用扫描电镜和全贴免疫荧光技术可视化小鼠胚胎中的节点和外型板
November 6th, 2018
节点和脊索板是小鼠胚胎发育过程中的瞬态信号组织者, 可以使用多种技术进行可视化。在这里, 我们详细地描述了如何执行两种技术来研究它们的结构和形态发生: 1) 扫描电子显微镜 (sem);和 2) 全安装免疫荧光 (wmif)。
节点和诺莫多达尔板块是小鼠胚胎发育过程中的重要组织者。今天，我们将描述发展生物学家用来可视化和研究的两种技术。在第一个协议中，我们将演示如何执行扫描电显微镜、SEM 和第二个全安装免疫荧光。
节点和诺托纳达尔板在胚胎日E7.75时暂时存在于胚胎表面，强调微小的西莉亚向外部投射，从而允许SEM识别和可视化。在这两个协议中，我们将演示处理相对较小的小鼠胚胎的关键步骤，并专注于如何移植和路由它们。首先，通过皮肤和内肠打开安乐死怀孕小鼠的腹部。
使用剪刀和细钳，取出子宫。用蒸馏水短暂冲洗子宫，并放在含有PBS的小培养皿中。然后，使用解剖显微镜和细钳去除子宫肌肉，以释放个别的十六分。
在解剖显微镜下，用一对钳子握住每个切口，然后用另一对在红色部分和白色部分之间进行纵向的全厚度切口。使表面穿孔垂直沿十六分的白色部分，与切口相邻。然后，将十分裂子水平拉成两半，小心地将胚胎从十分白的部分取出。
在此之后，将胚胎转移到含有无菌过滤PBS的新培养皿中。从每个胚胎中去除赖歇特的膜，从异位锥体开始。对于未来的基因分型，去除蛋黄囊的一小块。
在化学罩下，将胚胎转移到含有 EM 级固定性微离心管，该管由 2.5% 谷胱甘肽和无菌过滤 PBS 组成。在此之后，在不干扰胚胎的情况下，从管子上取出固定性。在无菌中清洗胚胎三次，在室温下过滤PBS15分钟。
使用在PBS中稀释的50%70%和85%乙醇，在乙醇系列中对胚胎进行5分钟的脱水。用100%乙醇洗三次。在20摄氏度下将胚胎储存在100%乙醇中，或进入下一步。
在此之后，将浮雕转移到适当的容器中，并清除所有剩余的液体。加入HMDS和乙醇，与胚胎的比例为1比1，30分钟。然后，取出液体，加入纯HMDS30分钟。
用移液器从胚胎中去除液体，让它们干燥30分钟。使用小刷子和双面胶带将干燥的胚胎安装在SEM根根上，腹侧向上。将存根插入溅射涂层机，用于金颗粒涂层。
SEM 颗粒中最微妙的步骤之一是将胚胎以正确的方向安装到存根上。一旦胚胎落在磁带上，方向就不能再改变了。在此之后，将涂层的根管放入SEM显微镜中，应用真空，并观察胚胎节点和带西莉亚的细胞。
在E7.75取出胚胎后，将它们放在PBS Tween的冰上培养皿中。在化学罩下，将胚胎转移到含有固定溶液的微离心管中。在此之后，从管子上取出固定剂，注意不要触摸胚胎。
然后，在含有0.2%Triton X-100的PBS中，在室温下用螺母摇床清洗胚胎3次，5分钟。从胚胎中取出最后一洗液，加入含有PBS Triton的阻断溶液，用10%的热灭活血清。在摄氏四度的高温下，在坚果上将胚胎阻塞至少两个小时。
接下来，去除阻尼，加入大约一毫升在阻断溶液中稀释的原抗体。在摄氏四度的坚果上孵育胚胎过夜。取出原抗体，保存，供以后使用。
然后，用PBS特里顿冲洗胚胎两次。用坚果洗三次30分钟。用稀释的荧光结合二次抗体替代洗涤，对抗主要抗体宿主物种。
在摄氏四度的坚果上孵育过夜。然后，取出二次抗体，用PBS Triton冲洗胚胎两次。之前用PBS Triton洗三次30分钟。
用含有稀释的荧光结合的 phaloidin 和稀释的 DAPI 和污渍在室温下一小时更换最后一次洗涤。然后，在PBS特里顿中冲洗胚胎两次。并在室温下用PBS Triton洗涤30分钟。
在此之后，用PBS替换PBS特里顿，将胚胎留在冰上。然后准备干净、带正的滑轨、盖滑和基于水甘油的安装介质。在幻灯片上放置两块 15 毫米的透明胶带。
然后，在解剖显微镜下，使用经过修改的P200移液器将胚胎移动到幻灯片上。使用精细钳子，在蛋黄囊的侧侧进行两次完全切割，以展开胚胎。然后，将胚胎与腹侧向上放置。
向胚胎添加50微升的安装介质。然后，在盖滑上添加一点安装介质。它跨过两块胶带，用弯曲的针头慢慢放到胚胎上。
使用吸水擦拭来去除多余的安装介质，注意不要移动盖滑。然后，使用大量的指甲油密封盖滑的两侧。最后，使用扫描共体显微镜观察胚胎。
将盖板安装在胚胎上后，不要移动盖滑至关重要，因为这可能会扭曲它们以进行 3D 可视化。利用扫描电子显微镜，观察到野生型节点的形成，并在E7.75剥离一个突变小鼠胚胎。与野生型的坑形节点不同，突变胚胎显示扁平的、常规的节点和节点和节点。
现在整个免疫荧光用于研究细胞水平上第1条突变胚胎的节点和非正统板块形成缺陷。数据表明，它们在突变胚胎中异常发育不良。节点和结皮质板只暂时存在于胚胎表面，因此计时对SEM的成功至关重要。
例如，两到四个索米特胚胎对具有长西莉亚的成熟节点的 SEM 分析是很好的。纯度试剂对于这些技术的成功也是必不可少的，特别是在SEM探测超结构方面。
我们相信，这两种技术提供了关于节点和节点皮质板在正常发育过程中的结构以及突变体中显示这些结构形成缺陷的互补信息。
概述
节点和脊索板是发育中小鼠胚胎中至关重要的信号传导组织。本文详细介绍了两种可视化这些结构的技术：扫描电子显微镜（SEM）和整体免疫荧光（WMIF）。
关键研究组成部分
科学领域
- 发育生物学
- 胚胎学
- 显微镜技术
背景
- 节点和脊索板是胚胎发育过程中的暂时性结构。
- 它们可以通过其独特的形态学和纤毛的存在来识别。
- 理解它们的发育对于洞察脊椎动物胚胎发生至关重要。
- 像SEM和WMIF这样的技术对于研究这些结构至关重要。
研究目的
- 提供详细的节点和脊索板可视化协议。
- 增强对它们在小鼠胚胎中形态发生的理解。
- 展示处理和处理胚胎以进行显微镜观察的关键步骤。
使用的方法
- 扫描电子显微镜（SEM）用于结构可视化。
- 整体免疫荧光（WMIF）用于细胞和分子分析。
- 胚胎准备技术，包括固定和脱水。
- 使用特定抗体进行免疫荧光染色。
主要结果
- SEM显示野生型和突变型胚胎之间存在明显的形态学差异。
- 成功识别了节点和脊索板上的纤毛。
- WMIF允许可视化特定的细胞组分。
- 建立了胚胎处理的关键操作技术。
结论
- 所描述的技术对于研究胚胎结构是有效的。
- 理解节点和脊索板有助于发育生物学。
- 未来的研究可以在这些方法的基础上进一步探索胚胎发育。
常见问题
Executive Industry Relevance
Visualizing transient embryonic organizers like the node and notochordal plate supports early target validation in developmental pathways. These structures serve as disease-relevant systems for assessing morphogenetic signaling and ciliopathy mechanisms. The described SEM and WMIF techniques enable mechanistic de-risking by providing quantitative, reproducible readouts of cellular organization and cilia-dependent signaling in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to left-right axis determination and somitogenesis pathways.
- Operational Value: Provides biological de-risking through direct visualization of organizer formation and cilia localization in wild-type and mutant embryos.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization using cilia-dependent phenotypes as quantitative endpoints.
- Operational Value: Supports assay reproducibility and scalability through standardized embryo handling, fixation, and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant system continuity from gastrulation mutants to phenotypic screening of ciliopathy-related compounds.
- Operational Value: Facilitates risk-adjusted advancement decisions by linking structural defects to functional signaling outcomes in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology by enabling hypothesis testing of nodal signaling pathways and supports screening readiness through quantitative morphology and fluorescence readouts.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking of organizer-dependent morphogenesis in embryonic models.
- Screening: Delivers assay readiness via standardized visualization of cilia length, density, and orientation as screening-relevant parameters.
- Analytics: Enables quantitative comparison of structural phenotypes through SEM morphometrics and WMIF signal intensity measurements.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling human ciliopathies and somitogenesis defects in gastrulation-stage embryos.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating genetic and pharmacological perturbations in developmental signaling pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of transient signaling centers and their cilia-dependent functions.
- Operational Value: Standardization and reproducibility across laboratories via optimized embryo preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in early developmental target engagement.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on organizer integrity and ciliogenesis in preclinical disease models.
Implementation Considerations
- Required expertise in developmental biology and microsurgery for embryo isolation and staging.
- Instrumentation needs include SEM, sputter coater, confocal microscope, and nutating shakers for uniform reagent exchange.
- Cross-team standardization requires consistent embryo staging (E7.5–E7.75), fixation timing, and antibody validation for WMIF.
- Adaptation considerations across model species due to differences in gastrulation timing, organizer morphology, and cilia ultrastructure.
- Practical limitations include embryo fragility, transient nature of the node and notochordal plate, and sensitivity to fixation artifacts impairing cilia visualization.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:59
Scanning Electron Microscopy of the Mouse Embryonic Node
4:17
Whole Mount Immunofluorescence of the Mouse Node and Notochordal Plate
8:06
Results: Strip1 Mutant Embryos Display Irregular Nodes and Abnormal F-Actin Organization in the Axial Mesoderm
8:46
Conclusion
