管架浸入液氮中一分钟。将冷冻管架插入低温研磨机的外盒。
并大力摇动 30 秒， 60 次。在此之后，拆解低温研磨机，取出金属子弹。将管子放入预冷却样品冷却器中。
将冷却器存放在负 20 摄氏度下 15 分钟。然后，在管和移液器中加入900微升1%甲醛混合。将悬浮液转移到新的两毫升管，其 900 微升为 1%甲醛。
接下来，在 23 摄氏度下轻轻旋转，将悬架固定 10 分钟。要停止固定反应，在管中加入100微升2.5摩尔甘油。在摄氏4度的3000倍重力下，离心机5分钟。
在此之后，丢弃超级上经剂。将一毫升PBS加入管子和涡流混合。在4摄氏度下以3000倍重力离心5分钟。
重复这个洗涤步骤，再重复两次。接下来，将500微升的解液缓冲液加入颗粒和移液器混合。在4摄氏度的重力下将管子离心5分钟，然后丢弃上一代。
将一毫升的解液缓冲液2加入颗粒和涡流混合。然后，在4摄氏度的重力下将悬浮液离心5分钟，然后丢弃上一代。在此之后，加入800微升的放射性免疫沉淀缓冲液与蛋白酶抑制剂鸡尾酒到颗粒和移液器混合。
在4摄氏度的重力下将悬浮液离心5分钟，然后丢弃上一代。接下来，加入500微升的RIPA缓冲液与蛋白酶抑制剂鸡尾酒到颗粒。然后，在4摄氏度的重力下将悬浮液离心5分钟，然后丢弃上一代。
加入一毫升的RIPA缓冲液与蛋白酶抑制剂鸡尾酒。在添加裂口缓冲液与蛋白酶抑制剂鸡尾酒后，立即将裂酸转移到声波管。将管子放在超声波器上。
使用文本协议中概述的设置，剪切染色质。然后，将样品转移到1.5毫升蛋白质低结合管。在4摄氏度的重力下，在2万倍的重力下离心5分钟。
从样品中收集上清液，并转移到新的蛋白质低结合管。在该协议中，引入并演示了串联染色质免疫沉淀测序。在手术过程中，DNA的质量经过多个步骤的测试。
在声波化之后，立即用微流体电泳机分离和测试剪切的DNA。使用抗旗抗体和抗H3K3me3抗体进行亲和力纯化后，再次检查DNA质量。H2B-FLAGDNA免疫纯化的特异性用阴性对照样本得到确认。
检测到的DNA数量可以忽略不计。进一步进入协议，验证了测序库的质量。成功的ChIP和T-ChIP通过富集分析证明，其目标为GAPDH基因的启动区域。
沿着三个神经元基因获得代表性再分配。并且通过神经元T-ChIP寻求整个大脑T-ChIP寻求在基因的五个主要端的读读的富集被观察到。在稳定后，该技术为表观遗传领域的研究人员在小鼠神经元中广泛探索细胞类型特异性组蛋白修饰铺平了道路。
不要忘记，使用甲醛可能非常危险，在执行此过程时，应始终采取预防措施，如佩戴橡胶服装和眼镜。
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概述
本文介绍了串联染色质免疫共沉淀测序（tChIP-Seq）的详细协议，强调了该方法在分析基因组中细胞类型特异性组蛋白修饰方面的适用性。通过从目标细胞中分离染色质，该方法使研究人员能够探索表观遗传调控，并丰富对神经元特异性组蛋白修饰的认识。
关键研究组成部分
研究领域
- 表观遗传学
- 组蛋白修饰分析
- 细胞类型特异性
背景
- 染色质修饰在细胞功能中的重要性
- 理解神经元发育和功能的潜力
- 研究组蛋白修饰的精确方法的需求
使用的方法
- 串联染色质免疫共沉淀测序（tChIP-Seq）
- 小鼠神经元细胞作为生物模型
- 亲和纯化和电泳用于DNA质量验证
主要结果
- 确认了神经元细胞特异性组蛋白修饰的富集
- 通过负控制证明了免疫纯化的特异性
- 对神经元基因的组蛋白修饰的详细观察
结论
- 本研究为探索细胞类型特异性组蛋白修饰提供了一个有价值的协议。
- 它强调了tChIP-Seq在推进表观遗传学研究方面的重要性，特别是在理解神经元生物学方面。
常见问题
Executive Industry Relevance
Cell-type-specific epigenome profiling addresses a critical gap in target validation by enabling precise interrogation of histone modifications in defined cellular populations. This capability enhances predictive confidence in preclinical models by reducing biological noise from heterogeneous tissues. tChIP-Seq supports mechanistic de-risking in early discovery by linking epigenetic states to functional outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables therapeutic hypothesis interrogation through cell-type-specific chromatin state mapping.
- Operational Value: Provides biological de-risking by isolating epigenetic signals from target cell populations.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by clarifying mechanistic pathways in disease-relevant systems.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream epigenetic screening workflows.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled chromatin isolation.
- Scalability: Enables platform reuse across histone modifications and model organisms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance from discovery through preclinical validation via neuron-specific epigenome profiling.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports decisions by linking histone modification patterns to functional gene expression.
- Biomarker Alignment: Facilitates translational biomarker development through epigenomic readouts in target cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing epigenomic resolution in purified cell types.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through cell-type-specific chromatin analysis.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs for compound effect evaluation.
- Analytics: Generates enrichment measurements and sequencing readouts that enable condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via neuron-specific epigenome profiling in disease models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for epigenetic profiling across projects and histone marks.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epigenetic regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of chromatin isolation workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on epigenomic fidelity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in epigenetics, molecular biology, and nucleic acid handling.
- Needs cryogenic grinding, sonication, and immunoprecipitation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for chromatin preparation and antibody validation.
- Involves adaptation considerations across model systems and histone modification targets.
- Includes practical limitations such as tissue accessibility and formaldehyde handling hazards.
