用三维定量相位成像和机器学习技术对淋巴细胞亚型进行无标签鉴定

此方法为传统的荧光标记和流式细胞学分析程序提供了替代方案，这些过程既耗时又昂贵，并且存在改变样品细胞功能的风险。该技术的主要优点是三维折射率断层扫描和机器学习是无标签和定量的方法，能够快速准确地识别淋巴细胞。该技术的影响扩展到血液癌和自身免疫性疾病的治疗，因为淋巴细胞的鉴定对于疾病诊断和适当的治疗应用至关重要。

虽然这种方法可以提供对淋巴细胞群的洞察，但它也可以应用于其他感兴趣的单细胞的分析，包括细菌。3D 定量相位成像技术的可视化演示至关重要，因为它有助于明确指导如何执行该技术，并可以深入了解其应用。首先通过荧光激活细胞排序收集每个淋巴细胞子集。

为了获得最佳成像效果，将每个细胞样品稀释至每微升RPMI介质180个细胞的浓度，然后缓慢地将第一个稀释样品的120微升注入成像室。在确认腔室内无气泡后，将一滴蒸馏水放在三D定量相显微镜的物镜上，然后将成像室置于显微镜的翻译阶段。调整阶段，使样品与物镜对齐，并分别单击成像软件显微镜透视的校准选项卡中的对焦和表面，分别调整物镜和冷凝器镜头的轴向位置。

单击"自动"模式可对齐目标镜头和冷凝器镜头。要优化校准，请打开扫描模式并手动调整镜头，使数字微镜设备模式与中心对齐。然后，返回到"正常"模式并调整平移阶段以在视野中定位单元格。

调整客观透镜的轴向位置以找到焦平面，直到屏幕上显示的样本边界几乎不可见。必须完美调整细胞的焦点，以生成最佳的 3DRI 汤姆形图。如果图像拍摄不正确，3D 重建将受到损害，从而产生嘈杂的汤姆形图。

调整平移阶段以查找没有单元格的位置，然后单击"校准"以测量具有不同照明角度的多个 2D 全息图。调整平移阶段以定位视图区域中心的单元格。在"获取"选项卡下，命名要成像的示例。

单击 3D 快照，使用与刚刚测量的 2D 全息图相同的照明角度测量单元格的全息图。当采集的数据出现在数据管理面板中时，右键单击数据并单击"过程"，使用成像软件中实现的去射断层扫描算法从 2D 全息图中重建 3D 折射率托马图。成像后，在"数据管理"面板中，右键单击数据，然后单击"打开"以可视化数据。

单击单元格的中心以重新定位它，然后单击数据管理器面板上的 RI 汤姆图。在"预设"选项卡上单击"加载"和"双击淋巴细胞"。xml，这是成像软件提供的预定义传输函数，用于根据 3DRI 分布可视化汤姆图。

滚动鼠标以放大并拖动单元格以旋转任何方向。对于定量形态学和生化特征提取，将所有断层扫描数据放在单个文件夹中，并在主文件夹中的单个子文件夹中拆分细胞类型。接下来，在相应的成像软件中打开补充功能提取文件，并编辑第 14 行，以指定从中提取数据的汤姆图文件夹。

编辑第 15 行以指定要将提取的要素数据保存到的文件夹并执行代码。对于数据集中的每个汤姆图，代码将计算表面积、细胞体积、球面、蛋白质密度和干质量每折射率阈值。对于监督学习和识别，请使用 MATLAB 中的简单随机拆分算法将提取的要素数据随机拆分为单独的训练和测试集文件夹。

打开补充训练文件并编辑行 14 以指定训练集文件夹，第 16 行指定用于保存训练分类器的文件夹，第 17 行为分类器设置文件名。然后执行代码。使用训练集的选定功能，代码将训练具有 K 最近邻算法的分类器，并将分类器保存在指定的文件夹中。

接下来，打开补充测试文件三，编辑行 14 到 15 以指定要测试的训练分类器，第 17 行指定训练测试集。然后执行代码。分类器将识别测试集中单个淋巴细胞的细胞类型。

这里代表的3D渲染率率图的B淋巴细胞，CD4阳性T淋巴细胞，CD8阳性T淋巴细胞具有不同配色方案，根据通过成像软件分配的折射率值分配显示。从折射率值可以计算定量形态和生化特征。在该实验中，训练和试验例的T和B淋巴细胞分类精度分别是93.15%和89.81%。

对CD4阳性和CD8阳性的T淋巴细胞进行了统计分类，训练和测试组准确率分别是87.41%和84.38%。最后，多类、细胞类型分类器在训练和测试阶段的精度分别是80.65%和75.93%。图像的质量和数量对于这项技术的成功至关重要。

图像质量越好，数据量越高，识别的准确性越好。深度学习可用于更全面地分析汤姆图的复杂数据，提高识别性能。此外，荧光和三维定量相位成像可用于研究已识别淋巴细胞的生理作用路径。

这项技术开发后，为细胞生物学和生物医学领域的研究人员探索不同生物体内感兴趣的特定疾病铺平了道路。事实上，特别是免疫学家，可能受益于使用这项新技术来识别感兴趣的人群。