肾皮质细胞外基质衍生水凝胶的制备

此方法可以帮助回答生物材料领域的关键问题，例如细胞基质相互作用如何影响硫酸盐。该技术的主要优点是，它产生第一种材料，准确反映原生肾皮层生化微环境。用垫下线组织培养罩。

将一升烧杯内有搅拌棒、150毫米无菌组织培养皿，以及整个肾脏放入护罩中。用 500 毫升 1%SDS 溶液填充烧杯。将肾脏放在无菌组织培养皿中。

用手术刀在肾胶囊周围轻轻剃须，去除所有脂肪。然后，在肾脏的上端做一个8到10厘米的浅切口，在不损害底层皮层组织的情况下打破开肾胶囊。使用两个下夹去除肾胶囊，将其从皮层组织剥离。

使用手术刀沿着肾脏的侧侧沿冠面切除肾脏。用手术刀雕刻出乳腺区域，将皮层组织从两半分离出来。然后，将皮层组织切成0.5厘米的立方体，并去除任何大而可见的血管。

要将细胞外基质与肾脏分离，请将切碎的皮层组织放入含有 SDS 溶液的烧杯中。用自 <3>克拉德铝箔盖住烧杯，并在组织培养罩外以大约 400 RPM 的转速将烧杯放在搅拌板上。搅拌24小时后，将烧杯放入组织培养罩中。

加入一个40微米无菌细胞过滤器，用尼龙网制成。然后，用200毫升漂白剂填充单独的1000毫升烧杯，并放在组织培养罩中。通过细胞过滤器将 SDS 溶液放入含有漂白剂的烧杯中。

移出任何剩余的SDS溶液，直到只有脱细胞组织和细胞过滤器留在烧杯中。将细胞过滤器留在烧杯中，加入 500 毫升的新鲜 SDS 溶液。用相同的铝箔盖住烧杯，以与以前相同的速度放在搅拌板上。

去细胞化和洗涤后，将脱细胞组织（称为肾脏 ECM）从这一点转移到 30 毫升自立锥形管中。并填充细胞培养等级的水，直到所有的组织被淹没。首先，使用组织均质器在锥形管中均匀化肾脏 ECM 两分钟，直到获得不透明溶液，且未获得可见的 ECM 片段。

然后，将含有肾脏 ECM 的锥形管淹没在液氮中，直到管周围沸腾不再持续。将肾脏 ECM 在零下 4 摄氏度过夜。要冻干冷冻的去细胞组织，稍微松开锥形管盖，以允许气体交换，并放置管到冻干机。

使肾脏 ECM 发干三天，或直到它像一个精细的白色粉末。要对凝胶进行化学消化和溶解，请将仔细称量的猪胃肽和0.01普通盐酸加入含有搅拌棒的闪烁中。在大约 500 RPM 时搅拌，直到所有辣椒溶解。

然后，将冻干肾 ECM 转移到闪烁的卑鄙中，以大约 500 RPM 的搅拌板将溶液留在搅拌板上三天，使库存的肾 ECM 水凝胶。在组织培养罩中，将所需的细胞培养基，一个正常的氢氧化钠和M199补充剂，放入无菌的30毫升自立锥形管中。将中和试剂溶液与微铲混合。

使用无菌的一毫升注射器将适当体积的库存肾 ECM 水凝胶转移到中和试剂溶液中。使用微铲轻轻混合溶液，直到获得均匀的颜色、水凝胶溶液。通过缓慢而轻柔地搅拌，避免引入气泡。

为了将细胞整合到肾脏 ECM 水凝胶中，请将 30 万个细胞重新用于 10 微升介质中，用于每个水凝胶。将10微升细胞悬浮液放入最终肾 ECM 凝胶中。用微铲搅拌溶液，直到细胞均匀分布。

使用一毫升注射器用肾脏 ECM 水凝胶填充所需的细胞培养装置。在将细胞转移到细胞培养装置中的肾脏 ECM 之前，让凝胶在 37 摄氏度下设置一小时。通过质谱法对去细胞化皮层组织进行分析，揭示了与罗勒-IVina相关的蛋白质的存在，其中胶原蛋白-IV和胶原蛋白-I是代表最多的。

胶原蛋白-IV、A1和 A2链，在所有地下室膜中随处可见，都得到保护。胶原蛋白-IV、A3和 A5链也只存在于球状的地下室膜中。还检测到拉米宁和胶原蛋白-I的常见异构形式。

人类肾脏肾膜内皮细胞，或HKMECs，培养在胶原蛋白-I，肾脏ECM和1:1混合物凝胶，显示表型的差异。HKMEC 在胶原蛋白 I 上培养，显示统一的 CD31 表情，以红色显示。虽然香港MEC在两种含有肾脏 ECM 的凝胶上培养，但分布不均时显示的 CD31 表达减少。

矩阵类型似乎不会影响 VWF 表达式，以绿色显示。在尝试此程序时，重要的是要记住完全均匀化的肾皮层组织。此外，当将凝胶与中和试剂混合时，避免引入气泡。

微生理系统允许在受控的实验室环境中研究器官功能。创建此类系统需要实现细胞、矩阵和刺激。这里制造的凯美金水凝胶，将使我们能够研究这种系统，重新概括肾脏微环境。