Name: CD8+ T 细胞活化的各向异性聚合物人工抗原呈现细胞的制备 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学习制备可生物降解的人工抗原呈递细胞，通过独立调控粒径与形状增强T细胞活化。该技术为癌症免疫治疗及感染性疾病研究提供重要平台。

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EBA（DGE-1746891）和 KRR（DGE-1232825）感谢美国国家科学基金会研究生研究奖学金项目的支持。RAM 感谢美国国立卫生研究院国家癌症研究所国家研究服务奖（F31CA214147）以及大学科学家成就奖励奖学金的支持。作者感谢美国国立卫生研究院（R01EB016721 和 R01CA195503）、防盲研究组织 James 与 Carole Free 催化剂奖以及约翰·霍普金斯大学 Bloomberg-Kimmel 癌症免疫治疗研究所提供的支持。

本文所述所有方法均已获得约翰斯·霍普金斯大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 可调尺寸球形PLGA颗粒的制备
<ol>
	<li>颗粒合成材料的制备
	<ol>
		<li>配制5% w/w的聚乙烯醇（PVA）溶液。
		<ol>
			<li>将500 mL去离子水（DI水）加入带有磁力搅拌子的锥形瓶中，置于磁力搅拌加热板上，以500 rpm转速搅拌，并用温度计监测温度。用锡箔纸覆盖瓶口以防止蒸发。</li>
			<li>当水温升至约70 °C时，分批缓慢加入共25 g的PVA，每加一次需等待PVA完全溶解后再加入下一批。</li>
			<li>待所有PVA完全溶解后（通常需30–60分钟），让溶液冷却并进行无菌过滤。4 °C保存以备后续使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制含10% w/w PVA和2% w/w甘油的成膜溶液。
		<ol>
			<li>将500 mL去离子水加入带有磁力搅拌子的锥形瓶中。在室温下加入8 mL甘油，通过反复吹打混合均匀。</li>
			<li>将锥形瓶置于磁力搅拌加热板上，以500 rpm转速搅拌，并用温度计监测温度。用锡箔纸覆盖瓶口以防止蒸发。</li>
			<li>当溶液温度升至约70 °C时，分批缓慢加入共50 g的PVA，每加一次需等待PVA完全溶解后再加入下一批。</li>
			<li>待所有PVA完全溶解后（通常需60分钟），让溶液冷却，并使用孔径为0.22 μm的瓶顶式真空过滤系统进行无菌过滤。室温保存以备后续使用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制50 mL的1% w/w PVA溶液。取40 mL去离子水和10 mL已配制的5% PVA溶液（步骤1.1.1制得），加入100–150 mL烧杯中。</li>
		<li>配制100 mL的0.5% w/w PVA溶液。取90 mL去离子水和10 mL的5% PVA溶液，加入150–250 mL烧杯中。</li>
		<li>向0.5% PVA溶液中加入磁力搅拌子，置于通风橱内的搅拌板上，室温下以500 rpm转速搅拌。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微粒合成
	<ol>
		<li>称取100 mg聚（乳酸-共-乙醇酸）（PLGA）至闪烁瓶中，加入5 mL二氯甲烷（DCM）溶解。涡旋振荡以促进PLGA溶解。</li>
		<li>将匀浆器插入50 mL的1% PVA溶液中，使匀浆器探头尽可能接近烧杯底部但不接触。开启匀浆器并调节至所需转速——5 μm直径颗粒使用3,200 rpm，3 μm颗粒使用5,000 rpm，1 μm颗粒使用15,000 rpm（匀浆速度越高，所得颗粒越小）。达到设定转速后，立即将PLGA溶液加入烧杯中，匀浆1分钟。</li>
		<li>匀浆完成后，将含1% PVA的PLGA微粒溶液倒入置于搅拌板上的100 mL 0.5% PVA溶液中，在通风橱内持续搅拌至少4小时，以促进溶剂挥发。</li>
		<li>用去离子水洗涤颗粒3次。
		<ol>
			<li>将颗粒溶液转移至50 mL离心管中，以3,000 × g离心5分钟。弃去上清液，加入约20 mL去离子水。</li>
			<li>通过涡旋振荡重悬颗粒。重悬后，用去离子水将离心管补至50 mL。</li>
			<li>重复上述洗涤步骤两次。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纳米颗粒合成
	<ol>
		<li>称取200 mg PLGA至闪烁瓶中，加入5 mL DCM溶解。涡旋振荡以促进PLGA溶解。</li>
		<li>将盛有50 mL 1% PVA溶液的烧杯置于装有冰的容器中。将超声探头插入烧杯中，尽可能接近底部但不接触。启动超声，立即加入PLGA溶液。以12 W功率超声2分钟，以生成直径约为200 nm的纳米颗粒。</li>
		<li>超声完成后，将含1% PVA的PLGA纳米颗粒溶液倒入置于搅拌板上的100 mL 0.5% PVA溶液中，在通风橱内持续搅拌至少4小时，以促进溶剂挥发。</li>
		<li>将颗粒溶液转移至50 mL离心管中，以3,000 × g离心5分钟以去除微米级颗粒。弃去上清液，将剩余物转移至高速离心管中。</li>
		<li>用去离子水洗涤颗粒3次。每次以40,000 × g离心15分钟。弃去上清液，通过涡旋振荡将颗粒重悬于去离子水中。重复上述洗涤步骤两次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 可调控形状的聚合物微粒的制备
<ol>
	<li>将PLGA颗粒洗涤三次后，将其重悬于约1 mL去离子水中。将成膜溶液加入颗粒中，使颗粒的终浓度为2.5 mg/mL。</li>
	<li>将颗粒悬液以每份10 mL加入75 × 50 mm矩形培养皿中，用于一维拉伸；或以每份15 mL加入100 × 100 mm方形培养皿中，用于二维拉伸。用移液器去除气泡或将气泡推至边缘，然后在化学通风橱中过夜自然干燥成膜。</li>
	<li>薄膜干燥后，用镊子从塑料培养皿中取出薄膜，并用剪刀剪下边缘部分。将边缘部分保存至50 mL锥形管中，用于制备球形颗粒。
	<ol>
		<li>将薄膜装载到自动薄膜拉伸装置上，方法是将薄膜固定在铝块上。对于一维拉伸，将薄膜的两个短边置于氯丁橡胶片之间，并将其固定在拉伸仪一个轴向的两个铝块上（图2）；使用内六角扳手将金属夹具拧紧在橡胶上方，以固定薄膜。对于二维拉伸，将薄膜的四个边缘分别固定在四个铝块上，以实现双轴拉伸（图2）。</li>
		<li>测量并记录一维拉伸时铝块间单轴方向的薄膜长度，或二维拉伸时两个轴向的薄膜长度。根据所需的折叠拉伸倍数，计算薄膜在一个或两个方向上需要拉伸的距离。</li>
		<li>将装载薄膜的拉伸装置放入90 °C烘箱中，用10分钟时间使薄膜升至设定温度。在烘箱内放置一个大烧杯，并加入少量水。</li>
		<li>拉伸薄膜。</li>
		<li>拉伸完成后，将拉伸装置从烘箱中取出，让薄膜在室温下冷却20分钟。</li>
		<li>对于一维拉伸，从拉伸装置边缘处剪下薄膜。对于二维拉伸，剪下并在两个轴向上均匀拉伸的中心方形区域薄膜并保存。将薄膜放入锥形管中，每管放置2片，其余部分弃去。</li>
		<li>向每个锥形管中加入约25 mL去离子水，涡旋振荡直至薄膜完全溶解。</li>
		<li>薄膜完全溶解后，用去离子水洗涤颗粒3次。
		<ol>
			<li>对于微米颗粒，将锥形管加水至50 mL，以3000 × g离心5分钟，倾去上清液，加入约20 mL去离子水，涡旋重悬颗粒。</li>
			<li>对于纳米颗粒，将颗粒转移至高速离心管中，以40,000 × g离心15分钟，倾去上清液，加入约20 mL去离子水，涡旋重悬颗粒。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>第三次洗涤后，将颗粒重悬于约1 mL去离子水中。记录微量离心管的重量，并将颗粒加入管中。在-80 °C冰箱中冷冻1小时，或在液氮中快速冷冻。冷冻完成后，将颗粒冷冻干燥过夜。</li>
		<li>冷冻干燥完成后，称量微量离心管中颗粒的总重量，减去先前记录的空管重量，得到冻干颗粒的净重。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 表面蛋白偶联以构建人工抗原呈递细胞
<ol>
	<li>配制2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES）缓冲液。将MES溶于水，配制成0.1 M的溶液，并用1 M氢氧化钠（NaOH）滴定调节pH至6.0。</li>
	<li>用涡旋振荡法将冻干的PLGA/PBAE微/纳米颗粒以20 μg/mL的浓度重悬于MES缓冲液中。取900 μL MES缓冲液加入聚丙烯微量离心管中，再向管中加入100 μL颗粒溶液。</li>
	<li>配制EDC/NHS溶液。将40 mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和48 mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）溶于1 mL MES缓冲液中。</li>
	<li>向颗粒中加入100 μL EDC/NHS溶液，涡旋混匀。</li>
	<li>将离心管置于翻转混合仪上，室温孵育30分钟。</li>
	<li>以5,000 × g离心5分钟沉淀微粒，或以17,000 × g离心5分钟沉淀纳米颗粒。弃去上清液，通过涡旋振荡（微粒）或以2–3 W超声5秒（纳米颗粒）将颗粒重悬于1 mL PBS中。</li>
	<li>对于微粒，向颗粒中加入8 μg目标信号1蛋白和10 μg抗小鼠CD28抗体（克隆号37.51）；对于纳米颗粒，加入16 μg信号1蛋白和20 μg抗小鼠CD28抗体。加入PBS使管内总体积达到1.1 mL。</li>
	<li>将离心管置于翻转混合仪上，4 °C过夜孵育。</li>
	<li>次日洗涤颗粒。以5,000 × g离心5分钟沉淀微粒，或以17,000 × g离心5分钟沉淀纳米颗粒。弃去上清液，通过涡旋振荡（微粒）或以2–3 W超声5秒（纳米颗粒）将颗粒重悬于1 mL无菌PBS中。重复洗涤两次。</li>
	<li>将颗粒重悬于培养基中至所需浓度，用于立即使用。如需长期保存，将颗粒以10 mg/mL浓度重悬于100 mM蔗糖溶液中，冷冻、冻干后于-80 °C保存。</li>
</ol>
4. aAPC 的表征与评估
<ol>
	<li>aAPC 大小和形状的表征图3)
	<ol>
		<li>通过扫描电子显微镜（SEM）成像颗粒来表征微粒的粒径与形态。进行SEM成像时，将冻干颗粒均匀分散于粘附在铝制载物台上的导电碳胶带上，并使用金-钯合金进行溅射镀膜。</li>
		<li>使用图像分析软件分析颗粒的尺寸和长径比。</li>
		<li>使用标尺条设置比例尺，测量颗粒直径以确定粒径。重复测量约100个颗粒，计算平均粒径并生成粒径分布直方图。</li>
		<li>通过测量颗粒长轴和短轴的长度，并将长轴长度除以短轴长度，计算其长径比。对每种形状的约50个颗粒重复该操作，以确定每种形状颗粒的平均长径比，并绘制直方图。</li>
		<li>通过透射电子显微镜（TEM）成像纳米颗粒，表征其粒径与形貌。使用图像分析软件分析纳米颗粒的尺寸和长径比，具体方法见5.1.2。或者，采用动态光散射（DLS）或纳米颗粒追踪分析（NTA）测量球形纳米颗粒的粒径。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白质偶联效率
	<ol>
		<li>根据方法1-3制备人工抗原呈递细胞（aAPC），但在第3.7步中使用荧光标记的信号1蛋白和抗小鼠CD28抗体。完成偶联和洗涤后，将aAPC重悬于1 mL PBS中，终浓度为2 mg/mL aAPC。</li>
		<li>在黑色聚苯乙烯96孔微孔板中配制蛋白质标准品。在板的第一孔中，将5 μg荧光标记的信号1蛋白加入PBS，沿板排进行10个1:2倍比稀释，最后一孔留空。重复此步骤，用荧光标记的抗CD28蛋白制备另一组标准品。</li>
		<li>将100 μL aAPC溶液用移液器加入黑色聚苯乙烯微孔板的各个孔中，每组设三个复孔。</li>
		<li>在适当的波长下使用荧光酶标仪读取荧光值。利用蛋白质标准品的荧光读数为每种荧光抗体生成标准曲线。根据标准曲线计算各样品孔中信号1和抗CD28的浓度，进而计算表面蛋白含量和偶联效率图 4A, 图 5A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>评估aAPC用于 体外 CD8+ T细胞的刺激
	<ol>
		<li>制备B’培养基（RPMI培养基添加L-谷氨酰胺、10%胎牛血清、1%非必需氨基酸溶液、1%丙酮酸钠、1% MEM维生素溶液、92 μM β-巯基乙醇、10 ng/mL环丙沙星和30 U/mL IL-2）。</li>
		<li>通过暴露于二氧化碳处死一只C57BL/6小鼠。</li>
		<li>根据先前建立的方案从小鼠中采集脾脏16. 将脾脏收集至含有10–15 mL PBS的50 mL锥形管中。使用研磨杵将脾脏通过70 µm细胞滤筛研磨入另一50 mL锥形管中。研磨过程中，用40 mL PBS冲洗滤筛。</li>
		<li>以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将脾细胞重悬于 4 mL Ack 溶血缓冲液中以裂解红细胞。静置 1 分钟后，加入 PBS 至管内总体积为 20 mL。</li>
		<li>以 300 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞重悬于 1 mL PBS 中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
		<li>在300 × g条件下离心5分钟，弃上清后将细胞重悬于适量细胞分离缓冲液中。使用CD8+ T细胞阴性选择分离试剂盒，按照制造商提供的操作说明从单细胞悬液中分离CD8+ T细胞。</li>
		<li>磁分离后，以300 × g离心5分钟收集CD8+ T细胞，弃去细胞分离缓冲液。用1 mL PBS重悬细胞并进行细胞计数。根据制造商说明书，用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记细胞。</li>
		<li>在96孔U型底组织培养板的每孔中，加入8,333个CD8+ T细胞和0.0833 mg（或所需剂量）的aAPC，用150 μL B’培养基悬浮，进行孵育。</li>
		<li>37 °C 培养 7 天。培养 3-4 天后，向每孔加入 75 μL 新鲜培养基以更换培养液。</li>
		<li>孵育3天后，使用流式细胞仪分析CFSE标记的细胞以评估增殖情况。流式细胞术CFSE直方图中的每个峰代表一个细胞世代，这是由于每次细胞分裂后CFSE信号随之稀释所致。</li>
		<li>7天后，使用血细胞计数板对每个孔中的细胞数量进行计数。计数前，用台盼蓝溶液对死细胞进行染色，并在最终细胞计数中排除死细胞。将最终细胞浓度标准化至初始浓度，以计算扩增倍数。图4 和 图5).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Jang, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Striped%2C+ellipsoidal+particles+by+controlled+assembly+of+diblock+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Striped, ellipsoidal particles by controlled assembly of diblock copolymers.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (17), 6649-6657 (2013).</li>
<li>Petzetakis, N., Dove, A. P., O'Reilly, R. K. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2011/sc/c0sc00596g">Cylindrical micelles from the living crystallization-driven self-assembly of poly(lactide)-containing block copolymers.</a> Chemical Science. 2 (5), 955-960 (2011).</li>
<li>Rolland, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+fabrication+and+harvesting+of+monodisperse%2C+shape-specific+nanobiomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Direct fabrication and harvesting of monodisperse, shape-specific nanobiomaterials.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (28), 10096-10100 (2005).</li>
<li>Meyer, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+biodegradable+lipid+coated+particles+for+spatially+dynamic+protein+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Anisotropic biodegradable lipid coated particles for spatially dynamic protein presentation.</a> Acta Biomaterialia. 72, 228-238 (2018).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案详细描述了一种用于精确制备各向异性聚合物微粒的通用方法。此处介绍的薄膜拉伸技术具有可扩展性、高度可重复性且成本低廉。其他用于制备各向异性微粒的技术存在诸多局限性，包括成本高、通量低以及微粒尺寸受限。薄膜拉伸法的另一优势在于，微粒在合成后才被改造为各向异性结构，因此可与多种微粒尺寸和合成方法兼容。图1展示了自动化二维拉伸装置的设置。该装置也可在不使用电子元件的情况下，通过手动旋转螺钉，使薄膜达到所需的拉伸程度。然而，我们发现自动化过程比手动操作更加一致且快速15。目前已开发出多种合成各向异性微粒的技术，例如微流控方法17,18,19、逐层涂覆法21以及其他自下而上的合成方法21,22</su...

人工抗原呈递细胞（aAPC）作为免疫调节剂已展现出良好的应用前景，因其能够引发强烈的抗原特异性T细胞反应。这些平台的关键在于其能高效地呈递T细胞活化所必需的关键信号。无细胞aAPC相较于基于细胞的aAPC更具吸引力，因为其制备更简便、成本更低，在放大生产和临床转化过程中面临的挑战更少，并且可降低基于细胞治疗的相关风险。此外，无细胞aAPC还可高度精确地调控与T细胞相互作用的表面信号呈递参数及其物理特性1。
人工抗原提呈细胞（aAPC）必须模拟T细胞活化所必需的至少两种信号。信号1提供抗原识别，当T细胞受体（TCR）识别并结合携带其同源抗原的MHC I类或II类分子时触发，最终通过TCR复合物传导信号。为了绕过对抗原特异性的要求，aAPC系统通常携带针对CD3受体的激动型单克隆抗体，以非特异性地激活TCR复合物。此外，可溶性MHC的重组形式，特别是MHC多聚体，也已被用于aAPC表面以提供抗原特异性。2,3信号2是一种调控T细胞活性的共刺激信号。为了提供T细胞活化所需的共刺激信号，通常通过人工抗原呈递细胞（aAPC）表面呈递的激动型抗体刺激CD28受体，尽管其他共刺激受体（如4-1BB）也已被成功靶向4信号1和信号2蛋白通常被固定在刚性颗粒表面以合成人工抗原呈递细胞（aAPC）。历史上，aAPC由多种材料制备而成，包括聚苯乙烯4,5 右旋糖酐铁6较新的系统采用可生物降解的聚合物，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），以制备可高效偶联信号蛋白的人工抗原呈递细胞（aAPC），适用于直接给药 体内，并可促进包封的细胞因子或可溶性因子的持续释放，以增强T细胞活化7,8.
除了必要的信号蛋白的存在外，在人工抗原呈递细胞（aAPC）与T细胞相互作用过程中，受体在足够大的表面积上发生结合对于T细胞的活化至关重要。因此，aAPC的物理参数（如尺寸和形状）会显著改变其可接触的接触面积，进而影响其刺激T细胞的能力。研究表明，微米级的aAPC比纳米级的aAPC在刺激T细胞方面更为有效。9,10然而，纳米级人工抗原呈递细胞（nano-aAPC）可能具有更优的生物分布特性以及更佳的淋巴结引流能力，从而增强其功能表现 体内 微小人工抗原呈递细胞11形状是基于颗粒的 aAPC 系统中另一个受关注的变量。最近研究表明，各向异性 aAPC 在刺激 T 细胞方面优于各向同性颗粒，主要归因于其与靶细胞的相互作用增强，同时非特异性细胞摄取减少。细胞优先结合到椭球形颗粒的长轴上，而较大的曲率半径和平坦的表面使得 aAPC 与 T 细胞之间的接触面积更大12椭球形颗粒的长轴也不利于吞噬作用，导致其在体内的循环时间较球形颗粒更长。 体内 给药12,13由于这些优势，椭球形颗粒可介导抗原特异性T细胞更显著的扩增 体外 和 在体 与球形颗粒相比，该效应在微米和纳米尺度上均有观察到12,13有多种策略可用于制备各向异性颗粒，但薄膜拉伸是一种简单且被广泛接受的方法，可用于制备多种不同形状的颗粒。14合成后，将颗粒铸造成薄膜，并在高于颗粒材料玻璃化转变温度的条件下进行一维或二维拉伸。随后溶解薄膜以回收颗粒。尽管各向异性颗粒日益受到关注，目前基于颗粒的 aAPC 制备方法仍主要局限于各向同性体系，且改变颗粒形状的方法往往难以实施，与某些 aAPC 合成策略不兼容，并缺乏精确性和可重复性15我们的薄膜拉伸技术可手动或自动操作，能够快速制备由多种可生物降解聚合物合成的各向异性微粒，并在一维或二维方向上拉伸至目标长径比。15.
基于我们之前的研究，我们开发了一种可生物降解的颗粒载体方法，并结合可扩展的薄膜拉伸技术，以标准化方式快速制备具有可调控大小和形状的人工抗原呈递细胞（aAPC），用于T细胞扩增 离体 或 体内我们的蛋白质偶联策略可用于将任意目标蛋白质以特定密度连接至颗粒表面的羧基基团，从而使该人工抗原呈递细胞（aAPC）系统具有高度灵活性。我们还描述了表征aAPC的粒径、形貌及表面蛋白质含量的方法，并介绍了评估其功能活性的实验方案。 体外该方案可轻松调整以扩增免疫细胞 离体 或 体内 用于多种免疫治疗应用。

<table><tbody><tr><td>聚乙烯醇，分子量 25000，88% 水解</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02975-500</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>数字温度计</td><td>吸虫</td><td>N/A</td><td>型号名称：Fluke 52 II</td></tr><tr><td>浸入式温度探头</td><td>扁虫</td><td>N/A</td><td>型号名称：Fluke 80PK 22</td></tr><tr><td>数字加热板 &amp;和搅拌器</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H3760-HS</td><td></td></tr><tr><td>多点搅拌器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50093538</td><td></td></tr><tr><td>Resomer RG 504 H，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>719900</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td>匀浆器</td><td>IKA</td><td>&amp;nbsp;0003725001</td><td></td></tr><tr><td>超声波破碎仪</td><td>声学 &amp;amp; 材料有限公司</td><td>N/A</td><td>型号：VC 505</td></tr><tr><td>超声破碎仪隔音罩</td><td>声学 &amp;amp; 材料有限公司</td><td>N/A</td><td>部件编号：630-0427</td></tr><tr><td>超声波破碎探头</td><td>声学 &amp;amp; 材料有限公司</td><td>N/A</td><td>货号：630-0220</td></tr><tr><td>超声波细胞粉碎仪微探头</td><td>声学 &amp;安普&材料公司</td><td>N/A</td><td>部件编号：630-0423</td></tr><tr><td>高速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>N/A</td><td>型号：J-20XP（已停产），替代型号：J-26XP</td></tr><tr><td>高速离心机转子</td><td>贝克曼库尔特</td><td>369691</td><td>型号：JA-17</td></tr><tr><td>高速聚碳酸酯离心管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3118-0050</td><td>50 mL，螺旋盖</td></tr><tr><td>矩形一次性培养皿</td><td>VWR International</td><td>25384-322</td><td>75 x 50 x 10 毫米</td></tr><tr><td>方形一次性培养皿</td><td>VWR International</td><td>10799-140</td><td>100 mm × 100 mm</td></tr><tr><td>叶片&amp;nbsp;纯化的抗小鼠 CD3 抗体&amp;epsilon; 抗体</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td></td></tr><tr><td>InVivoMab 抗小鼠 CD28 抗体，克隆号 37.51</td><td>Bio X Cell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-二甲氨基丙基)-N&amp;prime;盐酸乙基碳化二亚胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6383</td><td></td></tr><tr><td>N-羟基琥珀酰亚胺钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56485</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗小鼠 CD3 抗体</td><td>Biolegend</td><td>100212</td><td></td></tr><tr><td>APC 抗小鼠 CD28 抗体</td><td>Biolegend</td><td>102109</td><td></td></tr><tr><td>康宁&amp;nbsp;96孔固体聚苯乙烯微孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3915</td><td>平底，黑色聚苯乙烯</td></tr><tr><td>蛋白低吸附管，1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基（含 L-谷氨酰胺）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>热灭活，经无菌过滤</td></tr><tr><td>环丙沙星</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17850</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>重组人IL-2（无载体）</td><td>Biolegend</td><td>589102</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠（100 mM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸溶液（100X）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>MEM维生素溶液（100倍浓缩）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11120052</td><td></td></tr><tr><td>CD8a+&amp;nbsp;小鼠T细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>CellTrace CFSE 细胞增殖试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>LS 柱</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MidiMACS 分离器</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS 多功能支架</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Accuri C6</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 多功能微孔板检测仪</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>autoMACS 运行缓冲液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>细胞筛</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>22363548</td><td>无菌，70 &amp;micro;m 尼龙网</td></tr><tr><td>ACK裂解缓冲液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J（Black 6）小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>000664</td><td>雄性，至少7周大</td></tr><tr><td>U型底组织培养板</td><td>VWR</td><td>353227</td><td>无菌的96孔组织培养处理聚苯乙烯板</td></tr><tr><td>40 V 直流电源</td><td>Probotix</td><td>LPSK-4010</td><td></td></tr><tr><td>PTFE涂层导线</td><td>穆瑟</td><td>602-5858-100-01</td><td>这适用于100英尺的线轴，但使用等效的导线也可行</td></tr><tr><td>步进电机驱动器</td><td>Probotix</td><td>MondoStep5.6</td><td></td></tr><tr><td>IDC 连接器套件</td><td>Probotix</td><td>IDCM-10-12</td><td></td></tr><tr><td>微控制器</td><td>Probotix</td><td>PBX-RF</td><td></td></tr><tr><td>4A 保险丝</td><td>Radio Shack</td><td>2701026</td><td>相同规格的保险丝同样适用</td></tr><tr><td>DB25 公对公电缆</td><td>Probotix</td><td>DB25-6</td><td></td></tr><tr><td>USB-A 转 USB-B 数据线</td><td>订书钉</td><td>2094915</td><td>等效电缆同样适用</td></tr><tr><td>8针Amphenol连接器，公头与母头</td><td>穆瑟</td><td>654-97-3100A-20-7P 和 654-97-3106A20-7S</td><td></td></tr><tr><td>步进电机</td><td>Probotix</td><td>HT23-420-8</td><td></td></tr><tr><td>右旋丝杠</td><td>Roton</td><td>60722</td><td></td></tr><tr><td>左旋丝杠</td><td>Roton</td><td>60723</td><td></td></tr><tr><td>螺钉</td><td>McMaster Carr</td><td>92196A151</td><td></td></tr><tr><td>氯丁橡胶</td><td>McMaster Carr</td><td>8698K51</td><td></td></tr><tr><td>右旋带法兰引导螺母</td><td>Roton</td><td>91962</td><td></td></tr><tr><td>左旋带法兰引导螺母</td><td>Roton</td><td>91963</td><td></td></tr><tr><td>Linux 控制计算机</td><td>Probotix</td><td>LCNC-PC</td><td>任何符合规格并安装 Linux 操作系统的计算机均可使用</td></tr><tr><td>康宁瓶顶式真空过滤系统</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS431097</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

各向异性聚合物人工抗原呈递细胞的制备及其在cd8+ t细胞活化中的应用

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

人工抗原呈递细胞（aAPC）因其强大的T细胞刺激能力，成为一种极具前景的免疫调节平台。与基于细胞的aAPC相比，无细胞基质具有显著优势，包括能够精确控制信号呈递参数以及aAPC表面的物理特性，从而调控其与T细胞的相互作用。由各向异性颗粒（特别是椭球形颗粒）构建的aAPC已被证明比球形颗粒在刺激T细胞方面更为有效，这归因于其更强的结合能力、更大的T细胞接触表面积，以及更低的非特异性摄取和更优的药代动力学特性。尽管对各向异性颗粒的兴趣日益增加，但即使是诸如薄膜拉伸等已被广泛接受的各向异性颗粒制备方法，在实际操作和可重复性方面仍面临挑战。
为此，我们描述了一种快速、标准化制备可生物降解的各向异性颗粒基人工抗原呈递细胞（aAPC）的方案，该aAPC具有可调控的尺寸、形状及信号呈递特性，适用于T细胞扩增。 离体 或 体内，以及表征其大小、形态和表面蛋白含量并评估其功能的方法。该制备各向异性人工抗原呈递细胞（aAPC）的方法具有可扩展性和可重复性，非常适合用于生成aAPC &#34;现成的&#34; 免疫疗法

自动化的二维薄膜拉伸装置示意图见图1。一维薄膜拉伸装置的示意图和描述见Ho等人的研究17。该拉伸装置采用标准铣削和机械加工技术，由铝制部件构成。与一维拉伸装置类似，二维拉伸装置包含金属夹具和导轨。双向丝杠用于将直线运动转换为旋转运动。丝杠通过机械螺纹与具有足够扭矩的相同步进电机相连。8根步进电机控制线可焊接到8针耐高温安费诺连接器上，以便于在烘箱中进行薄膜拉伸时与控制台连接。必须使用足够长度的聚四氟乙烯（PTFE）涂层导线将步进电机连接至控制台中的驱动器。推荐的计算机控制系统如图1A所示。两个电机必须通过耐高温导线连接至两个独立的驱动器。这两个驱动器随后需连接至微控制器，以实现与计算机的通信。驱动器应连接至微控制器的X轴和Y轴输出端口。驱动器和微控制器均需外接电源。在将电源连接至这三个组件之前，建议在每个供电连接之间插入一个4 A的保险丝，以防止电流过载对组件造成损坏。最后，可通过并行端口输入，使用DB25...

在此，我们介绍一种可快速、可重复地制备具有可调控大小、形状及表面蛋白呈递能力的仿生可降解人工抗原呈递细胞（aAPC）的实验方案，用于T细胞扩增。 离体 或 体内.

各向异性聚合物人工抗原呈递细胞的制备及其在CD8+ T细胞活化中的应用

人工抗原呈递细胞（aAPC）由于具有强大的T细胞刺激能力，已成为一种颇具前景的免疫调节平台。无细胞……

该方法有助于解答氨基酸工程领域中的关键问题，例如，颗粒的物理特性在生物材料与免疫细胞相互作用及激活过程中起什么作用。该技术的主要优势在于能够独立调控仿生颗粒的尺寸和形状。该技术的意义延伸至癌症治疗领域，因为它是一种即用型粒子疗法，可引发体内细胞介导的免疫反应。尽管该方法可为癌症氨基酸治疗提供见解，也可应用于其他系统，例如传染病或1型糖尿病。进行微粒合成时，首先称取100毫克聚（乳酸-共-乙醇酸）或PLGA，放入闪烁瓶中，并加入5毫升二氯甲烷，通过涡旋振荡使PLGA溶解。将匀浆器置于盛有50毫升1%聚乙烯醇（PVA）溶液的烧杯中，使匀浆器尽可能接近烧杯底部但不接触。开启匀浆器至适当转速，将PLGA溶液加入烧杯中，匀浆1分钟。匀浆结束后，将聚乙烯醇PLGA微粒溶液倒入通风橱内磁力搅拌器上的烧杯中，烧杯内含有100毫升5% PVA溶液，持续搅拌至少四小时。待溶剂完全挥发后，将微粒溶液转移至50毫升锥形管中，通过离心收集微粒。弃去每管中的上清液，加入20毫升去离子水，并通过涡旋振荡重新悬浮微粒。然后用新鲜的去离子水将每根试管中的终体积补足至50毫升，并按照上述方法再洗涤颗粒两次。对于纳米颗粒的合成，将200毫克PLGA溶解于5毫升二氯甲烷中，并将超声探头置于盛有50毫升1% PVA溶液并置于冰上的烧杯中，注意探头不要接触烧杯底部。以12瓦功率开始超声，并立即向烧杯中加入PLGA溶液，持续超声2分钟，以制备直径约为200纳米的纳米颗粒。超声处理后，将1%聚乙烯醇PLGA纳米颗粒溶液倒入含有100毫升5% PVA溶液的烧杯中，置于搅拌器上，在通风橱内搅拌4小时以蒸发溶剂。当所有溶剂完全蒸发后，将颗粒溶液转移至50毫升锥形管中进行离心，以去除任何微粒，并弃去上清液。然后将纳米颗粒转移至高速离心管中，用去离子水洗涤三次，操作如图所示。对于聚合物颗粒的制备，在最后一次洗涤后，将颗粒重悬于约1毫升新鲜的去离子水中，并加入成膜溶液，使颗粒的终浓度为2.5毫克/毫升。将颗粒悬液以10毫升等分试样转移至75 × 50毫米的矩形培养皿中，用于一维拉伸；或以15毫升等分试样转移至100 × 100毫米的方形培养皿中，用于二维拉伸。在化学通风橱中过夜干燥后，使用镊子取下薄膜，并用剪刀修剪边缘。对于一维拉伸，将一片薄膜的两个短边置于两片氯丁橡胶之间，以便安装到自动薄膜拉伸装置一个轴的铝块上。然后使用内六角扳手将金属夹具拧紧在橡胶上方，以固定薄膜。对于二维拉伸，将薄膜四边均固定在四个铝块上，以实现双轴拉伸。测量并记录一个轴向上铝块之间薄膜的长度（用于单轴拉伸）或两个轴向上的长度（用于二维拉伸），然后根据所需的折叠拉伸倍数，计算出在单个或两个方向上拉伸薄膜所需的距离。接着，将装有薄膜的拉伸装置置于90摄氏度的烘箱中，并靠近一个盛有少量水的大烧杯，使薄膜在10分钟内逐渐升温至设定温度。拉伸完成后，让薄膜在室温下冷却20分钟。对于一维拉伸，从拉伸装置的边缘处将薄膜裁下。对于二维拉伸，裁下并保留中心区域的方形薄膜，该区域在两个轴向上均被均匀拉伸。将薄膜放入50毫升锥形管中，每管不超过两张薄膜，并向每根管中加入约25毫升去离子水，用于涡旋处理。当薄膜完全溶解后，按所示方法用去离子水清洗颗粒三次。最后一次清洗后，将颗粒重新悬浮于每管约一毫升新鲜去离子水中。然后将颗粒在零下80摄氏度冷冻一小时，或进行过夜冻干。 次日早晨，将冻干的微粒或纳米颗粒在新配制的MES缓冲液中重新悬浮，浓度为20毫克/毫升，并通过涡旋混合。取100微升颗粒溶液加入含有900微升MES缓冲液的聚丙烯微量离心管中，再加入100微升新配制的EDC-NHS溶液。通过涡旋混合颗粒，并在室温下于翻转仪中孵育30分钟。孵育结束后，通过离心收集颗粒，并通过涡旋将微粒沉淀重悬于1毫升PBS中，或在2至3瓦功率下超声处理5秒，将纳米颗粒重悬于1毫升PBS中。接下来，向微粒中加入8微克合适的信号一蛋白和10微克抗小鼠CD28抗体，或向纳米颗粒中加入16微克信号一蛋白和20微克抗小鼠CD28抗体。用PBS将每管的终体积调至1.1毫升，并在4°C下于翻转仪上孵育过夜。第二天，按所示方法用去离子水将颗粒洗涤三次。这些 PLGA 纳米和微米颗粒采用所示的单乳化技术合成，并通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜进行成像。均质化后，微米颗粒的平均直径约为 3 微米。球形微粒的长径比约为1，而一维拉伸的长椭球形粒子的长径比约为3.5，二维拉伸的扁椭球形粒子的长径比约为1.2，大致保持了接近1的长径比。偶联效率结果显示，球形与椭球形微/纳米人工抗原呈递细胞（AAPC和纳米-AAPC）表面的蛋白量相似，表明在AAPC合成过程中，蛋白偶联是以浓度依赖的方式进行的。在未达到饱和剂量时，长椭球形AAPC比球形AAPC诱导出更高水平的T细胞增殖，其中在0.1毫克剂量下观察到最佳的效应差异。七天后，通过人工计数T细胞发现，与球形人工抗原呈递细胞（AAPC）相比，椭球形的AAPC在微米和纳米尺度上均能更有效地以剂量依赖的方式刺激T细胞。完成该操作后，可将AAPC用于体内实验，以评估其治疗效果和药代动力学特性。该技术建立后，为免疫工程领域的研究人员探索各向异性对AAPC功效的影响奠定了基础。

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科研

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环境

CD8+ T 细胞活化的各向异性聚合物人工抗原呈现细胞的制备

介绍了一种新的无需树突状细胞的抗原特异性T细胞诱导与扩增方法。基于HLA...

基于HLA-Ig的人工抗原呈递细胞用于高效 离体 人类CTL的扩增

本文介绍了一种利用人工抗原呈递细胞（aAPC）从大量T细胞群体中激活并扩增人源NKT细胞的方法。采用基于CD1d的aAPC可提供一种标准化的方法，用于大量生成具有功能活性的NKT细胞。...

人工抗原呈递细胞（aAPC）介导的自然杀伤T细胞活化与扩增

本视频介绍了一种利用磁性纳米颗粒为基础的磁性人工抗原提呈细胞（aAPCs）分离稀有抗原特异性CD8+ T细胞的实验方案，该aAPCs经抗原肽负载的MHC-Ig复合物及抗CD28抗体功能化修饰。aAPCs可特异性结合表达靶向该抗原肽的T细胞受体的CD8+ T细胞，并实现其后续扩增 体外，导致该 CD8+ T...

基于纳米颗粒的抗原特异性CD8+ T细胞富集与扩增

本视频演示了一种利用紫外照射去笼化光可激活肽-主要组织相容性复合物的方法。去笼化过程暴露了天然肽序列，从而实现T细胞的精确激活。...

利用光激活型肽-MHC评估T细胞的可控激活

本文介绍了杀伤性人工抗原呈递细胞（KaAPC）的制备指南，KaAPC是一种高效的工具，用于 体外...

用于高效杀伤的杀手型人工抗原呈递细胞（KaAPC） 体外 耗竭人抗原特异性T细胞

我们提出了一种在玻璃表面进行功能化的方法，使其形成被流动脂双层包围的纳米级蛋白质斑块。这些基底适用于先进的光学显微镜技术，有望作为细胞黏附与迁移研究的平台。...

支撑脂双层中的配体纳米簇阵列

本方案描述了一种基于成像的T淋巴细胞激活方法，该方法利用光激活型肽-MHC实现对T细胞激活的精确时空控制。...

利用光激活型激动剂实现T细胞活化的时空控制

由于抗原特异性T细胞频率极低，因此难以对其进行表征或用于治疗。本文中，我们提供了一种磁性微粒的制备方案，该微粒可结合抗原特异性T细胞，用于富集这些细胞，并将其扩增数百倍，从而用于后续的表征与治疗应用。...

利用磁性纳米颗粒富集并扩增稀有抗原特异性T细胞

本方案描述了使用单链MHC I类复合物研究人类CD8+ T细胞活化过程中分子相互作用的方法：表达单链构建体的工程化抗原呈递细胞的制备、人类CD8+...

利用单链MHC技术研究人类CD8+ T细胞活化中的共激动作用

本文介绍了一种用于生成抗原特异性CD8...

用于自身免疫性糖尿病模型功能检测的高效生成抗原特异性原代小鼠细胞毒性T细胞

本文介绍了一种利用OP9/DLL1共培养系统生成功能性肿瘤抗原特异性诱导多能干细胞来源的CD8αβ+单阳性T细胞的方法。...

利用人诱导性多能干细胞生成肿瘤抗原特异性T细胞

学习制备可生物降解的人工抗原呈递细胞，通过独立调控粒径与形状增强T细胞活化。该技术为癌症免疫治疗及感染性疾病研究提供重要平台。

各向异性聚合物人工抗原呈递细胞的制备及其在CD8+ T细胞活化中的应用

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