利用超滤离心技术分离小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞外囊
November 9th, 2018
在这里, 我们描述了两个细胞外囊泡分离方案, 超滤离心和超离心与密度梯度离心, 从小鼠支气管肺泡灌洗液样品中分离细胞外囊泡。用两种方法对小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞外囊泡进行了定量和表征。
此方法可以帮助解决与使用超滤离心法衍生的支气管离泡液的效率、回收率和纯度有关的问题。我们直接将该技术与超离心和密度梯度纯化技术进行比较。该技术的主要优点是简单、高效，适用于小体积样品，如穆林支气管洗液。
更重要的是，与超离心隔离方法相比，它可提供高纯度和更高的可扩展性。演示这个程序的将是诺曼·加勒特三世先生，我实验室的副研究员。首先，将22测表血管导管插入安乐死小鼠的气管。
将胰岛素注射器与一毫升冰冷无菌 DPBS 连接，将一毫升注入两个肺。慢慢提取注射器柱塞，以检索支气管洗液或BAL液体。将BAL液体放入冰上锥形管中。
之后，从25只小鼠中拉出BAL流体，将其分成两组相等。在4摄氏度下将BAL流体在400倍G下离心5分钟。收集上一代，在4摄氏度下以15000倍G离心10分钟。
然后收集上一液，并立即执行 EV 隔离步骤。首先，通过0.2微米无菌注射器过滤器过滤超级纳兰特。在此之后，用无菌 DPBS 将离心过滤单元平衡 10 分钟。
然后在摄氏4度下将离心装置在15，000倍G下离心10分钟。用 15 毫升 BAL 液体填充过滤器。在3000G下离心30分钟，温度为4摄氏度。
在此之后，通过反复轻轻移液，用14毫升无菌DMB洗涤。在4摄氏度的3000 G下将过滤装置离心30分钟，取出DPBS并浓缩了止动物。要收集浓缩的BAL流体衍生EV，请将移液器插入过滤单元的底部，并使用侧扫侧扫除运动提取样品。
然后，将BAL流体衍生出EV，并将其储存在零下80摄氏度。或者，从将之前获得的上一个上一个液位转移到超离心管开始。在摄氏4度时，在1万G下离心30分钟。
然后收集上一代和离心机。丢弃上一级，在 DPBS 的 200 微升中重新悬浮 EV 颗粒。在此之后，将 EV 悬架与 300 微升 50%碘素醇工作溶液混合。
并转移到15毫升的超离心管。然后根据文本协议添加缓冲液，以创建浮力密度梯度，并在 100，000 G 下将其离心 3 小时 50 分钟。收集 15% 和 25% 的碘糖醇馏分，并在 DPBS 中稀释它们，使体积达到 15 毫升。
将分数转移到一个新的超离心管中，并在摄氏4度的10万G下离心60分钟。丢弃上一杯，在 50 微升无菌 DPBS 中重新悬浮 EV 颗粒。要开始纳米颗粒跟踪分析，请将EV样品稀释在一毫升的DPBS中。
将样品装入胰岛素注射器。在此之后，将注射器连接到注射器泵，并测量颗粒数和大小。将摄像机级别设置为 14，将检测阈值设置为 1。
接下来，使用板读卡器通过色度检测量化EV样品中的蛋白质含量。用印迹加载缓冲液和DTT溶解每个样品中等量的EV蛋白。然后在70摄氏度加热样品10分钟。
将样品装入双流加丙烯酰胺凝胶中，并运行电泳35分钟。然后使用干转法将蛋白质转移到硝基纤维素膜上。在此之后，用5%的脱脂牛奶阻断膜60分钟，轻轻摇动。
在四摄氏度下用EV表面蛋白标记的抗体孵育膜，并温和摇动过夜。在室温下用HRP链接抗体孵育膜60分钟，形成膜。用TBST缓冲液清洗膜10分钟三次。
最后，在进行成像之前，利用化学发光HRP抗体检测试剂开发膜。为了开始流动细胞学，在49微升PEB染色缓冲液中稀释BAL流体衍生EV。然后在每个样品中加入三个抗体，然后在黑暗中摇动60分钟，在4摄氏度下孵育样品。
最后，用40微升膜过滤PEB染色缓冲液稀释样品，进行流式细胞测定分析。在此协议中，EV 使用 UFC 和 UC-DGC 方法与小鼠 BAL 流体隔离。与 UC-DGC-EV 的尺寸和均匀尺寸分布不同，从 UFC 方法分离出的从正常小鼠中提取的 EV 的 BAL 流体显示尺寸更小、尺寸更均匀。
与 UC-DGC 技术相比，UFC 技术的总粒子计数也显著增加。以UFC-EV毫克为单位的蛋白质总回收率也高于UC-DGC-EV，表明UFC技术更加时间和精力高效。最后，通过流式细胞仪对BAL流体衍生EV进行进一步描述。
UFC-EV 和 UC-DGC-EV 均表示 CD63、CD9 和 CD81。在尝试此过程时，重要的是要记住用 DPBS 对超滤单元膜进行补水。一旦膜被水合，装置需要保持湿润，直到使用。
从过滤单元中检索细胞外囊泡节可能具有挑战性。确保移液器尖端被一边扫到一边，以便从过滤器单元中恢复大部分 EV。该技术开发后，为细胞外囊泡分离领域的研究人员探索小动物正常或病理条件下发泡体外囊体的生物功能铺平了道路。
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概述
本文描述了从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离细胞外囊泡的两种方法：超滤离心和带密度梯度离心的超高速离心。从效率、回收率和纯度方面比较了这两种方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 细胞外囊泡研究
背景
- 细胞外囊泡在细胞间通讯中起着至关重要的作用。
- 分离方法影响囊泡的质量和产量。
- 支气管肺泡灌洗液是研究肺相关细胞外囊泡的宝贵来源。
- 对分离技术的比较分析可以提高研究成果。
研究目的
- 评估超滤离心的效率和可扩展性。
- 与传统的超高速离心方法进行比较。
- 评估分离出的细胞外囊泡的纯度。
所用方法
- 用于囊泡分离的超滤离心。
- 带密度梯度的超高速离心用于比较。
- 分离囊泡的定量和表征。
- 使用小鼠支气管肺泡灌洗液样本。
主要结果
- 超滤离心提供了更高纯度的细胞外囊泡。
- 这种方法对小体积样本更易于扩展。
- 效率和回收率得到显著提高。
- 直接比较突出了其相对于传统方法的优势。
结论
- 超滤离心是分离细胞外囊泡的可行替代方法。
- 它为研究人员提供了简单性和效率。
- 进一步的研究可以扩展该方法的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient and scalable isolation of extracellular vesicles (EVs) from small-volume biological samples is a critical bottleneck in early-stage respiratory and biomarker research. The ultrafiltration centrifugation (UFC) technique enables higher yield and purity of EVs from murine bronchoalveolar lavage fluid, supporting robust downstream characterization and translational studies. This capability enhances predictive confidence and accelerates portfolio decisions in respiratory and extracellular vesicle-focused R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-yield isolation of EVs for hypothesis-driven studies on lung signaling pathways.
- Improves biological de-risking by providing purer EV populations for mechanistic interrogation.
- Supports functional target validation through reproducible EV recovery from small-volume samples.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized EV samples for quantitative downstream assays.
- Enhances assay reproducibility by minimizing sample loss and contamination.
- Improves scalability and throughput for screening workflows using limited biological material.
Translational & Preclinical Research
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting EV biomarker studies in disease-relevant murine models.
- Provides reliable EV isolation for translational research on lung pathophysiology.
- Reduces risk in advancing EV-based biomarker candidates through consistent sample quality.
Pipeline & Workflow Integration
The UFC method integrates at the interface of early discovery and preclinical research, enabling robust EV isolation for downstream molecular, proteomic, and functional analyses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway analysis by providing high-purity EVs from small-volume samples.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative EV preparations for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables accurate measurement of EV particle counts, size distribution, and protein content for comparative studies.
- Translational Research: Aligns with biomarker discovery and validation in murine models of lung disease.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, standardized EV isolation workflow adaptable across respiratory and extracellular vesicle research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in EV-based studies.
- Operational Value: Streamlines EV isolation with improved standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of EV-related assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of respiratory and EV biomarker programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EV isolation and downstream analytical techniques such as nanoparticle tracking and flow cytometry.
- Needs access to ultrafiltration units, centrifuges, and protein quantification instrumentation.
- Demands cross-team standardization of sample handling and processing protocols.
- Adaptable to other small-volume biological fluids with protocol optimization.
- Careful membrane handling and sample recovery are critical to maximize EV yield and purity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:15
Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF) Collection and Preparation
2:21
Isolation of Extracellular Vesicles from Murine Bronchoalveolar Lavage Fluid
4:56
Extracellular Vesicle Quantification
5:35
Detection of BALF-derived Extracellular Vesicles
7:16
Results: UFC Method Demonstrates Higher Total Particle Counts and Protein Recover
8:25
Conclusion
