Name: 一种用于检测汞和镉的厌氧生物传感器检测方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: 了解厌氧全细胞微生物生物传感器检测汞和镉生物有效性的方法。该技术提供实时数据，帮助研究人员在无氧环境中评估重金属对细菌的影响，揭示生物地球化学循环机制。

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我们感谢两位匿名审稿人以及Poulain实验室成员对厌氧生物传感器开发过程中提出的宝贵意见和深入讨论。本研究由安大略省早期研究人员奖、加拿大自然科学与工程研究理事会向A.J.P.提供的发现基金及加速器补充基金资助。

作者无任何利益冲突需要披露。

微生物生物传感器是研究金属与微生物相互作用机制的有用工具。本文介绍一种可在厌氧条件下定量检测汞（HgII）和镉（CdII）对革兰氏阴性宿主细胞（E. coli）生物可利用性的方法，并在数小时内提供可量化的结果。该方案的主要优势之一在于，通过避免使用强结合配体或可能导致金属沉淀的成分，可对暴露介质中的金属形态进行高度可控的调节。本研究中已使用 PHREEQC17 对该暴露介质中的金属形态进行建模和验证，但也可采用其他金属形态分析软件。在未添加配体的情况下，汞的主要形态预计为 97% 的 Hg(OH)2 和 3% 的 Hg(NH3)22+，而镉的形态则包括 59% 的 Cd-β-甘油磷酸盐、25% 的 Cd2+ 和 16% 的 CdSO4。使用者可通过简单的热力学建模软件设计暴露介质，并检测目标金属的生物可利用性。此外，该生物传感器宿主细胞（E. coli NEB5α）在较宽的 pH 范围（5–8.5）和 NaCl 浓度范围（0–0.55 M）17 内均具有良好的存活能力。
Hg甲基化是一种厌氧过程，本研究中所述方案无需氧气，从而能够更准确地描述厌氧代谢对金属生物可利用性的影响。这一点至关重要，因为氧气的存在会改变基因表达谱。48,49&#160;因此具有潜在的转运途径；这使得该方法相较于目前现有的好氧替代方案更具优势。本文提出的生物传感构建体还可与其他可能更适用于汞甲基化的厌氧宿主联用。例如，Geobacter、Desulfovibrio），但可能比后者更难处理 E. coli目前该方法的一个局限性在于，我们的检测限尚未达到现有有氧系统所实现的皮摩尔（pM）水平。4,19,37但需要注意的是，要达到如此低的检测限，必须采取多个步骤44：i）需要添加配体以确保汞保留在溶液中，不吸附到微生物细胞壁上（汞会不可逆地结合到细胞表面的巯基上，从而阻止其生物可利用性）25,27；参见 Hg 的阈值响应 图3A），ii）调整细胞密度，或iii）修改遗传构建体以包含转运蛋白 mer-操纵子（即 merT 和 merP），增加细胞内汞（Hg）通量50,51这些修饰有助于检测低浓度的Hg，但在评估环境相关情况时未必理想。而此前的镉生物传感器主要以 &#34;原理验证&#34;，它们是在复杂的培养基中设计的，这使得研究者无法评估形态转化对生物可利用性的影响41,42,43,44.
生物传感器是研究金属物种生物可利用性机制的一种极为有用的工具。由于宿主生物并非汞甲基化菌，因此该方法仅可用于建立汞进入革兰氏阴性菌的模型，而不能为汞甲基化菌如何获取汞提供确定性的解释。目前已有其他方法可用于测定汞的生物可利用性，例如以甲基化作为吸收结果的指标，或采用质量平衡法10,15,20,45,46。尽管如此，本文所述方法的优势在于可提供活细胞中准实时的生物可利用性数据。我们不建议使用该方法对环境基质中的总汞或总镉含量进行定量。尽管已有研究提出利用生物传感器测定环境中金属浓度36，但目前已有更多成熟且易于获得的标准方法，例如电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）、火焰原子吸收光谱法（FAAS，适用于镉分析）或冷蒸气原子吸收光谱法（适用于汞分析）。然而，该生物传感器可用于判断特定环境基质是否具有增强或抑制生物可利用性的潜力；这一目的可通过标准加入法实现。
暴露介质的pH值可在5至8.5范围内调整，条件是将MOPS游离酸（缓冲剂）替换为具有合适pKa值的其他缓冲剂的游离酸（请参见合适的缓冲剂列表（Ferreira et al. (2015)47）），并在配制暴露介质时用KOH调节至相应的pH值。此外，该方法不仅限于汞（Hg）和镉（Cd），还可通过使用其他转录调节因子扩展至其他金属。
可通过修改暴露实验，以探究其他电子受体（如O2和延胡索酸）对汞或镉生物有效性的影响。如需获取将O2和延胡索酸同时作为电子受体的方法的微小修改方案，可联系索取。
总之，我们希望强调以下几点：I) 在步骤2中，必须明确 Cd 或 Hg 储备液的浓度，因为这些浓度将用于生物传感器的校准。II) 在暴露当天，细胞生长必须在 OD600 达到 0.6（± 0.1）时停止，并且在重悬细胞培养物时需格外小心，因为生物传感器是针对此细胞密度进行校准的。III) 最后，暴露培养基必须在暴露当天精确配制。为确保实验方案的成功，应同时培养多份培养物（以避免培养失败的可能性），并且培养基应每周重新配制一次（以避免培养基的亚稳态及可能的污染）。还应注意，生物重复样本（多个细胞培养物）在信号产生方面会表现出一定变异性。尽管不同培养物之间的荧光响应可能存在差异，但在多个生物重复样本中，针对特定变量的荧光变化趋势应保持一致。

汞（Hg）是一种全球性污染物，其对汞甲基化微生物的生物可利用性是汞通过食物网生物放大并可能对人类和野生动物产生神经毒性效应的第一步1。目前认为，微生物介导的汞甲基化是一个细胞内过程，需要满足两个条件：i）汞的形态具有生物可利用性2,3,4,5,6,7；ii）细胞本身具备甲基化汞的生理能力8,9,10。镉（Cd）可在生物体内发生生物累积，但不会在食物网中发生生物放大，且广泛应用于工业和商业过程中，常导致人和环境的急性暴露11。尽管微生物在汞的环境归趋中发挥多种关键作用，但关于镉的地球化学和生态毒理学研究大多集中于微生物真核生物12。食用农作物（例如水稻）是人体直接接触镉的主要来源；在此情况下，根际微生物对镉的生物可利用性直接影响植物对其的富集程度13。
汞的转运途径十分复杂，可能涉及主动转运步骤14当涉及转运蛋白时，近期研究提示 HgII 使用 ZnII 或 MnII 转运蛋白7,15,16,17. 而CdII 被假定为通过二价金属转运途径（特别是Mn）意外转运至胞质溶胶中II 或 ZnII），镉的作用机制II 细胞内的转运机制仍属推测，尚未发现特异性的镉转运途径13,18无论所涉及转运蛋白的性质如何，三种机制因素最终决定了金属进入细胞的能力：i）溶液中金属的形态2,6,15,16,17,19,20,21,22,23，ii) 细胞膜的生物理化性质17,24,25,26,27,28,29,30,31，以及 iii) 金属进入转运位点的能力7,32镉和汞由于对溶解性有机质（DOM）及螯合污染物具有高亲和力，在微生物生理相关条件下不太可能以游离离子形式存在。例如， EDTA）或还原态硫基团33,34,35 (CdII 可以以游离离子形式存在，或在缺乏这些配体时形成离子对。目前尚缺乏有效的方法来确定在与环境归趋相关的条件下这些金属物种的生物可利用性。例如，汞在厌氧条件下会发生甲基化14，且镉和Hg均为软金属（或B类阳离子），因此必须在保持还原态硫基团完整性的条件下研究其形态。
微生物生物传感器是能够响应细胞内金属（如汞或镉）浓度而产生可量化信号的细菌细胞。因此，它们是研究金属如何进入细胞的理想工具36，前提是暴露条件需严格控制。汞生物传感器通常包含调控元件与报告基因的融合，其中调控元件来自汞抗性基因 mer-操纵子（包括编码转录调节因子MerR的基因以及该操纵子的操纵区和启动子区）和报告基因例如，lux、gfp、lac 基因）。当细胞质中存在汞时，汞会与MerR结合，从而启动报告基因的转录并产生相应的信号19,37特定的Cd生物传感器通常利用以下方法设计 cadC, cadAC, zntA 或 zntR 编码的转录调控因子38，但值得注意的是，MerR 对 Cd 具有较低但可量化的亲和力5由于大多数常用发光或荧光报告蛋白存在需氧限制，直到最近，微生物生物传感器仍无法提供有关缺氧条件下金属生物转化的信息。这使得在一系列与金属环境归趋相关的条件下，特别是在存在氧化还原敏感配体的情况下，对金属生物有效性的厌氧检测变得极为困难。例如， 硫化物和硫醇4,5,39.
为克服在无氧条件下进行活体成像的方法学难题，Drepper 等（2007）开发了一种基于黄素的荧光蛋白（FbFp），该蛋白源自恶臭假单胞菌（P. putida）SB2蛋白的光-氧-电压结构域。该蛋白家族能够在无氧条件下产生荧光40。在Drepper 等研究的基础上，本实验室设计了一种厌氧生物传感器，可用于研究在有氧和无氧条件以及宽盐度范围内汞（Hg）的生物可利用性17。本文中，我们描述了如何制备和使用该生物传感器，以检测环境变量对汞或镉（Cd）生物可利用性的影响。尽管该生物传感器是为检测HgII而开发的，但我们选择以CdII进行实验，旨在提醒读者注意：生物传感器可能对环境中常共存的多种胁迫因子产生响应；本研究中选择CdII是因为已知其可结合转录调控因子MerR5。本文展示了针对两种金属的代表性校准曲线及功能线性范围。同时，我们还举例说明了生物传感器结果具有明确结论的情况（MgII和MnII对Hg生物可利用性的影响）和结论不明确的情况（ZnII对Hg生物可利用性的影响）。

<table><tbody><tr><td>7 ml 标准小瓶，内壁圆润</td><td>Delta Scientific</td><td>200-007-20</td><td>推荐使用 34 个</td></tr><tr><td>小瓶托盘，21 mm 孔径</td><td>Delta Scientific</td><td>730-2001</td><td>4 个（适用于 4 × 8 网格）</td></tr><tr><td>24 mm 封口盖</td><td>Delta Scientific</td><td>600-024-01</td><td>推荐使用 32 个</td></tr><tr><td>LID CORNER NOTCH BLK STR CS/50</td><td>Corning</td><td>Corning 3931</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 孔透明平底无结合表面微孔板</td><td>Corning</td><td>Corning 3651</td><td></td></tr><tr><td>厌氧培养箱（手套箱）</td><td></td><td></td><td>厌氧培养箱内的气体环境应为（97 % N&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;&amp;plusmn; 2 % 和 3 % H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; &amp;plusmn; 2 %）</td></tr><tr><td>钯催化剂</td><td></td><td></td><td>在厌氧培养箱中将 O&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt; 转化为 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O。非必需，但建议使用。</td></tr><tr><td>微孔板读数仪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微孔板读数仪用 450 (&amp;plusmn;10) nM 滤光片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微孔板读数仪用 500 (&amp;plusmn;10) nM 滤光片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>厌氧培养小管（Balch 管）+ 橡胶塞</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td></td><td></td><td>适用于厌氧培养管的改装型号</td></tr><tr><td>MA-3000（汞分析仪）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH 探针</td><td></td><td></td><td>任何 pH 探针均可使用</td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m 聚醚砜注射器滤器 + 注射器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌/洁净玻璃瓶</td><td></td><td></td><td>用于培养基和标准品</td></tr><tr><td>无菌/洁净塑料或聚四氟乙烯（PTFE）瓶</td><td></td><td></td><td>用于碱性溶液（NaOH/KOH）</td></tr><tr><td>试剂粉末：Na2MoO4、Na2SeO4、H3BO3、NaOH、KOH、MnSO4、ZnSO4、CoCl2、NiCl2、氨苄青霉素钠盐、Difco M9 最小盐、葡萄糖、MgSO4、硫胺素盐酸盐、NaNO3、L-亮氨酸、L-异亮氨酸-缬氨酸、EDTA 钠盐、FeSO4、β-甘油磷酸钠、Mops 游离酸、(NH4)2SO4、Hg(NO3)2、CdCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌 Milli-Q 水</td><td></td><td></td><td>经高压灭菌或滤膜除菌均可</td></tr><tr><td>LB 培养基（Lysogeny Broth）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析纯 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于检测汞和镉的厌氧生物传感器检测方法

An Anaerobic Biosensor Assay for the Detection of Mercury and Cadmium

汞（Hg）对微生物的生物可利用性是汞在食物网中发生毒性生物放大作用的关键步骤。镉（Cd）的转化及其对细菌的生物可利用性决定了其在主粮作物中积累的量。这些金属的生物可利用性取决于它们在溶液中的形态，尤其在缺氧条件下更为重要，因为在缺氧环境中汞会被甲基化为有毒的单甲基汞（MeHg），而镉则持续存在于根际。全细胞微生物生物传感器在金属进入细胞质时会产生可量化的信号，因此是评估金属生物可利用性的有效工具。然而，由于现有报告蛋白在无氧条件下功能受限，目前大多数生物传感研究仍局限于有氧环境。本研究中，我们介绍了开发和优化一种可在厌氧条件下运行的全细胞生物传感器检测方法的努力，该方法能够在数小时内近乎实时地检测缺氧条件下的金属。我们阐述了该生物传感器如何帮助评估与金属环境循环相关的化学变量对其生物可利用性的影响。以下实验方案包括：（1）在缺氧条件下制备汞和镉标准溶液的方法；（2）在无氧条件下制备生物传感器的方法；（3）设计并实施实验以确定一系列变量对汞或镉生物可利用性影响的方法；以及（4）生物传感器数据的定量与解读方法。我们展示了生物传感器的线性响应范围，并通过使用金属诱导型和组成型菌株，提供了该方法能够区分金属生物可利用性与毒性的实例。

在根据步骤5.3对荧光峰进行定量后，可根据变量浓度绘制荧光峰结果图，以说明该变量对Hg或Cd相对生物可利用性的影响。例如，荧光强度随[HgII] 来自 图2 将产生如图所示的可诱导数据 图3A. 对于 HgII 校准曲线对于汞诱导菌株将始终包含三个组分；其中阈值响应约为1-2 nM HgII 在荧光信号产生之前，其强度与[HgII]，线性范围 5 nM HgII 将始终可靠地位于该范围的中心，以及一个随着[HgII] 将不再增加荧光信号。组成型菌株中信号生成无变化表明，[HgII] 不影响信号的产生。对于 CdII 在 图3B，诱导型菌株始终包含两个组分：一个线性范围，在此范围内 200-300 nM CdII 将始终可靠地位于线性范围和平台期的中心。随着[Cd]增加，荧光信号降低II] 表明较高浓度的 Cd 对细胞具有毒性，可解释在 Cd 浓度达到 1000 nM 平台期后诱导性荧光产生减少的现象II因此，在检测汞或镉的生物有效性与环境变量的关系时，我们建议使用 5 nM 用于 HgII 和 300 nM 的 CdII.
在某些情况下，信号的产生可准确归因于汞（Hg）或镉（Cd）的生物可利用性；但在其他情况下，信号的产生可能受到生物传感器宿主细胞生理状态变化的影响（例如，所关注的金属或测试的环境条件具有毒性）。在图4A中，测试了5 nM Hg的生物可利用性在锌（Zn）浓度梯度（0–10 µM）下的响应。在Hg诱导型和组成型菌株中，随着Zn浓度的增加，信号均表现出相似程度的下降。因此，无法区分该信号的降低是由于Hg生物可利用性降低所致，还是Zn毒性的结果。在图4B和4C中，测试了5 nM Hg的生物可利用性在镁（MgII）浓度梯度（0–10 mM）和锰（MnII）浓度梯度（0–10 µM）下的响应。随着MgII和MnII浓度的增加，诱导型菌株的荧光信号下降。相反，组成型菌株在MgII和MnII浓度升高时并未表现出荧光信号的降低（MgII和MnII有利于FbFp蛋白的生成，表现为荧光信号增强）。这表明细胞仍具有活性，而Hg诱导型菌株荧光信号的降低是由于Hg生物可利用性下降所致。该数据强调了在所有生物传感器检测中，同时提供反映细胞整体生理状态的组成型对照测量的重要性。
<img alt="Hg(II)、Cd(II)离子的荧光响应图。可诱导型与组成型基因表达数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：生物传感器对汞和镉的线性检测范围。 在厌氧条件下，携带 pUC57merR-Pp（Hg-可诱导型）和 pUC19Balch-Pp（组成型）质粒的 E. coli NEB5α 在添加 A) HgII（0–15 nM）和 B) CdII（0–1,000 nM）后，测得的最大荧光值以相对荧光单位（RFU）表示，误差条为1个标准差。荧光值为37 ˚C下三次技术重复的平均值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="锌、镁、锰浓度的荧光响应图；诱导型与组成型。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58324/58324fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：锌检测结果不明确，而镁和锰检测结果明确的示例。 在厌氧条件下，测量携带 pUC57merR-Pp（汞诱导型）和 pUC19Balch-Pp（组成型）质粒的 E. coli NEB5α 的最大荧光值，以相对荧光单位（RFU）表示，误差线为 ±1 个标准差，分别添加 A) ZnII（0–10 µM）、B) MgII（0–10 mM）和 C) MnII（0–10 µM）。所有处理组的 [HgII] 浓度均设定为 5 nM，荧光值为 37 ˚C 下三次技术重复的平均值。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58324/58324fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种利用厌氧全细胞微生物生物传感器评估不同环境变量如何影响汞和镉在缺氧环境中对细菌生物可利用性的实验方案。

汞（Hg）对微生物的生物可利用性是毒性汞在食物网中生物放大作用的关键步骤。镉（Cd）的转化及其对微生物的生物可利用性……

该方法有助于回答有关镉和汞生物地球化学循环的关键问题，例如不同环境变量如何影响这些金属对细菌的生物可利用性。该技术的主要优势在于，无论是否存在氧气，均可提供准实时的生物可利用性数据以及存活的细胞。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为其中许多步骤对时间敏感，需要极为细致的操作。 演示该实验操作的是我实验室的研究生 Ben。进行检测前，从-80摄氏度的低温保存库中取出汞诱导型生物传感器和组成型表达的生物传感器。将细胞接种于含有120微克/毫升氨苄青霉素的LB（Lysogeny broth）平板上。将平板培养物置于37摄氏度培养箱中过夜培养。在下午4:30至5:00之间，于10毫升含氨苄青霉素的LB培养基中接种培养物，并在37摄氏度、220 rpm振荡条件下过夜培养。次日上午9至10点之间，将培养物以及先前准备好的生长培养基带入厌氧室。然后，在无菌巴尔赫管中加入8毫升新鲜生长培养基和终浓度为210微克/毫升的氨苄青霉素。现在收集两毫升过夜培养的菌液，转移至一个两毫升的微量离心管中。在10,000 RCF条件下离心90秒后，弃去上清液，并用两毫升新鲜培养基重新悬浮菌体。然后将重悬的菌液加入含有八毫升新鲜培养基和氨苄青霉素的Balch管中。采用无菌技术，在将 Balch 试管从厌氧舱中取出前，小心地在试管上塞上橡胶塞。然后将试管放入培养箱中，在 37 摄氏度下以 220 rpm 的速度振荡培养，进行厌氧培养。时间为下午三点至五点之间。将装有培养物的巴尔赫管、一支新的无菌巴尔赫管以及培养基带入厌氧工作站内。用无菌技术，取100微升培养物加入含氨苄青霉素的10毫升新鲜培养基中，置于无菌巴尔赫管内。小心地用无菌操作技术在巴尔赫管上加盖橡胶塞。在37摄氏度、220 rpm振荡条件下过夜培养前，将试管从厌氧室中取出。次日上午9至10点之间，将培养物和培养基重新转移回厌氧室。再次向无菌的Balch管中加入8 mL培养基和氨苄青霉素。将过夜培养的菌液2 mL转移至2 mL微量离心管中。按前述方法离心后，弃去上清液，并将菌体重悬于2 mL新鲜培养基中。然后将重悬的菌液加入含有新鲜培养基和氨苄青霉素的巴尔氏管中。采用无菌操作技术，小心地在巴尔氏管上塞入橡胶塞。将其从厌氧室中取出，并在37°C、220 rpm振荡条件下进行厌氧培养。使用分光光度计监测培养物的生长情况：将培养物涡旋混匀后，在600纳米波长下测定光密度（OD600）。在预期生长3至4小时后，培养物的OD600应达到6。此时将试管移入厌氧工作站，并将培养物转移至两个2毫升微量离心管中。离心后，同前法去除上清液，并将每份细胞悬液用 2 mL 新鲜暴露培养基重新悬浮。重复此洗涤步骤一次，以去除任何残留的生长培养基。随后将两管细胞培养物合并至一个 7 mL 聚四氟乙烯（PTFE）标准小瓶中，得到用于暴露实验的生物传感器储备液。实验开始前，检查厌氧监测仪，确保厌氧舱内无氧气存在。根据96孔板模板设计孔板布局。若每个处理设置三个技术重复，则最多可进行32种不同处理，建议采用4行×8列的网格排列来设置小管。根据检测板布局设置四乘八网格。然后在托盘中放置7毫升聚四氟乙烯标准小瓶。操作小瓶时只能触碰小瓶外壁。根据每种处理方式，向每个小瓶中加入相应体积的暴露培养基。按照培养板的布局，向每个小瓶中加入相应体积的待测化学变量。然后向每个小瓶中加入硝酸盐，使其浓度达到200微摩尔。对于组成型生物传感器处理的空白样品，排除此步骤。向小瓶中添加汞时，首先取四至八微摩尔的储备液并充分振荡。将该溶液与暴露介质在七毫升聚四氟乙烯（PTFE）小瓶中稀释，配制成浓度为100至250纳摩尔的工作用汞溶液。从该工作液中，根据板布局向所需小瓶中加入汞。手动加入汞或镉后，将板以旋转方式振荡。根据汞或镉在溶液中发生形态转化所需时间，此时可暂停实验。当实验继续时，轻轻吹打生物传感器原液，确保其均匀。然后向每支小瓶中加入 100 µL 生物传感器原液，并像之前一样手动振荡培养板。将酶标仪预热至 37 °C，设置持续十小时的动力学检测程序，每 2.5 至 5 分钟读数一次。在两次读数之间进行轨道振荡。设置程序以进行荧光检测，荧光激发波长为 440 纳米，发射波长为 500 纳米。现在将四乘八网格中每个聚四氟乙烯小瓶中的 200 微升溶液转移至 96 孔板中对应的孔内。每次转移200微升前，来回吹打五次。不要丢弃移液枪头，而是将移液枪头留在PTFE小瓶中，以便追踪移液进度。将96孔板放入酶标仪的托盘中。然后将盖子盖在96孔板上，开始检测。以下是代表性结果，显示了校正后的荧光数据随时间的变化情况。图中展示了随着汞浓度增加，对可诱导生物传感器的荧光信号变化。所有数值均以无汞对照为空白。可通过定量荧光峰来显示荧光信号随汞或镉浓度的变化关系。对于可诱导型和组成型生物传感器，应采用可诱导传感器线性范围中段的汞或镉浓度来测试变量。以下是锌产生不确定结果的示例，以及镁和锰对生物传感器汞生物可利用性产生明确结果的示例。锌的结果不确定，因为组成型荧光随诱导型荧光衰减，表明存在毒性。在进行该实验操作时，务必记住输入镉或汞的浓度，因为这些数据将用于生物传感器的校准。完成该步骤后，还可采用其他方法，如水相体系的热力学建模，以进一步探讨特定形态的汞或镉如何影响其生物可利用性。请注意，镉、汞以及硫酸等强酸具有极高危险性，在操作过程中必须始终采取适当防护措施，例如佩戴个人防护装备。该技术问世后，为环境微生物学领域的研究人员探索准实时厌氧条件下汞或镉的生物有效性以及可进行遗传操作的微生物铺平了道路。

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