高纯度凋亡体的检测与分离

该方案的总体目标是检测和分离高纯度的凋亡小体。凋亡小体是一种细胞外囊泡，用于帮助诱导血液病。它们是细胞外物理家族中最大的类型，直径通常为 1 至 5 微米。

现在越来越明显的是，凋亡小体可以帮助细胞过程，例如凋亡细胞清除和细胞内通讯。因此，开发一种准确的方法来检测、定量和分离凋亡小体对于其功能和机制的个性化至关重要。在本系列准备中，我们将向您展示如何从凋亡样品中检测、定量和分离凋亡小体。

A 部分，诱导细胞凋亡。要在细胞系（例如 THB1 单核细胞）中诱导细胞凋亡，首先从收集细胞开始。对细胞进行计数并收集大约 1000 万个细胞或根据需要收集。

我们建议使用 1000 万个用于凋亡小体分析。六孔板每孔 200 万个细胞。使用 UV Stratalinker 1800 取下六孔板和 UV 池的盖子。

以每平方厘米 150 毫朱尔的速度照射细胞。这种照射大约需要 30 到 60 秒。照射完成后，根据细胞系的不同，将细胞孵育 2 到 8 小时。

此时，细胞应表现出凋亡形态，例如凋亡斑点和凋亡小体形成。用 P1000 移液器收集凋亡细胞。收集大约 1/10 的凋亡样品用于整个凋亡样品对照。

还要收集未经处理或有活力的样本。将整个凋亡样品和未处理样品以 3， 000 g 离心 6 分钟。重新悬浮在 PBS 中并放在冰上。

对于凋亡体分离，继续进行步骤 B 或 C.B，使用 FACS 进行凋亡体分离。将剩余的凋亡样品以 3， 000 g 离心 6 分钟。从剩余的凋亡样品中取出上清液。

将剩余的凋亡样品重新悬浮在含有 nexum 550 和 topo 3 染色的染色溶液中，在室温下避光 10 分钟。离心后，重新悬浮在 FACS 缓冲液中，然后通过 70 微米细胞过滤器过滤，以确保细胞得到有效分离。执行 FACS 机器的标准设置。

采集整个凋亡样本并更改电压设置，以确保所有事件都在 FACS 机器人内，并且可以轻松分离群体。按照后面的流式细胞术门控策略部分所述设置门控策略。选择门控凋亡体群和所需数量的凋亡体进行收集。

执行初始排序以确认排序设置和凋亡体纯度。执行分选后，执行系统全黑并重新分析分选后的样品。如果达到高纯度，则继续分选所需数量的凋亡小体。

分选完成后，取一小部分 pro sort 凋亡体样品并重新分析以确认纯度。C 部分，通过差速离心分离凋亡体。将剩余的凋亡样品以 300 g 离心 10 分钟。

该离心步骤将从细胞外小囊泡中分离细胞，包括凋亡细胞、活细胞和坏死细胞，这些囊泡将保留在上清液中。在新的 falcon 管中，收集含有细胞外囊泡的上清液。Re 将富含凋亡的一派悬浮在 PBS 中，并与未经处理的整个凋亡样品一起放在冰上。

收集到的含有凋亡小体的上清液以 3， 000g 离心 20 分钟。去除含有较小细胞外囊泡的上清液，注意不要破坏包含凋亡小体的沉淀。将凋亡小体重新悬浮在 PBS 中，并收集 100 微升每个未处理的整个凋亡样品、富集的凋亡细胞和富集的凋亡小体样品，并用 nexum five 和 topo 3 染色溶液染色。

进行流式细胞术分析之前，在室温下避光放置 10 分钟。按照布局的门控策略中的说明进行分析。D 部分，流式细胞术门控策略。

要开始流式细胞术分析，通过将 topo 3 和 4 进行比较，将 topo 3 高坏死细胞与所有其他事件分开。从非透化事件中，执行下一个门。选择非透化事件，并将侧向散射与 nexum 5 进行比较。

选择两个群体，包括一个侧散中间体在高，一个 nexum 五个低到中间细胞。此总体为 P1。此外，创建第二个群体，包括所有其他事件。这个总体是 P2。P1 将包含活细胞和早期凋亡细胞。

P2 将包含所有凋亡事件和碎片。选择 P2 以进一步设门。从 P2 开始，通过比较 topo 3 和 nexum five 来清除所有碎片。

选择 nexum five 中级和高级事件的全部。该群体现在将包括所有凋亡小体和凋亡细胞。选择此总体。

要将凋亡小体与凋亡细胞分开，请将 full scatter 与 nexum five 进行比较。要选择凋亡小体，请选择 full scatter low。要选择凋亡细胞，请选择 full scatter intermediate to high events。

当通过 FACS 进行凋亡体分离时，我们建议通过选择凋亡体分数并通过 topo 3 与 nexum 5 来查看它，从而执行最后的门控策略。选择所有事件。这用于根据荧光而不是完全散射和侧向散射属性选择门控策略，以提高排序的准确性。

要鉴定活细胞，请返回 P1 群体。对于一般的活细胞分析，选择 P1 并将全散射与 nexum 5 进行比较。选择所有全散射中间到高像元。

这将包括所有活细胞，去除任何剩余的碎片。或者，为了进行更深入的细胞凋亡分析，可以分离活细胞和早期凋亡细胞。为此，比较 topo 三节 full scatter。

活细胞将是 topo three 低，完全分散的中间到高。早期凋亡细胞包含中间 topo 3 染色。然后，可以将整个设门策略应用于所有正在分析的样品。

例如，对于 FACS 后分离的凋亡小体。将设门策略应用于所有样品。然后可以制备凋亡体纯度。

例如，通过仅选择 nexum 5 阳性总体，比较完全分散和 nexum 5。因此，这表明分离后的凋亡小体。代表性结果。

进行流式细胞术分析以确认细胞凋亡的诱导。这种设门策略可以识别紫外线照射样品中的活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。该方法证明了通过两种方法分离凋亡小体。

首先，基于 FACS 的方法，其中凋亡小体富集至 99% 纯度，以及差异离心方法，其中凋亡小体被分离至 97% 纯度。流式细胞术证实了这一点，其中凋亡小体被细胞分离，包括活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。结论。我们的方法可能为细胞凋亡和凋亡体研究提供新工具。

因此，有助于他们在这些机制的个性化方面取得进步，并帮助在针对这些流程方面产生新的发展。