各向异性聚合物人工抗原呈递细胞的制备及其在CD8+ T细胞活化中的应用

该方法有助于解答氨基酸工程领域中的关键问题，例如，颗粒的物理特性在生物材料与免疫细胞相互作用及激活过程中起什么作用。该技术的主要优势在于能够独立调控仿生颗粒的尺寸和形状。

该技术的意义延伸至癌症治疗领域，因为它是一种即用型粒子疗法，可引发体内细胞介导的免疫反应。尽管该方法可为癌症氨基酸治疗提供见解，也可应用于其他系统，例如传染病或1型糖尿病。

进行微粒合成时，首先称取100毫克聚（乳酸-共-乙醇酸）或PLGA，放入闪烁瓶中，并加入5毫升二氯甲烷，通过涡旋振荡使PLGA溶解。将匀浆器置于盛有50毫升1%聚乙烯醇（PVA）溶液的烧杯中，使匀浆器尽可能接近烧杯底部但不接触。开启匀浆器至适当转速，将PLGA溶液加入烧杯中，匀浆1分钟。

匀浆结束后，将聚乙烯醇PLGA微粒溶液倒入通风橱内磁力搅拌器上的烧杯中，烧杯内含有100毫升5% PVA溶液，持续搅拌至少四小时。待溶剂完全挥发后，将微粒溶液转移至50毫升锥形管中，通过离心收集微粒。弃去每管中的上清液，加入20毫升去离子水，并通过涡旋振荡重新悬浮微粒。

然后用新鲜的去离子水将每根试管中的终体积补足至50毫升，并按照上述方法再洗涤颗粒两次。对于纳米颗粒的合成，将200毫克PLGA溶解于5毫升二氯甲烷中，并将超声探头置于盛有50毫升1% PVA溶液并置于冰上的烧杯中，注意探头不要接触烧杯底部。以12瓦功率开始超声，并立即向烧杯中加入PLGA溶液，持续超声2分钟，以制备直径约为200纳米的纳米颗粒。

超声处理后，将1%聚乙烯醇PLGA纳米颗粒溶液倒入含有100毫升5% PVA溶液的烧杯中，置于搅拌器上，在通风橱内搅拌4小时以蒸发溶剂。当所有溶剂完全蒸发后，将颗粒溶液转移至50毫升锥形管中进行离心，以去除任何微粒，并弃去上清液。然后将纳米颗粒转移至高速离心管中，用去离子水洗涤三次，操作如图所示。

对于聚合物颗粒的制备，在最后一次洗涤后，将颗粒重悬于约1毫升新鲜的去离子水中，并加入成膜溶液，使颗粒的终浓度为2.5毫克/毫升。将颗粒悬液以10毫升等分试样转移至75 × 50毫米的矩形培养皿中，用于一维拉伸；或以15毫升等分试样转移至100 × 100毫米的方形培养皿中，用于二维拉伸。

在化学通风橱中过夜干燥后，使用镊子取下薄膜，并用剪刀修剪边缘。对于一维拉伸，将一片薄膜的两个短边置于两片氯丁橡胶之间，以便安装到自动薄膜拉伸装置一个轴的铝块上。然后使用内六角扳手将金属夹具拧紧在橡胶上方，以固定薄膜。

对于二维拉伸，将薄膜四边均固定在四个铝块上，以实现双轴拉伸。测量并记录一个轴向上铝块之间薄膜的长度（用于单轴拉伸）或两个轴向上的长度（用于二维拉伸），然后根据所需的折叠拉伸倍数，计算出在单个或两个方向上拉伸薄膜所需的距离。接着，将装有薄膜的拉伸装置置于90摄氏度的烘箱中，并靠近一个盛有少量水的大烧杯，使薄膜在10分钟内逐渐升温至设定温度。拉伸完成后，让薄膜在室温下冷却20分钟。

对于一维拉伸，从拉伸装置的边缘处将薄膜裁下。对于二维拉伸，裁下并保留中心区域的方形薄膜，该区域在两个轴向上均被均匀拉伸。将薄膜放入50毫升锥形管中，每管不超过两张薄膜，并向每根管中加入约25毫升去离子水，用于涡旋处理。

当薄膜完全溶解后，按所示方法用去离子水清洗颗粒三次。最后一次清洗后，将颗粒重新悬浮于每管约一毫升新鲜去离子水中。然后将颗粒在零下80摄氏度冷冻一小时，或进行过夜冻干。

次日早晨，将冻干的微粒或纳米颗粒在新配制的MES缓冲液中重新悬浮，浓度为20毫克/毫升，并通过涡旋混合。取100微升颗粒溶液加入含有900微升MES缓冲液的聚丙烯微量离心管中，再加入100微升新配制的EDC-NHS溶液。通过涡旋混合颗粒，并在室温下于翻转仪中孵育30分钟。

孵育结束后，通过离心收集颗粒，并通过涡旋将微粒沉淀重悬于1毫升PBS中，或在2至3瓦功率下超声处理5秒，将纳米颗粒重悬于1毫升PBS中。接下来，向微粒中加入8微克合适的信号一蛋白和10微克抗小鼠CD28抗体，或向纳米颗粒中加入16微克信号一蛋白和20微克抗小鼠CD28抗体。用PBS将每管的终体积调至1.1毫升，并在4°C下于翻转仪上孵育过夜。

第二天，按所示方法用去离子水将颗粒洗涤三次。这些 PLGA 纳米和微米颗粒采用所示的单乳化技术合成，并通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜进行成像。均质化后，微米颗粒的平均直径约为 3 微米。

球形微粒的长径比约为1，而一维拉伸的长椭球形粒子的长径比约为3.5，二维拉伸的扁椭球形粒子的长径比约为1.2，大致保持了接近1的长径比。偶联效率结果显示，球形与椭球形微/纳米人工抗原呈递细胞（AAPC和纳米-AAPC）表面的蛋白量相似，表明在AAPC合成过程中，蛋白偶联是以浓度依赖的方式进行的。在未达到饱和剂量时，长椭球形AAPC比球形AAPC诱导出更高水平的T细胞增殖，其中在0.1毫克剂量下观察到最佳的效应差异。

七天后，通过人工计数T细胞发现，与球形人工抗原呈递细胞（AAPC）相比，椭球形的AAPC在微米和纳米尺度上均能更有效地以剂量依赖的方式刺激T细胞。完成该操作后，可将AAPC用于体内实验，以评估其治疗效果和药代动力学特性。该技术建立后，为免疫工程领域的研究人员探索各向异性对AAPC功效的影响奠定了基础。