Name: 用序列图像量化膜间隙距离伸缩 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 了解基于图像膨胀和路径搜索技术的算法，用于精确测量二维边缘之间的膜间隙距离。该方法可应用于心脏电生理学和结构生物学研究，实现高通量、高空间分辨率的自动化测量。

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作者谨此感谢弗吉尼亚-马里兰兽医学院的 Kathy Lowe 对透射电子显微镜样品的处理与染色工作。 
资助项目： 
美国国立卫生研究院 R01-HL102298 
美国国立卫生研究院 F31-HL140873-01

注意：所需软件包括 ImageJ（或类似图像处理软件）和 Matlab R2015。用户在使用其他版本的 Matlab 时可能会遇到兼容性问题。
1. 图像预处理
<ol>
	<li>对于任何灰度图像，确保任意像素的最大强度值 &#60;255。这通常通过在自定义 Matlab 程序 &#34;ImageSub.m&#34; 中将图像减去 1 来实现，该程序包含在补充文件 S1 中。</li>
</ol>
2. 围产期网络的概述
<ol>
	<li>在 ImageJ 或其他图像处理软件中勾勒出周边区（perinexus）的轮廓。</li>
	<li>确保轮廓线宽度为一个像素，并将其强度值设置为图像中的最高值（在 0 到 255 的灰度图像中为 255）。</li>
	<li>通过其五层结构（pentalaminar structure）11,12 识别间隙连接（GJ），并将周边区的起始点定义为两个相对的细胞膜双层开始分离的位置，如 图 1A 所示。从 GJ 边缘约 200 nm 处开始，沿第一个细胞的内膜进行描迹，再沿第二个细胞的内膜返回。在 ImageJ 中，松开画笔以自动闭合轮廓，此人为闭合部分将在后续裁剪中去除。 
	注意：必须尽可能在高倍率下仔细勾勒周边区轮廓，因为即使轮廓的微小偏差也可能导致最终测量结果出现数纳米的误差。</li>
</ol>
3. 设置算法并选择感兴趣的连接子区域
注意：路径搜索算法要求 AutoGraph、Edge、Graph、Node 和 Pathfinding 函数9 与 MembraneSepDist 的 m 文件位于同一目录中。所有文件均可在补充文件 S1 中找到。
<ol>
	<li>选择数据和图像的保存位置。这些位置目前在 m 文件中已硬编码。 
	注意：程序的第一行是一个用于清除所有变量、关闭所有窗口并清空命令窗口的函数。在运行 m 文件之前，请保存任何需要保留的变量或图像。 
	注意：所有硬编码值的软件截图均包含在补充文件 S2 中。</li>
	<li>运行程序 &#34;MembraneSepDist.m&#34;。</li>
	<li>设置参数。 
	注意：将弹出一个图形用户界面（GUI），其中包含梯度阈值、尺度、感兴趣区域和手动起始点的默认参数。这些默认值可在 m 文件中修改，也可针对每张单独的图像进行调整。
	<ol>
		<li>设置空间导数梯度阈值。 
		注意：较高的数值会导致在中心线提取过程中选中更多的点。若数值过高或过低（超出约 3.0–7.9 的范围），可能导致计算效率降低，或中心线点选择不精确，从而影响中心线提取的准确性（见图 2A-C）。</li>
		<li>以像素/标度单位设置尺度。</li>
		<li>设置感兴趣区域的空间下限和上限。 
		注意：根据本实验室的惯例，定义的感兴趣区域位于缝隙连接（GJ）边缘外 30 至 105 nm 范围内2,3,10。</li>
		<li>设置自动/手动起始模式。在大多数情况下，算法能够准确检测缝隙连接终止、周边区（perinexus）开始的位置。然而，对于形状不规则的周边区，用户需手动指定起始点。将该值设为 0 表示自动，设为 1 表示手动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>选择目标图像。 
	注意：可在 m 文件中更改文件选择目录。</li>
	<li>裁剪图像以选定感兴趣的周边区。
	<ol>
		<li>图像显示后，光标将自动变为十字准线。通过在感兴趣的周边区周围拖拽框选进行裁剪（见图 3）。可通过角点和边上的方块调整裁剪框的大小。</li>
		<li>裁剪时，确保周边区的&#34;开放&#34;端（距 GJ 最远的一端，见图 3）被裁剪，使两条膜轮廓延伸至裁剪图像的边缘。 
		注意：建议将图像设为全屏，以便更清晰地观察感兴趣的周边区并进行适当裁剪。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在待测相对边缘之间双击光标，确认最终裁剪区域。 
	注意：双击操作必须在周边区内部完成。若程序未能识别出中心线，请重启程序并确保点击位置位于周边区内部。</li>
	<li>在所有膨胀和腐蚀操作完成后，观察最终生成的中心线，以供用户对程序效果进行最终评估。 
	注意：程序运行期间，屏幕上将弹出一个对话框，提示用户在程序完成前 MATLAB 无法处理其他命令。处理所需时间取决于数组（图像）大小和计算机处理能力。</li>
	<li>若启用了手动起始点，将看到中心线图像叠加在原始解剖图像上，并出现十字准线光标（见图 2E）。在靠近目标起始点但位于周边区外部的位置选择一个点。 
	注意：程序将查找距离所选像素最近的中心线点，并将其作为起始点。</li>
	<li>记录数据。 
	注意：程序完成后，将返回一条映射的中心线，以及周边区宽度随距 GJ 边缘距离变化的曲线图。此外，程序将在 MATLAB 命令行输出距 GJ 边缘 150 nm 范围内的平均周边区宽度，以及定义的感兴趣区域内的平均宽度。Wp 值及距 GJ 的距离存储在变量 &#34;WpList&#34; 中，用户也可手动单独记录这些数据。</li>
</ol>
4. 算法故障排除
<ol>
	<li>如果中心线未能正确识别（图2A），请打开图像 &#34;Gmag&#34;，并使用索引确定合适的梯度阈值（图2C）。</li>
	<li>如果起始点未能正确识别，请手动设置起始点（参见方案3.8）。</li>
</ol>

<ol><li>Rhett, J. M., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perinexus%3A+a+new+feature+of+Cx43+gap+junction+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">The perinexus: a new feature of Cx43 gap junction organization.</a> Heart Rhythm. 9 (4), 619-623 (2012).</li>
<li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+may+constitute+a+cardiac+ephapse%3A+an+experimental+and+modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sodium channels in the Cx43 gap junction perinexus may constitute a cardiac ephapse: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).</li>
<li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+sodium+dependence+of+the+conduction+velocity-calcium+relationship%3A+evidence+of+ephaptic+self-attenuation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular sodium dependence of the conduction velocity-calcium relationship: evidence of ephaptic self-attenuation.</a> American Journal of Physiology - Heart and Circulatory Physiology. 310 (9), 1129-1139 (2016).</li>
<li>Veeraraghavan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+channels+in+the+Cx43+gap+junction+perinexus+modulate+ephaptic+coupling%3A+an+experimental+and+modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Potassium channels in the Cx43 gap junction perinexus modulate ephaptic coupling: an experimental and modeling study.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2016).</li>
<li>Rhett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cx43+associates+with+Na%28v%291.5+in+the+cardiomyocyte+perinexus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Cx43 associates with Na(v)1.5 in the cardiomyocyte perinexus.</a> Journal of Membrane Biology. 245 (7), 411-422 (2012).</li>
<li>Raisch, T. B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29780324">Intercalated Disc Extracellular Nanodomain Expansion in Patients with Atrial Fibrillation.</a> Frontiers in Physiology. , (2018).</li>
<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+methods+of+automated+quantification+of+gap+junction+distribution+and+interstitial+collagen+quantity+from+animal+and+human+atrial+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Novel methods of automated quantification of gap junction distribution and interstitial collagen quantity from animal and human atrial tissue sections.</a> PLoS One. 9 (8), 104357(2014).</li>
<li>Papari, G., Petkov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+pseudo+dilation+for+gestalt+edge+grouping+and+contour+detection%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">Adaptive pseudo dilation for gestalt edge grouping and contour detection.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 17 (10), 1950-1962 (2008).</li>
<li>Limprasert, W. PathFinding. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34966-pathfinding">www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/34966-pathfinding</a> (2012).</li>
<li>George, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+sodium+and+potassium+levels+modulate+cardiac+conduction+in+mice+heterozygous+null+for+the+Connexin43+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Extracellular sodium and potassium levels modulate cardiac conduction in mice heterozygous null for the Connexin43 gene.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. , (2015).</li>
<li>Revel, J. P., Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexagonal+array+of+subunits+in+intercellular+junctions+of+the+mouse+heart+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Hexagonal array of subunits in intercellular junctions of the mouse heart and liver.</a> Journal of Cell Biology. 33 (3), 7-12 (1967).</li>
<li>Huttner, I., Boutet, M., More, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions+in+arterial+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gap junctions in arterial endothelium.</a> Journal of Cell Biology. 57 (1), 247-252 (1973).</li>
<li>Makowski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junction+structures.+II.+Analysis+of+the+x-ray+diffraction+data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Gap junction structures. II. Analysis of the x-ray diffraction data.</a> Journal of Cell Biology. 74 (2), 629-645 (1977).</li>
<li>Entz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Rate+and+Extracellular+Sodium+and+Potassium+Modulation+of+Gap+Junction+Mediated+Conduction+in+Guinea+Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heart Rate and Extracellular Sodium and Potassium Modulation of Gap Junction Mediated Conduction in Guinea Pigs.</a> Frontiers in Physiology. 7, 16(2016).</li>
<li>Sild, M., Chatelain, R. P., Ruthazer, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+the+quantification+of+motility+in+glia+and+other+morphologically+complex+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plasticity%22%5BJournal%5D)">Improved method for the quantification of motility in glia and other morphologically complex cells.</a> Neural Plasticity. 2013, 853727(2013).</li>
<li>Rhett, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+perinexus%3A+Sign-post+on+the+path+to+a+new+model+of+cardiac+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">The perinexus: Sign-post on the path to a new model of cardiac conduction.</a> Trends in Cardiovascular Medicine. , (2013).</li>
<li>Lang, R. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25559473">Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging.</a> Journal of the American Society of Echocardiography. 28 (1), 1-39 (2015).</li>
<li>Kawai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left+ventricular+volume+and+ejection+fraction+by+the+axius+auto+ejection+fraction+method%3A+comparison+with+manual+trace+method+and+visual+assessment+of+ejection+fraction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Left ventricular volume and ejection fraction by the axius auto ejection fraction method: comparison with manual trace method and visual assessment of ejection fraction.</a> Journal of Cardiology. 49 (3), 125-134 (2007).</li>
<li>Frederiksen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+semi-automated+estimation+of+ejection+fraction+at+the+point-of-care%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%2C+Lung+and+Vessels%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of semi-automated estimation of ejection fraction at the point-of-care.</a> Heart, Lung and Vessels. 7 (3), 208-216 (2015).</li>
<li>Foster, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+ultrasound+instrument+for+in+vivo+microimaging+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">A new ultrasound instrument for in vivo microimaging of mice.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 28 (9), 1165-1172 (2002).</li>
<li>Moran, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+imaging+performance+of+high+resolution+ultrasound+scanners+for+preclinical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">A comparison of the imaging performance of high resolution ultrasound scanners for preclinical imaging.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 37 (3), 493-501 (2011).</li>
<li>Papademetris, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+3D+left+ventricular+deformation+from+echocardiography%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Image+Analysis%22%5BJournal%5D)">Estimation of 3D left ventricular deformation from echocardiography.</a> Medical Image Analysis. 5 (1), 17-28 (2001).</li>
<li>Hosny, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+vendor-specific+tags%3A+Three-dimensional+printing+of+echocardiographic+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Unlocking vendor-specific tags: Three-dimensional printing of echocardiographic data sets.</a> Journal of Thoracic Cardiovascular Surgery. 155 (1), 143-145 (2018).</li>
<li>Cretoiu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cardiac+telocytes%3A+3D+imaging+by+FIB-SEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human cardiac telocytes: 3D imaging by FIB-SEM tomography.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (11), 2157-2164 (2014).</li>
<li>Risi, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28607071">Ca(2+)-induced movement of tropomyosin on native cardiac thin filaments revealed by cryoelectron microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (26), 6782-6787 (2017).</li>
<li>Dhindwal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryo-EM-based+model+of+phosphorylation-+and+FKBP12.6-mediated+allosterism+of+the+cardiac+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">A cryo-EM-based model of phosphorylation- and FKBP12.6-mediated allosterism of the cardiac ryanodine receptor.</a> Science Signaling. 10 (480), (2017).</li>
<li>Reddy, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cardiac+magnetic+resonance+imaging+with+three-dimensional+electroanatomic+mapping+to+guide+left+ventricular+catheter+manipulation%3A+feasibility+in+a+porcine+model+of+healed+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Integration of cardiac magnetic resonance imaging with three-dimensional electroanatomic mapping to guide left ventricular catheter manipulation: feasibility in a porcine model of healed myocardial infarction.</a> Journal of the American College of Cardiology. 44 (11), 2202-2213 (2004).</li>
<li>van Heeswijk, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Self-Navigated+T2+Mapping+for+the+Detection+of+Acute+Cellular+Rejection+After+Orthotopic+Heart+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Direct%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Self-Navigated T2 Mapping for the Detection of Acute Cellular Rejection After Orthotopic Heart Transplantation.</a> Transplant Direct. 3 (4), 149(2017).</li>
<li>Valinoti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+patient-specific+models+for+left+atrium+characterization+to+support+ablation+in+atrial+fibrillation+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Magnetic+Resonance+Imaging%22%5BJournal%5D)">3D patient-specific models for left atrium characterization to support ablation in atrial fibrillation patients.</a> Magnetic Resonance Imaging. 45, 51-57 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该算法通过连续的图像膨胀操作，计算二值图像中两个相对的二维边缘之间的像素数量，此处即为周边间隙（perinexus）的膜间距离2,3,14。随后采用空间导数和路径搜索算法来提取中心线，再通过二次膨胀与腐蚀序列操作填充中心线中的间隙，方法类似于先前的研究15。然后将中心线与最终的膨胀计数图像合并，以表示周边间隙宽度随边缘分离起始位置的距离变化情况，此处即为间隙连接（GJ）末端至周边间隙起始处的距离16。
程序开始时，用户需在图形用户界面中定义四个主要参数：
<ol>
	<li>梯度阈值</li>
	<li>比例尺</li>
	<li>感兴趣区域范围</li>
	<li>起始点选择方法（自动或手动）</li>
</ol>
该算法最常见的失效机制是中心线未能到达图像边缘，而路径搜索算法正是通过这种方式确定终点。为解决此问题，用户可提高步骤3.3.1中所述的梯度阈值，这将使程序从空间导数图像中选取更多的点，从而增加路径搜索算法所需的计算时间。因此，该算法需要在计算速度与中心线完整性之间进行权衡。需要注意的是，只要中心线的所有点均能从空间导数图像中被正确识别，并且起点选择恰当，空间导数阈值将不会影响边缘分离度的测量结果。
图像方向似乎会影响膨胀值，因为核的膨胀以90度为步长进行，如果大部分感兴趣区域与膨胀矩阵的轴成45°角，则可能引入误差。因此，膨胀次数并不总是能准确反映边缘之间的间距。这一局限性已通过三角函数校正因子加以解决，但如果数据集中的所有图像均以相同方向对齐，则该校正可能被忽略。此外，在解释结果时应谨慎，因为切片平面可能并非完全垂直于两层膜。在图9B中，我们使用GJW来表明我们的周 nexus 图像处于平面内。尽管如此，必须确保样本量足够大，以消除图像间切片方向差异带来的影响。此外，我们的周 nexus 宽度测量值不应被解释为反映in vivo状态下的实际空间，但该方法可用于测量相对于某种干预或疾病状态下周 nexus 宽度的平均差异。
当前算法还需要以手动勾画的边缘轮廓作为输入。需要注意的是，只要比例尺设置正确，空间分辨率对算法的测量结果没有影响，这一点在图6中不同分辨率的图像以及补充文件S6中的另一幅低分辨率图像中已得到验证。下一步改进算法的方向是去除轮廓生成过程中的人工干预，并开发一种能够自动选择感兴趣区域的工具。这些功能有望提高测量的精确性并减少用户主观偏差。
该计算效率较高的算法提供了一种更快的量化周 nexus（perinexus）的方法，所需人工时间约为手动分割方法的五分之一，且在可重复性方面未表现出可检测到的下降。此外，手动分割方法每15纳米进行一次测量以量化周 nexus 宽度，而由于周 nexus 的膜间距在15纳米范围内可能发生显著变化，这可能导致采样不足。相比之下，自动化程序的空间分辨率与成像方式相同，在本例中沿周 nexus 长度方向达到每纳米2.9像素，因此能够提供更精细分辨率的周 nexus 宽度平均值。
尽管该算法在心脏结构生物学领域的应用前景广阔且令人振奋，但其用途并不仅限于透射电子显微镜（TEM）图像。任何需要对两条近似平行的二维边缘进行精确、高分辨率测量的领域均可应用此算法。该算法可用于追踪从卫星图像中的河岸侵蚀与洪水模式，到明场或荧光显微镜下的血管发育等多种现象。其中最具前景的潜在应用之一，是在心脏病学领域中利用床旁心脏超声心动图测量左心室射血分数（EF）。目前，标准技术为双平面圆盘法17，尽管一种更新的算法AutoEF现已成为EF定量分析的前沿方法18,19。在双平面圆盘法中，需手动勾画目标心腔轮廓，并采用改良的辛普森法进行量化，系统通过叠加椭圆形圆盘的总和自动计算总体积。该方法的主要局限在于仅能提供目标心腔的总横截面积，无法分辨特定感兴趣区域，且需要大量人工干预和专业经验。较新的AutoEF方法则利用二维散斑算法识别并勾勒心室边缘，进而计算心室横截面积。尽管该过程在测量整体心室面积方面精确高效，但也存在类似的根本性局限，即仅能测量总的横截面积。这一主要缺陷限制了临床医生的诊断与治疗能力。相比之下，本文所介绍的算法能够识别中线，并以成像模态的分辨率精确定位特定感兴趣区域。这一点至关重要，因为市面上已有空间分辨率达微米级的超声扫描仪20,21，这意味着该算法有望以微米而非厘米的分辨率检测局部室壁运动异常。尽管该应用尚需实验验证，但它可能是该算法最直接且最具前景的应用之一。事实上，该算法可轻松结合AutoEF的散斑追踪功能或手动平面测量中使用的手动描记方法，从而在提供传统EF数据的同时，同步获得更高分辨率的信息。
尽管当前算法具有高度的通用性和适用性，但它最初是为二维图像开发的。然而，随着成像技术的不断进步，对三维和四维定量技术的需求日益增长。因此，该算法的下一阶段迭代将把相同的策略——即对二值图像进行连续膨胀——扩展到三维物体，其中自动定义中心线目前仍超出现有成像程序的能力范围。此类算法仅在心脏领域就将具有广泛的临床和实验应用，包括三维心脏超声心动图22,23、三维电子显微镜24,25,26以及三维磁共振成像27,28,29。

以下算法用于测量在称为周边隙（perinexus）的纳米结构域中，两个结构耦联的心肌细胞在缝隙连接斑块边缘分离处的膜间距离。1，这与缝隙连接耦合有关2,3,4,5在之前的一项研究中，通过手动分割方法分析数百张周围突触网的透射电子显微镜（TEM）图像的过程中6，有必要开发一种高通量方法，能够在保持先前手动分割过程准确性的同时，以更高的空间分辨率对周边间隙宽度进行采样。在手动分割过程中，沿中心线每隔约15 nm绘制一条近似垂直的线，以测量周边间隙宽度。新算法采用两条平行线的单像素宽二值化轮廓，通过连续的图像膨胀操作来计算两条膜之间的像素数量。尽管图像膨胀已广泛应用于多种图像处理场景，包括轮廓或边缘检测，7,8该算法使用膨胀作为计数机制，然后利用路径查找算法分离出中心线。9 并且在连接周围区域长度方向上以与图像分辨率相等的精度测量周连接宽度。本例中分辨率的差异表现为：手动分割为每15 nm进行一次测量，而新算法为每0.34 nm进行一次测量，空间采样频率提高了44倍。此外，该更高的采样频率的实现耗时约为手动方法的五分之一th 手动分割所需的时间。
该算法将以当前形式用于测量间隙连接斑块边缘传统范围内0-150 nm的周间隙宽度5（GJ），以及在特定兴趣区域内周间隙稳定于30至105 nm之间的区域2,3,10。相较于手动分割，更高的采样频率降低了单个周间隙测量值的变异性，并显著缩短了分析时间，从而实现对大规模数据集的高效处理。然而，该程序不仅限于心脏闰盘的纳米级透射电镜图像。相同的方法也可用于量化血管直径、心室射血分数，甚至非生物现象，如河流侵蚀或洪水范围。该算法适用于量化任意两条准平行边缘之间的距离。

<table><tbody><tr><td>触摸屏显示器</td><td>Dell</td><td>S2240T</td><td>需要软头触控笔</td></tr><tr><td>台式机</td><td>Dell</td><td>Precision T1650</td><td>8GB 内存</td></tr><tr><td>操作系统</td><td>Microsoft</td><td>Windows 7 Enterprise</td><td>64 位操作系统</td></tr><tr><td>程序平台</td><td>Mathworks</td><td>Matlab R2015b</td><td>该程序可能与更新或更早版本的 Matlab 不兼容</td></tr></tbody></table>

通过连续图像膨胀量化膜间距离

Quantifying Intermembrane Distances with Serial Image Dilations

一种最近被描述的细胞外纳米结构域，称为周边隙（perinexus），被认为参与了电紧张耦合，这是一种心肌细胞间电传导的替代机制。目前通过手动分割量化这一空间的方法速度较慢，且空间分辨率较低。我们开发了一种算法，该算法通过对二值化轮廓进行连续图像膨胀，来计算两个相对的二维边缘之间的像素数量。与手动方法相比，该算法所需人工工时更少，空间分辨率更高，同时保留了手动方法的可重复性。事实上，经验丰富的研究人员和新手研究者均能利用该新算法重现先前研究的结果。该算法的局限性在于需要人工手动勾画周边隙轮廓，以及计算能力主要受限于已有的路径搜索算法。然而，该算法具备高通量能力、高空间分辨率和良好的可重复性，使其成为一种多功能且稳健的测量工具，适用于各种需要测量任意二维（2D）边缘间距的应用场景。

该算法旨在通过连续图像膨胀和路径查找，持续测量两个二维边缘之间的距离。该算法可应用于多种领域，如心脏结构生物学、血管生物学和土木工程。

一种新近描述的细胞外纳米结构域，称为周边隙（perinexus），已被证实参与电紧张耦合（ephaptic coupling），后者是一种替代性的...

该方法有助于解答心脏电生理学领域中关于细胞外空间结构和细胞间通讯机制的关键问题。该技术的主要优势在于具有高通量能力以及更高的空间采样频率。本质上，我们能够比以往更快地获得测量结果，并且结果的可靠性更高。由于周边隙（perinexus）是一个相对较新定义的结构，且对于不熟悉 MATLAB 的研究人员而言，故障排除可能并不直观，因此在缺乏视觉演示的情况下，学习周边隙的识别和程序排错较为困难。对于灰度图像，需使用数值计算软件确保没有任何像素的强度超过 255。然后，在图像处理软件中打开我们的配对图像，并放大观察周边隙区域。正确识别周边间隙至关重要。第一步是识别具有条纹状外观的间隙连接斑块。然后，我们在同一平面上寻找两个相对的膜，延伸至约200纳米处。根据其戊胺结构识别缝隙连接斑块。周边间隙的起始处，即为两个相对的细胞膜双层开始分离的位置。以纳米为单位显示比例尺。起始点和终点应位于周 nexus 区域起点外 200 纳米处。接下来，选择套索选择工具。单击并拖动，或使用手写笔仔细沿一个细胞的内膜向上追踪至周 nexus 区域的起点，再沿第二个细胞的内膜返回。释放鼠标按钮或抬起触控笔以闭合选定区域。然后，将线条宽度设置为1像素，并将前景色设置为图像类型对应的最高强度值，例如，对于灰度图像，设置为白色。根据选区创建描边轮廓，并将生成的图像保存为与分析软件兼容的文件类型，例如 JPEG 或 TIFF。如有需要，打开膜间距分析软件，并更改待生成数据和图像的保存位置。保存文件后关闭。然后运行程序。为识别中心线，适当设置空间导数梯度阈值。设置比例尺和单位长度的像素数。根据缝隙连接的边缘，设置感兴趣区域的空间下限和上限。选择自动或手动起始点检测。对于形状不规则的周隙区域，可能需要手动起始点检测。然后，打开标出周边区域的图像。单击并拖动以在周边区域周围绘制一个方框，排除闭合端。在已勾勒的周边区域轮廓内双击，以裁剪图像并识别中心线。如果需要手动选择起点，则原始图像上将出现十字准线光标和中心线。在靠近期望起点的近膜间隙区域外选择一个点，以继续该过程。当过程完成后，请确认中心线保持在近膜间隙内，并准确通过起点。查看生成的数据并绘制周缝宽度。如果中心线未能被正确识别和分离，请打开梯度幅值图像数组以确定合适的梯度阈值。我们使用索引工具在中心线周围点击，并结合梯度幅值数组来判断希望中心线检测算法选取的像素位置。随后应将梯度阈值设置为略高于这些像素的强度值。选择索引工具，点击中心线及其周围区域，以显示应被选中像素的索引值。将空间导数梯度阈值设置为略高于该索引值，然后再次运行该过程。如果在自动处理过程中未正确检测到起始点，则需使用手动起始点检测重新运行程序。在此过程中，手动轮廓以每次一个像素的幅度逐步扩张，以计算两条边缘之间的像素数量。每次扩张的结果均被累加至工作图像中，以生成空间导数。原始轮廓和中心线在其幅度上表现为不连续。在分离出中心线后，通过膨胀、腐蚀和路径查找算法对其进行优化。周边间隙宽度以从周边间隙起始点开始的距离函数形式呈现，或以感兴趣区域内的函数形式呈现，并以上述两种函数的平均值形式给出。随着周边间隙方向的改变，周边间隙宽度的测量会出现高估或低估，具体取决于扩张模式。三角函数校正结果与将图像旋转至周边间隙呈水平方向时的测量结果高度相关。该算法已针对不同的空间分辨率、参考单位和图像尺寸进行了验证。无论是经验丰富的还是缺乏经验的用户，其勾画轮廓的速度均快于手动分割图像。此外，自动化处理具有显著更高的空间分辨率。经验丰富的和缺乏经验的观察者均能准确识别出伴有与不伴有既往心房颤动的患者之间在周细胞间隙宽度上的显著差异。这些观察者还准确地识别出同一群体中缝隙连接的绝对宽度无显著差异。周边隙和缝隙连接的宽度与先前的报道一致。在进行此操作时，请务必耐心绘制轮廓，因为即使在膜结构上出现微小偏差，在此尺度下也可能导致显著误差。通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为他们对所测量的结构不熟悉，或者不清楚如何排查问题以开始进行连接点识别或中心线偏差分析。直观地看到该图像处理方法的操作过程至关重要，因为若无此过程，将难以掌握周边连接结构的识别及算法问题的排查。我们需要确保所量化的内容正是我们声称要测量的指标。该技术为心脏健康领域的研究人员提供了新途径，以更高分辨率对心脏功能的多个层面进行量化分析，从纳米级的细胞外间隙到心室效率或功能障碍的临床判定。尽管本方法以电子显微镜图像为例进行演示，但也可应用于其他成像技术，例如心脏超声心动图，以更精确地量化心脏的机械功能。只要设定适当的比例尺且边缘近似平行，该方法即可测量两个指定边缘之间的距离，因此可应用于任何成像领域。

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科研

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生物工程

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