使用超滤离心技术从小鼠支气管肺泡灌洗液中分离细胞外囊泡

该方法有助于解决与采用超滤离心法提取支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡的效率、回收率及纯度相关的问题。我们直接将该技术与超速离心结合密度梯度纯化技术进行了比较。该技术的主要优势在于操作简便、高效，且适用于小体积样本，例如小鼠支气管肺泡灌洗液。

更重要的是，与超速离心分离法相比，该方法可提供更高的纯度和显著更强的可扩展性。演示该实验操作的是我实验室的研究助理 Norman Garrett III 先生。首先，将一根 22 号套管针插入已处死小鼠的气管中。

连接一支含有1毫升冰冷无菌DPBS的胰岛素注射器，将1毫升液体注入两侧肺部。缓慢回抽注射器活塞以回收支气管肺泡灌洗液（BAL液），并将灌洗液滴入置于冰上的锥形管中。

此后，收集 25 只小鼠的支气管肺泡灌洗液，并将其均分为两组。在 4°C 条件下，以 400 × g 离心 5 分钟。收集上清液，并在 4°C 条件下以 15,000 × g 离心 10 分钟。

然后收集上清液，并立即进行细胞外囊泡（EV）分离步骤。首先，使用0.2微米的无菌注射器滤器过滤上清液。随后，用无菌DPBS平衡离心过滤装置10分钟。

然后在4°C条件下，以15,000 × g离心离心单元10分钟。用15毫升支气管肺泡灌洗液填充滤器，并在4°C条件下以3,000 × g离心30分钟。

此后，用14毫升无菌DPBS轻轻反复吹打，洗涤截留物。在4摄氏度下以3,000 × g离心30分钟，去除DPBS并浓缩截留物。为收集浓缩的支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡（EV），将移液器插入滤器单元底部，采用左右扫动的方式吸取样品。

然后将支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡进行分装，并于-80°C保存。或者，也可先将先前获得的上清液转移至超速离心管中，在4°C条件下以10,000 × g离心30分钟。

然后收集上清液并进行离心。弃去上清液，将EV沉淀重悬于200微升DPBS中。之后，将EV悬液与300微升50%碘克沙醇工作液混合。

然后将其转移至一个15毫升的超速离心管中。根据文本所述方案加入缓冲液，以形成浮力密度梯度，并在100,000 ×g 条件下离心3小时50分钟。收集15%和25%的碘克沙醇组分，并用DPBS稀释至总体积达到15毫升。

将组分转移至新的超速离心管中，在4°C条件下以100,000 × g离心60分钟。弃去上清液，并将EV沉淀重新悬浮于50 µL无菌DPBS中。开始纳米颗粒追踪分析前，将EV样本用1 mL DPBS稀释。

将样品加入胰岛素注射器中。然后将注射器连接至注射泵，测定颗粒数量和大小。将相机水平设为14，检测阈值设为1。

接下来，使用酶标仪通过比色检测法定量EV样本中的蛋白质含量。将各样本中等量的EV蛋白质溶解于上样缓冲液和DTT中，然后在70摄氏度下加热10分钟。

将样品加入 Bis-Tris Plus 丙烯酰胺凝胶中，电泳运行 35 分钟。然后采用干转法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。随后，用 5% 脱脂牛奶在轻柔摇动条件下封闭膜 60 分钟。

将膜在4°C下与外泌体表面蛋白标志物的一抗共同孵育，轻轻振荡过夜。室温下用HRP标记的二抗孵育膜60分钟以进行显色。用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟。

最后，在进行成像之前，使用化学发光HRP抗体检测试剂对膜进行显色。开始流式细胞术时，将支气管肺泡灌洗液（BAL）来源的EV加入49 µL PEB染色缓冲液中稀释。然后向每个样本中加入三种抗体，随后在4°C、避光、振荡条件下孵育60分钟。

最后，用40 µL经膜过滤的PEB染色缓冲液稀释样品，并进行流式细胞术分析。在本实验方案中，采用超滤离心法（UFC）和超速离心-密度梯度离心法（UC-DGC）从小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）中分离出细胞外囊泡（EV）。通过UFC方法从正常小鼠BAL液中分离得到的EV比通过UC-DGC方法获得的EV具有更小的粒径和更均一的粒径分布。

与UC-DGC技术相比，UFC技术的总颗粒数也显著更高。UFC-EV的总蛋白回收量（以毫克计）也高于UC-DGC-EV，表明UFC技术在时间和精力上更具效率。最后，还通过流式细胞术对来自BAL液的EV进行了进一步表征。

UFC-EV 和 UC-DGC-EV 均表达 CD63、CD9 和 CD81。在进行此操作时，需注意用 DPBS 重新水化超滤装置的膜。一旦膜完成水化，该装置必须始终保持湿润，直至使用为止。

从滤过装置中回收细胞外囊泡截留物可能具有挑战性。务必左右扫动移液器吸头，以从滤过装置中回收大部分细胞外囊泡。该技术建立后，为小动物正常或病理状态下支气管肺泡灌洗液来源的细胞外囊泡生物学功能研究，提供了细胞外囊泡分离领域研究人员的重要途径。