Name: 附睾蛋白的合成与分泌分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学习免疫荧光定位与蛋白质分离技术，用于分析小鼠附睾组织中dynamin蛋白的分布特征及分泌蛋白组成。该方法为研究生殖生物学中的精子成熟调控机制提供了重要的实验方案。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者谨此感谢澳大利亚国家卫生与医学研究委员会项目资助 APP1103176 对本工作的支持。

所有涉及动物组织采集的实验操作均经纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会批准。
1. 石蜡包埋附睾切片的免疫荧光染色（图1和图2）
<ol>
	<li>在通过 CO₂ 处死成年小鼠后立即进行后续操作2 吸入麻醉（Swiss小鼠，8周龄以上），用手术剪和镊子仔细解剖附睾，去除表面的结缔组织和脂肪，然后浸入Bouin固定液中（&#62; 十倍体积/组织重量的固定液进行过夜固定。</li>
	<li>用70%乙醇洗涤组织2次&#215; 每日更换一次，持续2天，然后依次通过梯度乙醇（70%、95%和100%）脱水，以备后续浸润并包埋于石蜡块中。</li>
	<li>将石蜡包埋块切成4-6 μm厚度的切片 &#181;m 并置于载玻片上，以备免疫荧光染色。</li>
	<li>在通风橱中，向切片罐中加入足量二甲苯以完全浸没组织切片，对附睾石蜡切片进行脱蜡处理（3次，每次5分钟）&#215; 每次5分钟。</li>
	<li>通过将组织切片浸入用纯化水稀释的梯度浓度乙醇溶液中进行复水2O（100%乙醇5分钟，100%乙醇5分钟，90%乙醇1分钟，80%乙醇1分钟，70%乙醇1分钟，50%乙醇1分钟）。</li>
	<li>用足量的磷酸盐缓冲液（PBS）在切片缸中清洗切片一次，每次5分钟，确保完全浸没整个组织切片（后续所有清洗步骤均按此方法进行）。</li>
	<li>倾倒适量的抗原修复液（即，10 mmol/L 柠檬酸钠，50 mmol/L Tris（pH 10.5）或其他抗原修复溶液，具体根据待检测抗原选择）加入染色架中，并放入微波炉加热至沸腾。将切片浸入该溶液中，在针对不同抗体优化的条件下进行热诱导抗原修复（参见 表1). 
	注意：抗原修复过程中，确保切片完全浸没于抗原修复液中。</li>
	<li>从微波炉中取出载玻片容器，并冷却至室温。</li>
	<li>用 PBS 冲洗载玻片，并使用防液体扩散的标记笔在组织切片周围画圈。</li>
	<li>将载玻片置于湿盒中（盒底放置湿润的纸巾以创造湿化环境），加入封闭液（3% BSA/PBS，预先经0.45 μm滤膜过滤）， &#181;m 滤器）中在 37℃ 下孵育 1 小时 &#176;C.</li>
	<li>用 PBS 冲洗载玻片一次。</li>
	<li>在4℃下，将切片与适当的一抗在经滤膜过滤的1% BSA/PBS溶液中孵育，一抗稀释至实验优化的浓度 &#176;C 过夜（抗 DNM1、DNM2 和 DNM3 抗体按 1:60 稀释，抗 ATP6V1B1 抗体按 1:100 稀释，见 材料表 抗体详情参见）。 
	注意：为了区分特异性与非特异性抗体结合，必须设置严格的阴性对照（即.，仅二抗，一抗与免疫肽预吸附）及阳性对照24.</li>
	<li>将载玻片置于室温下30分钟以重新温育。</li>
	<li>洗涤载玻片 3 次&#215; 在摇床平台（60 rpm）上用 PBS 洗涤，每次 10 分钟。</li>
	<li>用适当稀释于1% BSA/PBS（经0.45 μm滤膜过滤）中的二抗孵育切片 &#181;m 滤器）在 37 ℃ &#176;C，1 小时（所有二抗均为 1:400 稀释，参见 材料表 有关抗体详细信息）。 
	警告：从这一步开始，将载玻片容器避光保存。对于双重标记，应选择兼容的二抗组合（即．，二抗必须由不同物种产生。</li>
	<li>洗涤载玻片 3 次&#215; 在摇床（60 rpm）上用 PBS 洗涤，每次 10 分钟。</li>
	<li>用碘化丙啶（PI，7.48 &#956;mol/L）或 4&#900;，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，4.37 &#956;mol/L) 室温孵育 2 分钟以标记细胞核。</li>
	<li>在摇床上用 PBS 洗涤载玻片两次，每次 5 分钟（60 rpm）。</li>
	<li>使用含30%甘油的0.2 mol/L Tris（pH 8.5）溶液配制的10% Mowiol 4-88封片，其中添加2.5% 1,4-二氮杂双环[2.2.2]-辛烷。</li>
	<li>用指甲油封固盖玻片，并将载玻片置于 4 ℃ 保存 &#176;用于后续观察。 
	注意：建议在制片完成后尽快进行切片成像，以避免荧光信号过度淬灭。</li>
</ol>
2&#160; 从小鼠附睾头分离附睾小体（图3）
<ol>
	<li>在通过 CO₂ 安乐死成年小鼠后立即进行操作2 吸入麻醉（8周龄以上瑞士小鼠），用预热至37℃的PBS灌注其血管系统 &#176;C）以尽量减少血液对附睾组织的污染。 
	注意：血液血浆中含有多种外泌体，其大小与附睾小体相似25. 可通过检查初始段来评估血液从附睾组织清除的效率，初始段是位于附睾头段近端的一个高度血管化的附睾节段（即，第1区 图 1A)</li>
	<li>仔细剥离附着在附睾表面的脂肪和结缔组织，用改良的Biggers、Whitten和Whittingham培养基（BWW；pH 7.4，渗透压为300 mmol/kg水）冲洗26,27以减少表面血液污染的任何潜在可能。</li>
	<li>用吸水纸吸去附睾组织上多余的培养基，解剖分离附睾头组织（即，第2-5区 图1A）并转移至新的培养皿（35 &#215; 10 mm）中加入BWW培养基。确保培养基的量足以用于最终回收。 
	注意：对于6个附睾头，建议使用1.1 mL培养基，以获得约900的回收率 &#181;L，然后均分为两份，分别加至两个预先制备的梯度液（见步骤2.9）上方。</li>
	<li>用剃刀在头段组织上做若干小切口。不要研磨组织，以避免样本被过多的胞质成分污染。将含有组织的培养板在37℃下轻轻振荡孵育。 &#176;C&#160;孵育30分钟以释放管腔内容物。</li>
	<li>将所得悬液经70 &#181;m 膜以去除细胞碎片。</li>
	<li>收集滤液，并在4℃下进行连续离心步骤 &#176;C，速度逐渐增加，以去除细胞碎片（即., 500 &#215; g, 2,000 &#215; g, 4,000 &#215; g, 8,000 &#215; g，每次5分钟；17,000 &#215; g 20 分钟，最后 17,000 &#215; g 再离心10分钟，或直至离心后无沉淀形成。 
	注意：初次500 × g离心后，务必评估沉淀物的颜色。 &#215; g 离心步骤以确保最大程度减少血液污染。若该沉淀呈现粉红色，则弃去相应样品。</li>
	<li>通过将密度梯度介质（含60% (w/v) 碘克沙醇水溶液）用含有0.25 mol/L蔗糖和10 mmol/L Tris (pH 7.5) 的溶液稀释，制备不连续碘克沙醇梯度（包括40%、20%、10%、5% 的梯度层）。</li>
	<li>在超速离心管（11 &#215; 35 mm），每份450 &#181;L图3）。每次加入组分后需目视检查梯度，以确保各层之间形成清晰的界面，然后再加载附睾液样本。每根梯度液应在使用当天新鲜配制，但附睾管腔液样本可在4 °C保存 &#176;C，持续最多2小时，然后上样。</li>
	<li>小心地加入 450 &#181;来自3个附睾头收集的附睾管腔液体悬浮液1 L（对应于单个梯度上方的样品量）。</li>
	<li>以 160,000 × g 超速离心梯度 &#215; g 在 4 &#176;18 小时，4 °C 
	警告：由于该离心步骤在极高速度下进行，所有超速离心管必须精确配对并平衡。检查离心管，确保其无任何可能影响完整性的可见损伤。</li>
	<li>轻轻移取12个等份的组分（每份包含185 &#181;L）从梯度的最上层开始，逐步向下收集各层。若适用，合并从每个梯度中收集的相应组分（最多两个梯度）。 
	注：小鼠附睾体外囊泡在第9–11组分中富集程度最高22，参见 图 4 以及讨论。</li>
	<li>收集并合并第9–11组分后，用2 mL PBS稀释，于100,000 × g超速离心 &#215; g 在 4 &#176;C，3 小时（13 &#215; 56 mm 管）以沉淀附睾体外小泡（epididymosomes）。 
	注意：由于附睾小体沉淀物可能难以观察，将离心管放入转子时应记录其方向，并在管壁上标记以指示附睾小体沉淀物的预期位置。确保每根离心管中含有足够的体积（即，超过其总容量的50%），以避免试管塌陷的风险。</li>
	<li>小心吸出并弃去上清液，切勿扰动附睾体沉淀。</li>
	<li>评估附睾小体的纯度（图4).</li>
	<li>将附睾体外囊泡沉淀重悬于根据下游应用需求选择的适当培养基中。例如，BWW培养基通常用于与精子共孵育的实验，或选用适当的裂解缓冲液以备通过SDS-PAGE分离附睾蛋白质组。</li>
</ol>
3. mECap18 细胞的免疫荧光染色
<ol>
	<li>无菌盖玻片的制备（在细胞培养罩内进行）
	<ol>
		<li>将盖玻片（12 × 12 mm）浸入70%乙醇中10分钟，并在乙醇灯火焰上方高温干燥消毒。</li>
		<li>待盖玻片冷却10秒后，转移至12孔板中。</li>
		<li>加入无菌的多聚赖氨酸（poly-L-lysine）溶液覆盖盖玻片，室温下孵育10分钟。</li>
		<li>弃去多聚赖氨酸溶液，用无菌H2O或适当培养基冲洗盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>mECap18细胞的制备
	<ol>
		<li>将2 × 105个mECap18细胞分装至含盖玻片的12孔板各孔中进行传代培养。</li>
		<li>在含10%胎牛血清（FBS）的mECap18细胞培养基（DMEM补充1% L-谷氨酰胺、1%丙酮酸钠、1%青霉素/链霉素和50 μmol/L 5α-雄烷-17β-醇-3-酮C-IIIN）中，于37 °C、5% CO2培养箱中过夜培养细胞。</li>
		<li>待细胞贴附于盖玻片后，弃去培养基，并用PBS洗涤细胞两次。</li>
		<li>加入足量经PBS稀释的4%多聚甲醛（PFA），完全浸没盖玻片，室温固定细胞15分钟。</li>
		<li>弃去PFA溶液，用PBS冲洗盖玻片两次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>免疫荧光染色
	<ol>
		<li>将mECap18细胞浸入含0.1% Triton X-100的PBS中，室温下透化处理10分钟。</li>
		<li>用PBS冲洗盖玻片。</li>
		<li>用3% BSA封闭mECap18细胞，随后采用与附睾组织切片描述相同的方法进行细胞免疫标记。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 从条件培养基中分离蛋白质
<ol>
	<li>收集条件培养基
	<ol>
		<li>将 4 × 105 个 mECap18 细胞接种于 6 孔板的每孔中，使用含 10% FBS 的 mECap18 细胞培养基培养 24&#160;h。</li>
		<li>用不含 FBS 的 mECap18 细胞培养基洗涤 mECap18 细胞三次，以去除残留的 FBS 及相关蛋白污染物。</li>
		<li>向每孔中加入 1.5 mL 不含 FBS 的 mECap18 细胞培养基，并在 37°C、5% CO2 条件下孵育 12 h。 
		注意：在此步骤中，可根据实验设计对 mECap18 细胞进行不同靶抗原的检测。</li>
		<li>孵育 12 h 后，收集细胞培养基，并在 2,000 × g 条件下离心 10 min，以去除所有细胞碎片。 
		注意：孵育时间可根据实验设计/终点评估以及细胞对处理措施的耐受性进行调整。建议根据具体的实验方案优化孵育时间，以确保获得最佳结果。</li>
		<li>通过标准台盼蓝排斥实验28评估 mECap18 细胞活力。若细胞活力低于 90%，则弃去所有材料，以避免死细胞或濒死细胞释放的蛋白造成偏差。</li>
		<li>按以下步骤从细胞培养基中分离蛋白，或将其在 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白分离（需在通风橱中操作）
	<ol>
		<li>向 80% 体积的条件培养基中加入 20% 体积的预冷 100% 三氯乙酸，以沉淀培养的 mECap18 细胞所释放的蛋白。4 °C 条件下持续混匀过夜孵育。</li>
		<li>孵育后，通过离心（17,000 × g，4 °C，10 min）收集沉淀的蛋白。 
		注意：由于预期分泌到培养基中的蛋白量较少，离心后沉淀可能不易观察。因此，在离心前必须正确标记离心管方向，并在去除上清液时小心操作，避免扰动预期沉淀的位置。</li>
		<li>弃去上清液，并用预冷丙酮洗涤沉淀两次，每次洗涤后重新离心（17,000 × g，4 °C，10 min）。</li>
		<li>小心移除并弃去上清液，随后在通风橱中将残留丙酮空气干燥。</li>
		<li>将蛋白沉淀重悬于适当的裂解缓冲液中，用于后续终点分析，以检测完整的分泌蛋白谱和/或特定靶蛋白（例如，SDS-PAGE、免疫印迹）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, W., De Iuliis, G. N., Dun, M. D., Nixon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+Epididymal+Luminal+Environment+Responsible+for+Sperm+Maturation+and+Storage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the Epididymal Luminal Environment Responsible for Sperm Maturation and Storage.</a> Frontiers in Endocrinology. 9, 59(2018).</li>
<li>Dacheux, J. L., Gatti, J. L., Dacheux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+epididymal+secretory+proteins+for+spermatozoa+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+research+and+technique%22%5BJournal%5D)">Contribution of epididymal secretory proteins for spermatozoa maturation.</a> Microscopy research and technique. 61 (1), 7-17 (2003).</li>
<li>Aitken, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+changes+in+mammalian+spermatozoa+during+epididymal+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+journal+of+andrology%22%5BJournal%5D)">Proteomic changes in mammalian spermatozoa during epididymal maturation.</a> Asian journal of andrology. 9 (4), 554-564 (2007).</li>
<li>Hermo, L., Dworkin, J., Oko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+epithelial+clear+cells+of+the+rat+epididymis+in+the+disposal+of+the+contents+of+cytoplasmic+droplets+detached+from+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+anatomy%22%5BJournal%5D)">Role of epithelial clear cells of the rat epididymis in the disposal of the contents of cytoplasmic droplets detached from spermatozoa.</a> The American journal of anatomy. 183 (2), 107-124 (1988).</li>
<li>Robaire, B., Hinton, B., Orgebin-Crist, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRobaire%2C+B+%22The+epididymis%22">The epididymis</a>. 3, Knobil and Neill's Physiology of Reproduction. (2006).</li>
<li>Nixon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+dissociation+of+sperm+bundles+in+monotremes%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation and dissociation of sperm bundles in monotremes.</a> Biology of Reproduction. 95 (4), (2016).</li>
<li>Cleland, K. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/248900780_The_structure_and_fuction_of_the_Epididymis_1_The_histology_of_the_Rat_Epididymis">The structure and fuction of the Epididymis. 1. The histology of the Rat Epididymis.</a> Australian Journal of Zoology. 5 (3), 223-246 (1957).</li>
<li>Belleannée, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+luminal+and+secreted+proteins+in+bull+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of luminal and secreted proteins in bull epididymis.</a> Journal of proteomics. 74 (1), 59-78 (2011).</li>
<li>Turner, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Graaf%27s+thread%3A+the+human+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+andrology%22%5BJournal%5D)">De Graaf's thread: the human epididymis.</a> Journal of andrology. 29 (3), 237-250 (2008).</li>
<li>Holland, M. K., Nixon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specificity+of+epididymal+secretory+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+reproduction+and+fertility%22%5BJournal%5D)">The specificity of epididymal secretory proteins.</a> Journal of reproduction and fertility. 53, 197-210 (1998).</li>
<li>Cooper, T. G., Hing-Heiyeung, C., Nashan, D., Nieschlag, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3290172">Epididymal markers in human infertility.</a> Journal of andrology. 9 (2), 91-101 (1988).</li>
<li>Turner, T. T., Johnston, D. S., Jelinsky, S. A., Tomsig, J. L., Finger, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segment+boundaries+of+the+adult+rat+epididymis+limit+interstitial+signaling+by+potential+paracrine+factors+and+segments+lose+differential+gene+expression+after+efferent+duct+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+journal+of+andrology%22%5BJournal%5D)">Segment boundaries of the adult rat epididymis limit interstitial signaling by potential paracrine factors and segments lose differential gene expression after efferent duct ligation.</a> Asian journal of andrology. 9 (4), 565-573 (2007).</li>
<li>Garrett, S. H., Garrett, J. E., Douglass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+histochemical+analysis+of+region-specific+gene+expression+in+the+adult+rat+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+reproduction+and+development%22%5BJournal%5D)">In situ histochemical analysis of region-specific gene expression in the adult rat epididymis.</a> Molecular reproduction and development. 30 (1), 1-17 (1991).</li>
<li>Lareyre, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+5-kilobase+pair+promoter+fragment+of+the+murine+epididymal+retinoic+acid-binding+protein+gene+drives+the+tissue-specific%2C+cell-specific%2C+and+androgen-regulated+expression+of+a+foreign+gene+in+the+epididymis+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A 5-kilobase pair promoter fragment of the murine epididymal retinoic acid-binding protein gene drives the tissue-specific, cell-specific, and androgen-regulated expression of a foreign gene in the epididymis of transgenic mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 8282-8290 (1999).</li>
<li>Cornwall, G. A., Orgebin-Crist, M. C., Hann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRES+gene%3A+a+unique+testis-regulated+gene+related+to+the+cystatin+family+is+highly+restricted+in+its+expression+to+the+proximal+region+of+the+mouse+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The CRES gene: a unique testis-regulated gene related to the cystatin family is highly restricted in its expression to the proximal region of the mouse epididymis.</a> Molecular Endocrinology. 6 (10), 1653-1664 (1992).</li>
<li>Nixon, B., Jones, R. C., Hansen, L. A., Holland, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+epididymal+secretory+proteins.+I.+Characterization+and+hormonal+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Rabbit epididymal secretory proteins. I. Characterization and hormonal regulation.</a> Biology of Reproduction. 67 (1), 133-139 (2002).</li>
<li>Nixon, B., Jones, R. C., Clarke, H. G., Holland, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+epididymal+secretory+proteins.+II.+Immunolocalization+and+sperm+association+of+REP38%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Rabbit epididymal secretory proteins. II. Immunolocalization and sperm association of REP38.</a> Biology of Reproduction. 67 (1), 140-146 (2002).</li>
<li>Nixon, B., Hardy, C. M., Jones, R. C., Andrews, J. B., Holland, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+epididymal+secretory+proteins.+III.+Molecular+cloning+and+characterization+of+the+complementary+DNA+for+REP38%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Rabbit epididymal secretory proteins. III. Molecular cloning and characterization of the complementary DNA for REP38.</a> Biology of Reproduction. 67 (1), 147-153 (2002).</li>
<li>Jelinsky, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rat+epididymal+transcriptome%3A+comparison+of+segmental+gene+expression+in+the+rat+and+mouse+epididymides%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The rat epididymal transcriptome: comparison of segmental gene expression in the rat and mouse epididymides.</a> Biology of Reproduction. 76 (4), 561-570 (2007).</li>
<li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15878890">The Mouse Epididymal Transcriptome: Transcriptional Profiling of Segmental Gene Expression in the Epididymis 1.</a> Biology of Reproduction. 73 (3), 404-413 (2005).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+expression+of+the+dynamin+family+of+mechanoenzymes+in+the+mouse+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Developmental expression of the dynamin family of mechanoenzymes in the mouse epididymis.</a> Biology of Reproduction. 96 (1), 159-173 (2017).</li>
<li>Reilly, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+mouse+epididymosomes+reveals+a+complex+profile+of+microRNAs+and+a+potential+mechanism+for+modification+of+the+sperm+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Characterisation of mouse epididymosomes reveals a complex profile of microRNAs and a potential mechanism for modification of the sperm epigenome.</a> Scientific reports. 6, (2016).</li>
<li>Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epididymosomes%3A+a+heterogeneous+population+of+microvesicles+with+multiple+functions+in+sperm+maturation+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+journal+of+andrology%22%5BJournal%5D)">Epididymosomes: a heterogeneous population of microvesicles with multiple functions in sperm maturation and storage.</a> Asian journal of andrology. 17 (5), 726-729 (2015).</li>
<li>Reid, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase+3+regulates+acrosomal+exocytosis+in+mouse+spermatozoa+via+dynamin+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase 3 regulates acrosomal exocytosis in mouse spermatozoa via dynamin phosphorylation.</a> The FASEB Journal. 29 (7), 2872-2882 (2015).</li>
<li>Danesh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+red+blood+cell+units+bind+to+monocytes+and+induce+proinflammatory+cytokines%2C+boosting+T-cell+responses+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Exosomes from red blood cell units bind to monocytes and induce proinflammatory cytokines, boosting T-cell responses in vitro.</a> Blood. 123 (5), 687-696 (2014).</li>
<li>Anderson, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+microRNA+expression+in+mouse+epididymal+epithelial+cells+and+spermatozoa+by+next+generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+data%22%5BJournal%5D)">Assessment of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells and spermatozoa by next generation sequencing.</a> Genomics data. 6, 208-211 (2015).</li>
<li>Biggers, J., Whitten, W., Whittingham, D. The culture of mouse embryos in vitro. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiggers%2C+J+%22Methods+in+mammalian+embryology%22">Methods in mammalian embryology</a>. Daniels, J. , San Francisco: Freeman. 86-116 (1971).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Current protocols in immunology. , A3. B. 1-A3. B. 3 (2001).</li>
<li>Elkjær, M. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunolocalization+of+AQP9+in+liver%2C+epididymis%2C+testis%2C+spleen%2C+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+biophysical+research+communications%22%5BJournal%5D)">Immunolocalization of AQP9 in liver, epididymis, testis, spleen, and brain.</a> Biochemical and biophysical research communications. 276 (3), 1118-1128 (2000).</li>
<li>Gregory, M., Dufresne, J., Hermo, L., Cyr, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-1+is+not+restricted+to+tight+junctions+in+the+rat+epididymis%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Claudin-1 is not restricted to tight junctions in the rat epididymis.</a> Endocrinology. 142 (2), 854-863 (2001).</li>
<li>Isnard-Bagnis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ClC-3+and+ClC-5+in+epididymal+epithelium%3A+immunofluorescence+and+RT-PCR+after+LCM%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Detection of ClC-3 and ClC-5 in epididymal epithelium: immunofluorescence and RT-PCR after LCM.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 284 (1), C220-C232 (2003).</li>
<li>Rojek, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+glycerol+metabolism+in+aquaporin+9+%28AQP9%29+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Defective glycerol metabolism in aquaporin 9 (AQP9) knockout mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (9), 3609-3614 (2007).</li>
<li>Shum, W. W., Da Silva, N., Brown, D., Breton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+luminal+acidification+in+the+male+reproductive+tract+via+cell-cell+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of luminal acidification in the male reproductive tract via cell-cell crosstalk.</a> Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1753-1761 (2009).</li>
<li>Shum, W. W., Ruan, Y. C., Silva, N., Breton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+cell-cell+cross+talk+in+the+epididymis%3A+Control+of+luminal+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+andrology%22%5BJournal%5D)">Establishment of cell-cell cross talk in the epididymis: Control of luminal acidification.</a> Journal of andrology. 32 (6), 576-586 (2011).</li>
<li>Sipilä, P., Shariatmadari, R., Huhtaniemi, I. T., Poutanen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+epididymal+epithelium+in+transgenic+mice+expressing+simian+virus+40+T+antigen%3A+characterization+of+cell+lines+and+regulation+of+the+polyoma+enhancer+activator+3%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Immortalization of epididymal epithelium in transgenic mice expressing simian virus 40 T antigen: characterization of cell lines and regulation of the polyoma enhancer activator 3.</a> Endocrinology. 145 (1), 437-446 (2004).</li>
<li>Feugang, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+relaxin+and+its+receptor+proteins+in+boar+reproductive+tissues+and+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Profiling of relaxin and its receptor proteins in boar reproductive tissues and spermatozoa.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 46(2015).</li>
<li>Gullberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+detection+by+antibody-based+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytokine detection by antibody-based proximity ligation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (22), 8420-8424 (2004).</li>
<li>Frenette, G., Girouard, J., Sullivan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+epididymosomes+collected+in+the+intraluminal+compartment+of+the+bovine+caput+and+cauda+epididymidis%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Comparison between epididymosomes collected in the intraluminal compartment of the bovine caput and cauda epididymidis.</a> Biology of Reproduction. 75 (6), 885-890 (2006).</li>
<li>Fornes, M., Barbieri, A., Sosa, M., Bertini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+observations+on+enzymatic+activity+and+protein+content+of+vesicles+separated+from+rat+epididymal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">First observations on enzymatic activity and protein content of vesicles separated from rat epididymal fluid.</a> Andrologia. 23 (5), 347-351 (1991).</li>
<li>Eickhoff, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+macrophage+migration+inhibitory+factor+%28MIF%29+on+the+zinc+content+and+redox+state+of+protein-bound+sulphydryl+groups+in+rat+sperm%3A+indications+for+a+new+role+of+MIF+in+sperm+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+human+reproduction%22%5BJournal%5D)">Influence of macrophage migration inhibitory factor (MIF) on the zinc content and redox state of protein-bound sulphydryl groups in rat sperm: indications for a new role of MIF in sperm maturation.</a> Molecular human reproduction. 10 (8), 605-611 (2004).</li>
<li>Lötvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
<li>Hutcheon, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+small+non-protein-coding+RNA+profile+of+mouse+spermatozoa+reveals+specific+enrichment+of+piRNAs+within+mature+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the small non-protein-coding RNA profile of mouse spermatozoa reveals specific enrichment of piRNAs within mature spermatozoa.</a> RNA biology. 14 (12), 1776-1790 (2017).</li>
<li>Bennett, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+of+the+spread+of+antibiotic+resistance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Annali+dell%27Istituto+superiore+di+sanita%22%5BJournal%5D)">Genetic basis of the spread of antibiotic resistance genes.</a> Annali dell'Istituto superiore di sanita. 23 (4), (1987).</li>
<li>Nixon, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+analysis+reveals+segmental+patterns+of+microRNA+expression+in+mouse+epididymal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing analysis reveals segmental patterns of microRNA expression in mouse epididymal epithelial cells.</a> PloS one. 10 (8), e0135605(2015).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

这些研究采用了经Bouin固定液固定的附睾组织，该组织经过石蜡包埋及标准切片流程处理。Bouin固定液由甲醛、苦味酸和乙酸混合而成，其中各组分具有特定且互补的功能：甲醛与伯胺反应形成蛋白质交联；苦味酸缓慢渗透组织，形成盐类从而导致碱性蛋白质凝固；而乙酸则快速渗透组织，引起核酸凝固。这些综合作用使Bouin固定液成为保存组织形态学细节的首选固定剂，在附睾相关文献中被广泛使用。然而，Bouin固定液也存在局限性，包括可能引起固定液自身荧光以及甲醛诱导的交联反应，后者可能掩盖目标抗原。
背景荧光的可能性要求使用严格的阴性对照，本研究中的阴性对照包括：省略一抗、省略二抗，以及在试剂可获得的情况下，使用针对其来源免疫肽段预先吸附过的一抗。此类对照的应用细节已在我们先前关于小鼠附睾中动力蛋白DNM表达的研究中得到示例。21理想情况下，这些结果还应通过敲除动物来源的组织进行验证，然而这类材料并非总是易于获得。为应对交联或化学修饰导致的靶抗原次级问题，通常需要进行某种形式的抗原修复，以暴露因固定而改变的表位，从而恢复其与抗体结合的能力。所采用的修复方...

所有哺乳动物物种的精子在通过附睾这一雄性睾丸外导管系统中的高度特化区域的长期下行过程中，获得表现出前向进行性运动能力和使卵子受精的潜能，这一过程可能需要7至14天（取决于物种）1。由于精子在睾丸内发生细胞分化时父源染色质高度浓缩，并丢失了大部分细胞质，其后续的功能成熟完全依赖于与附睾微环境的相互作用。而该微环境则由附睾衬里体细胞的分泌和吸收活动所形成，并表现出显著的区段间差异1。因此，在蛋白质合成和分泌方面最活跃的区段位于附睾的近端部分（即头段和体段）2。这种活动模式与精子的功能特征相呼应：精子在通过附睾头段后，开始表现出功能成熟的关键标志（即，进行性运动能力以及结合酸溶解带状糖蛋白的能力）3。这些功能特性继续发育，直至精子到达远端附睾区段（尾段）时达到最佳水平，精子在此以静息状态储存，为射精做好准备。这一精子储存库的形成与维持也与衬里上皮密切相关，在附睾尾段，上皮主要表现出强烈的吸收活性4,5。尽管已有解剖学差异的报道6,7,8，但这种区域化的功能分工似乎是迄今研究过的大多数哺乳动物物种（包括人类）附睾的共同特征9,10。事实上，从临床角度来看，已知附睾功能障碍在男性因素不孕症的病因中具有重要影响11，这进一步凸显了理解这一特化组织调控机制的重要性。
因此，令人遗憾的是，我们对附睾生理学以及调控精子在此组织内成熟和储存各个连续阶段的机制仍未能完全阐明。在诸多影响因素中，限制附睾研究进展的主要原因是该组织整体上的复杂性，以及对调控其管腔微环境机制的认识尚不充分。解剖学上，我们已知除了头、体、尾三段的区分外，附睾还可进一步细分为多个区段（图1A），各区段由隔膜分隔，并具有各自独特的基因/蛋白表达谱型12，且在基因/蛋白表达方面表现出明显的差异13,14,15,16,17,18。事实上，根据对小鼠和大鼠模型中附睾节段性基因表达的详细转录谱分析，分别已报道存在多达6个和9个不同的附睾区段19,20。这种复杂性可能反映了附睾体细胞的组成情况：一种假复层上皮，包含多种不同类型的细胞，这些细胞在数量、分布以及沿管道长度方向的分泌/吸收活性方面各不相同。其中，主细胞是迄今为止最丰富的附睾细胞类型，占所有上皮细胞的80%以上。因此，主细胞负责大部分附睾蛋白的生物合成与分泌5。相比之下，透明细胞群体是附睾体细胞中数量第二丰富的细胞类型，主要参与管腔成分的选择性吸收以及该微环境的酸化过程5。更进一步增加复杂性的是，雄激素及其他来源于睾丸的管腔内分泌因子，会根据不同细胞在管道中的位置，对上述各类附睾细胞施加差异化的调控作用。
尽管这种复杂性带来了诸多限制，但关于附睾功能机制基础的研究仍在不断取得重要进展。这些研究的关键在于应用先进的质谱技术，大规模鉴定附睾蛋白质组，并结合对初步筛查中选出的特定蛋白质进行深入分析。我们近期在小鼠模型中对DNM家族机械酶的研究便是这一策略的例证21。我们最初关注DNM，是因其在偶联胞吐与胞吞过程中的双重作用。基于这些发现，我们进一步证实了DNM的三种经典亚型（DNM1 - DNM3）在小鼠附睾中高度表达，并处于适宜的位置，可发挥调控蛋白质分泌与吸收的功能21。此外，我们能够根据各DNM亚型在细胞及亚细胞水平上的定位差异明确区分它们，提示这些亚型在附睾上皮中具有互补而非冗余的功能活性21。
本文描述了用于研究小鼠附睾中DNM表达的实验方法，旨在使该信息能够更广泛地应用于其他附睾蛋白的表征，从而增进我们对这一雄性生殖道重要组成部分功能的理解。具体而言，我们介绍了针对石蜡包埋附睾切片中靶蛋白进行免疫荧光标记的可靠方法的建立过程，并通过免疫荧光显微镜检测这些蛋白的空间分布。此外，我们还记录了近期优化的实验方案22 用于分离和表征附睾体；附睾体是一类小型外泌体样囊泡，构成附睾分泌谱的关键组分，并在促进精子成熟过程中发挥重要作用23作为补充方法，我们还描述了在永生化的小鼠附睾头部上皮（mECap18）细胞系中对目标蛋白进行免疫荧光检测，并介绍了利用该资源作为模型来研究附睾分泌活性调控的应用。 体外.

<table><tbody><tr><td>动力蛋白1抗体</td><td>Abcam</td><td>ab108458</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 兔, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>动力蛋白2抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6400</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 山羊, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>动力蛋白3抗体</td><td>Proteintech</td><td>14737-1-AP</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 兔, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>ATP6V1B1抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-21206</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 山羊, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>CD9抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553758</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 大鼠, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 单克隆</td></tr><tr><td>Flotillin-1抗体</td><td>Sigma</td><td>F1180</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 兔, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>ALOX15抗体</td><td>Abcam</td><td>ab80221</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 兔, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>TUBB抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5274</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 小鼠, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 单克隆</td></tr><tr><td>PSMD7抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11436</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 兔, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>抗兔Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11008</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 山羊, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>抗山羊Alexa Fluor 488</td><td>Thermo</td><td>A11055</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 驴, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>抗山羊Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11058</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 驴, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>抗大鼠Alexa Fluor 594</td><td>Thermo</td><td>A11007</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 山羊, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>抗兔HRP</td><td>Millipore</td><td>DC03L</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 山羊, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>抗大鼠HRP</td><td>Millipore</td><td>DC01L</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 山羊, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>抗小鼠HRP</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2005</td><td>&lt;strong&gt;宿主物种&lt;/strong&gt;: 山羊, &lt;strong&gt;同种型&lt;/strong&gt;: IgG, &lt;strong&gt;类别&lt;/strong&gt;: 多克隆</td></tr><tr><td>4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）</td><td>Sigma</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶（PI）</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Bovogen</td><td>SFBS-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Thermo</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>5&amp;alpha;-雄烷-17&amp;beta;-醇-3-酮C-IIIN</td><td>Sigma</td><td>A8380</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermo</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA）</td><td>EMS</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>VWR Chemicals</td><td>1330-20-7</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR Chemicals</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma</td><td>S1804</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Astral</td><td>0497-5KG</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷</td><td>Sigma</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Sigma</td><td>78787</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Sigma</td><td>T9159</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Ajax Finechem</td><td>A6-2.5 L GL</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇</td><td>Sigma</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Ajax Finechem</td><td>783-500G</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep密度梯度介质</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axio Imager A1</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>Optima Max-XP</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Heracell</td><td>150</td><td></td></tr><tr><td>大型轨道摇床</td><td>Ratek</td><td>OM7</td><td></td></tr><tr><td>微波炉</td><td>LG</td><td>MS3840SR /00</td><td></td></tr><tr><td>实验室pH计</td><td>MeterLab</td><td>PHM220</td><td></td></tr><tr><td>防液体滑落载片标记笔</td><td>Daido Sangyo</td><td>Mini</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Thermo</td><td>586</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>CELLSTAR</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>12孔板</td><td>CELLSTAR</td><td>665180</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Mikro-Glass</td><td>SF41296PLMK</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;micro;m滤膜</td><td>Millox-HV</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes无尘纸</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管（2.2 ml，11 &amp;times; 35 mm）</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>347356</td><td></td></tr><tr><td>超速离心管（3.2 ml，13 &amp;times; 56 mm）</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网 70 &amp;micro;m 尼龙</td><td>FALCON</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>带卡环的35 &amp;times; 10 mm培养皿</td><td>SARSTED</td><td>82.1135.500</td><td></td></tr><tr><td>染色缸</td><td>TRAJAN</td><td>#23 319 00</td><td></td></tr></tbody></table>

附睾蛋白质合成与分泌分析

Analysis of Epididymal Protein Synthesis and Secretion

哺乳动物附睾产生的管腔内液体是所有内分泌腺中最复杂的液体之一，旨在支持精子在睾丸后的成熟与储存。这种复杂性源于上皮衬里细胞的联合分泌与吸收活性。本文重点介绍以动力蛋白（DNM）机械酶这一模型蛋白家族为例，分析附睾蛋白合成与分泌的技术。DNM是一类大型GTP酶，具有调控双向膜运输事件的潜力。针对附睾组织中蛋白表达的研究，我们描述了一种可靠的免疫荧光标记方法，用于检测石蜡包埋切片中的靶蛋白，并通过免疫荧光显微镜观察这些蛋白的空间分布。我们还介绍了优化的外泌体样囊泡（即附睾体，epididymosomes）的分离与表征方法。附睾体分泌至附睾管腔中，参与与成熟中精子细胞的细胞间通讯。作为一种补充方法，我们还描述了在SV40永生化的小鼠附睾头部上皮细胞系（mECap18）中进行靶蛋白免疫荧光检测的技术。此外，我们讨论了mECap18细胞系作为研究附睾上皮功能的合适模型的实用性 体外 可用于研究附睾分泌活性调控的模型。为此，本文描述了mECap18细胞系的培养条件，以及可影响其分泌蛋白谱的选择性药理学抑制方案的应用。后者可通过收集条件培养基，采用三氯乙酸/丙酮沉淀法浓缩分泌蛋白，随后经SDS-PAGE和免疫印迹分析进行检测。我们认为，这些联合方法适用于分析其他附睾蛋白靶点，为阐明其在精子成熟和/或储存中的功能作用奠定基础。

图1 和 图2展示了DNM在小鼠附睾头部中免疫荧光定位的代表性结果。所研究的三种DNM亚型各自表现出不同的定位模式。因此，DNM1在初始段和附睾头部的附睾细胞中均呈现相对较弱的弥散性标记（图2A）。相比之下，DNM2亚型首先在初始段细胞的基底侧和顶膜邻近区域被检测到，随后在相邻下游附睾头部区段（即第2–5区）的细胞中重新定位至核上区（i.e., 第2–5区）（图1B, C）。值得注意的是，DNM2标记的强度在附睾头部第2至第5区之间逐渐减弱，这一结果基本反映了这些附睾区段的分泌活性21（图1B, C）。因此，DN...

本文报道了dynamin的免疫荧光定位，以说明在石蜡包埋的小鼠附睾组织切片以及永生化附睾细胞系（mECap18）中检测蛋白质的实验方案。我们还描述了从附睾液和细胞条件培养基中分离分泌蛋白的实验方法。

哺乳动物附睾产生内分泌腺中最复杂的管腔内液体之一，以支持睾丸后精子成熟……

这种联合方法能够解答附睾研究领域中的一些关键问题，例如哪些蛋白质靶点参与了精子成熟和储存的调控。附睾分离技术的主要优势在于，它同样适用于从不同物种的表皮其他区域分离出相似的细胞群体。开始该操作时，将附睾石蜡切片转移至通风橱中。向切片缸中加入足量二甲苯，以完全浸没组织切片。按照文本方案所述，将组织切片浸入由纯化水配制的梯度乙醇溶液中，进行水化。在切片缸中用足量磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤切片，时间五分钟，确保完全浸没整个组织切片。接下来，将适当的抗原修复液倒入载玻片架中。用微波炉加热至溶液沸腾。将载玻片完全浸入溶液中，使组织切片接受加热诱导的抗原修复处理。此后，将载玻片容器从微波炉中取出，静置冷却至室温。将载玻片放入盛有 PBS 的玻璃瓶中冲洗 5 分钟。使用防液体扩散的载玻片标记笔，在组织切片周围画圈标记。将切片转移至湿盒中。在37摄氏度下加入封闭液孵育1小时。随后，用PBS冲洗切片一次。将切片与适当的一抗在4℃下于含1% BSA的PBS缓冲液中孵育过夜，一抗浓度需根据实验条件优化。将载玻片恢复至室温后，在摇床上用PBS缓冲液以60 RPM的速度洗涤10分钟。重复此洗涤步骤两次。将切片与适当稀释于过滤的1% BSA PBS中的二抗在37摄氏度下孵育一小时。此后，始终将载玻片置于避光环境中。在摇床上用PBS洗涤载玻片三次，每次洗涤10分钟，转速为60 RPM。然后，按照文中的实验方案进行染色、封片和样本封固。在处死成年小鼠后，立即用预热至 37 摄氏度的 PBS 灌注其血管系统，以最大程度减少附睾组织中的血液污染。仔细剥离附睾表面的脂肪和结缔组织，并用改良 BWW 培养基冲洗，以降低表面血液污染的可能性。用吸水纸吸去附睾组织上多余的培养基，分离头部附睾。然后将分离的头部附睾转移至含有BWW培养基的新培养皿中，确保培养基的量足以支持后续的精子回收。使用剃须刀片在头部附睾组织上做多个小切口。不要切碎组织。在37摄氏度下轻轻振荡孵育30分钟，以释放管腔内容物。使用70微米滤膜过滤所得悬液，并去除细胞碎片。收集悬浮液，并在4°C下依次进行速度递增的离心步骤，以去除细胞碎片。接着，按照文本方案中的说明制备不连续的碘克沙醇梯度。在超速离心管中制备梯度，每层使用450 µL的各组分。每加入一个组分后，目视检查梯度，以确保各层之间成功形成界面。小心地将 450 微升附睾管腔液体悬液加至单个梯度的上层。在 4 摄氏度条件下，以 160,000 ×g 超速离心 18 小时。从离心后的梯度上层开始，逐步向梯度底部轻轻移取12个等份的组分。如适用，将从每个梯度中收集到的相应组分合并。在收集并合并第9至第11组分后，将其稀释至2毫升PBS中。在 100,000 × g 及 4 °C 条件下超速离心样品 3 小时，使附睾体沉淀。然后小心吸除并弃去上清液，注意不要扰动附睾体沉淀。在进行任何后续实验操作前，必须评估附睾体的纯度。将无菌盖玻片准备好后，在含有盖玻片的12孔板的每个孔中接种200,000个mEcap18细胞。按照文本方案中所述条件培养细胞。待细胞贴附于盖玻片后，弃去培养基，并用PBS洗涤细胞两次。加入足量的4%多聚甲醛以浸没整个盖玻片，在室温下固定细胞15分钟。随后弃去多聚甲醛溶液，用PBS冲洗盖玻片两次。将冲洗后的盖玻片浸入含0.1 Triton X-100的PBS中，作用10分钟，以通透细胞。按照文本方案中的步骤对细胞进行清洗、封闭和免疫标记。首先，按照文本方案将mEcap 18细胞分装至6孔板中。待细胞贴壁后，用无FBS的mEcap 18细胞培养基洗涤细胞三次，以去除残留的FBS及相关的蛋白质污染物。然后，向每个孔中加入1.5毫升不含FBS的mEcap18细胞培养基，在37°C、5% CO₂的培养箱中孵育12小时。之后，收集细胞培养基，在2,000 × g离心10分钟，以去除所有细胞碎片。采用标准的台盼蓝排斥法检测 mEcap 细胞活力。向 80% 体积的条件培养基中加入 20% 体积的预冷 100% 三氯乙酸，以沉淀培养的 mEcap 18 细胞释放的蛋白质。在 4°C 下孵育过夜，并持续混匀。接下来，在 17,000 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，并用预冷的丙酮将蛋白质沉淀洗涤两次。然后，在 17,000 × g 和 4 °C 条件下再次离心 10 分钟。再次小心移除并弃去上清液。然后，将样品置于通风橱中空气干燥，以去除任何残留的丙酮。所研究的每种DNMI同工型均表现出独特的免疫荧光定位特征。DNMI 的特征是在附睾的起始段和头段，附睾细胞呈现相对微弱的弥漫性染色。DNM2 亚型最初在起始段细胞相对的基底侧和顶膜边界附近被检测到，随后在邻近的下游头段细胞中重新定位至核上区。这种染色强度在附睾头段的第2至第5区域之间逐渐减弱，这基本反映了这些附睾区段的分泌活性。随后可见，DNM2 的核上标记与头部主细胞内高尔基体的分布相对应。DNM3 亚型主要在少数头部上皮细胞的顶区被检测到，通过与已知的明细胞标志物 ATP6V1B1 共标记，证实这些细胞对应于明细胞亚群。接下来，采用永生化的 mEcap18 细胞系作为体外模型，用于研究附睾细胞的分泌活性。其分布模式与附睾头组织切片中的观察结果一致，DNM1在mEcap 18细胞的整个细胞质中均有检出，DNM2主要集中于这些细胞的核上区，而DNM3则表现为在少数亚群细胞中呈现离散的膜染色灶状分布。在进行免疫荧光检测时，需注意针对每种抗原优化实验条件。分离得到的附睾区段细胞群体可直接用于后续实验，包括与精子共孵育以及毛细管填充分析，这两种方法均为深入理解附睾小体在调控附睾精子成熟过程中的作用提供了有力手段。

analysis-of-epididymal-protein-synthesis-and-secretion

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

附睾蛋白的合成与分泌分析

本文介绍了一种从真核细胞中提取正在翻译的核糖体的实验方案。提取后，通过蔗糖梯度分级分离将核糖体分为单体核糖体和多聚核糖体，从而实现对不同核糖体群体的分析。因此，该方法是研究翻译调控的金标准。...

真核生物多聚核糖体图谱分析

本文介绍了一种用于分析真核细胞在应激条件下mRNA翻译起始变化的方法。该方法基于正在翻译的核糖体与非翻译核糖体在蔗糖梯度中沉降速度的差异进行分离。...

应激条件下通过多聚核糖体分析检测翻译起始

核糖体在蛋白质合成中起着核心作用。通过蔗糖密度梯度离心法对多核糖体（多聚体）进行分级分离，可直接在全基因组范围内测定各个mRNA的翻译效率。此外，该方法还可用于对与核糖体和多核糖体相关的分子（如分子伴侣和信号分子）进行生物化学分析。...

多聚核糖体分级分离及哺乳动物转译组的全基因组规模分析

任何细胞类型的蛋白质组学分析都高度依赖于起始材料的纯度和预分级分离，以便在进行液相色谱-质谱联用（MS）分析之前降低样品的复杂性。通过使用反向冲洗技术，可以从啮齿类动物中获得高纯度的精子细胞。消化后，可利用TiO2对磷酸化肽段进行富集。...

啮齿动物附睾精子的磷酸化肽分析

本视频实验方案展示了一种利用雌雄同体的淡水螺 Lymnaea stagnalis...

雄性附属腺体产物对腹足类软体动物产卵的影响

蛋白质合成的调控主要发生在翻译起始阶段，该过程的缺陷与多种疾病相关。为了更好地理解这些疾病的病因，本文描述了一种利用非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞评估在翻译起始因子 eIF4G1 突变体存在条件下 mos...

Xenopus laevis 作为鉴定翻译障碍的模型

本方案描述了一种根据结合的核糖体数量从植物组织中提取和分级分离转录本的简便方法。该方法可用于全局评估翻译活性，并确定特定mRNA的翻译状态。...

一种简便的植物多聚核糖体分析方法

脑脊液蛋白水平升高可能是血脑屏障改变后血浆蛋白扩散所致，也可能是鞘内合成的结果。本文介绍了一种优化的检测方案，有助于区分这两种情况，并提供对鞘内合成蛋白的定量测量。...

小鼠鞘内合成蛋白质的定量测量

本文介绍了利用RiboTag系统从成年雄性小鼠特定生殖细胞群体中免疫沉淀核糖体及其结合RNA的方法。通过合理的杂交育种和严谨的免疫沉淀操作，可获得纯净且可重复的结果，从而揭示生殖细胞的翻译组特征，并有助于深入理解突变表型的作用机制。...

雄性小鼠生殖细胞中的RiboTag免疫沉淀

哺乳动物大脑的发育需要在翻译水平上对基因表达进行精确调控。本文介绍了一种多聚核糖体分析系统，该系统配备易于组装的蔗糖梯度制备与分级分离平台，可用于评估发育中大脑内mRNA的翻译状态。...

利用多聚核糖体分析法研究小鼠发育大脑中的翻译过程

本文描述了两种不同的手术注射模型，用于在小鼠附睾的起始段（间质注射）和附睾尾部（管内注射）诱导炎症刺激。这些方法可用于研究附睾不同区域的部位特异性反应。...

由病原体相关分子模式诱导的附睾炎小鼠模型

学习免疫荧光定位与蛋白质分离技术，用于分析小鼠附睾组织中dynamin蛋白的分布特征及分泌蛋白组成。该方法为研究生殖生物学中的精子成熟调控机制提供了重要的实验方案。

附睾蛋白质合成与分泌分析

探索更多视频