Name: 乙型肝炎病毒感染原代肝细胞和库珀细胞的 肝片上 培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 了解肝片上芯片培养技术用于乙型肝炎病毒感染研究，利用原代肝细胞和库珀细胞构建三维生理微环境。该方法支持长期培养并进行药物测试，为病毒发病机制和免疫逃逸研究提供重要平台。

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本工作由欧洲研究理事会的启动基金（637304）、惠康信托基金会研究者奖（104771/Z/14/Z）以及 CN Bio Innovations 资助。

1. 培养板的组装与平衡
<ol>
	<li>确保与 LiverChip 平台相关的压缩机和真空泵均已开启。在 II 级生物安全柜内进行板的组装和平衡。</li>
	<li>无菌条件下将微流控板组装：将无菌膜置于板底座上，然后安装带有孔的上层板（图 1a）。</li>
	<li>确保无菌膜平稳地贴合在底板的两个定位针上，因为膜的位置不平整会影响微流控循环。</li>
	<li>盖上无菌板盖，并使用自动精密扭矩工具按照螺旋顺序将底板上的螺丝拧紧至 33 lb。随后使用手动扭矩工具确认所有螺丝均已拧紧至 35 lb。此步骤中需确保螺丝对称拧紧（图 1a）。</li>
	<li>在启动前，将含有 Williams E 培养基、原代肝细胞解冻与铺板添加剂、5% 胎牛血清（FBS）和 1 µM 地塞米松的肝细胞接种培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>将完全组装好的板放入清洗对接槽中，并向每个孔的储液侧加入 400 µL 肝细胞接种培养基，以启动灌注。确保板完全卡入清洗对接槽中。</li>
	<li>以 1 µL/s 的流速向上启动流动 3.5 分钟。可通过板侧面的红色指示器判断微流控循环是否成功运行（图 1a）。</li>
	<li>当培养基被泵送至板的细胞生长侧后，确认流道组装正确，再向每个孔额外加入 1.2 mL 肝细胞接种培养基。</li>
	<li>小心将板转移至 37 °C、5% CO2 的加湿培养箱内的对接站，并以 1 µL/s 的流速向上持续流动 16 小时（图 1c）。</li>
	<li>将板转移至清洗对接槽，通过轻柔地上下吹吸去除孔中的气泡。</li>
	<li>使用无菌镊子向每个孔中依次加入一片无菌圆形滤纸、细胞黏附支架和固定环。用无菌推杆按压每个孔，使固定环和支架牢固就位（图 1b）。</li>
	<li>吸除所有培养基，然后在支架上轻柔加入 400 µL 预热的肝细胞接种培养基，并以 1 µL/s 的流速向下启动流动 3.5 分钟。</li>
	<li>吸除从板储液侧泵出的所有培养基。此步骤对于更换流道内的培养基至关重要。</li>
	<li>在将板放回对接站前，向每个孔加入 1.4 mL 肝细胞接种培养基，以达到每孔总体积。此时每孔总体积为 1.6 mL（孔内 1.4 mL，流道内 0.2 mL）。</li>
</ol>
2. 肝细胞单培养的解冻与接种
<ol>
	<li>根据供应商说明书，在解冻一管原代人肝细胞（PHH）前，将肝细胞解冻培养基和肝细胞接种培养基预热至 37 °C。此步骤中使用室温离心机，以避免温度骤变。在 II 级生物安全柜中进行肝细胞的解冻与接种操作。</li>
	<li>用 1 mL 肝细胞接种培养基重悬细胞，并使用台盼蓝染色计数细胞。确保细胞活力高于 90%。</li>
	<li>将细胞置于冰上保存，直至加入孔板中。</li>
	<li>将已平衡并完全组装好的板转移至清洗平台，并吸除各孔中的全部培养基。</li>
	<li>在 500 µL 肝细胞接种培养基中，向每孔加入 600,000 个肝细胞。</li>
	<li>以 1 µL/s 的流速启动向下的流动，并通过加入 900 µL 肝细胞接种培养基，使每孔总体积达到 1.6 mL。</li>
	<li>将板转移至置于 37 °C、含 5% CO2 的湿化培养箱内的对接站中。</li>
	<li>以 1 µL/s 的流速启动向下的流动持续 8 小时，随后将流动方向反转为向上，以 1 µL/s 的流速继续流动 8 小时。</li>
	<li>将板转移至清洗平台，并吸除各孔中的全部培养基。</li>
	<li>向每孔加入 400 µL 肝细胞维持培养基（添加肝细胞维持补充剂和 100 nM 地塞米松的 Williams E 培养基），并以 1 µL/s 的流速启动向下的流动，持续 3.5 分钟。</li>
	<li>吸除储液池中的全部培养基，并加入 1.4 mL 肝细胞维持培养基（图 1d）。</li>
	<li>每 48 小时更换一次培养基。为确保孔内培养基完全更换，在添加新鲜肝细胞维持培养基前需执行一次清洗步骤。</li>
	<li>进行清洗步骤时，将板转移至清洗平台，吸除各孔中的全部培养基，然后加入 400 µL 维持培养基。</li>
	<li>以 1 µL/s 的流速启动向下的流动持续 3.5 分钟，吸除出现在孔板储液池侧的所有培养基。</li>
	<li>加入 1.4 mL 肝细胞维持培养基，并将板置于 37 °C、含 5% CO2 的湿化培养箱内，转移至对接站，以 1 µL/s 的流速启动向上的流动，持续 48 小时（图 1f）。 
	注意： 对于作为共培养对照使用的肝细胞单层培养，为确保条件可控，需使用第二种特定用于与原代人库普弗细胞共培养的维持培养基。在将肝细胞接种培养基更换为肝细胞维持培养基后 48 小时（接种后第 3 天），常规肝细胞维持培养基将被替换为共培养维持培养基 II，特别是在比较 PHH 单层培养与 PHH 和库普弗细胞共培养时，因为两种培养基的成分略有不同。</li>
</ol>
3. 枯否细胞和肝细胞共培养的解冻与接种
<ol>
	<li>为确保结果的准确比较，始终将PHH/库普弗细胞共培养体系与PHH单培养体系进行比较</li>
	<li>对于PHH与库普弗细胞的共培养，按照供应商说明，在不含地塞米松但添加了原代肝细胞解冻与铺板补充剂的高级杜尔贝科改良伊格尔培养基（AdDMEM）中（共培养接种培养基）解冻一管库普弗细胞。在II级生物安全柜中进行库普弗细胞和肝细胞的解冻与接种操作</li>
	<li>用1 mL共培养接种培养基重悬细胞，并使用台盼蓝染色计数细胞。确保细胞活力高于90%</li>
	<li>在将细胞加入孔板前，将其置于冰上以避免细胞提前贴壁</li>
	<li>按照步骤2.1–2.3的说明解冻原代人肝细胞</li>
	<li>将已平衡并完全组装好的板转移至洗涤平台，并吸除各孔中的全部培养基</li>
	<li>向每孔中加入60,000个库普弗细胞和/或600,000个肝细胞，每孔总体积为250 µL共培养接种培养基</li>
	<li>以1 µL/s的流速启动向下流动，并向每孔加入900 µL共培养接种培养基</li>
	<li>将板转移至37 °C、5% CO2的加湿培养箱内的对接站中</li>
	<li>以1 µL/s的流速进行向下流动8小时，随后切换为向上流动，同样以1 µL/s的流速持续8小时</li>
	<li>将板转移至洗涤平台，并吸除各孔中的全部培养基</li>
	<li>向每孔加入400 µL共培养维持培养基I（不含地塞米松但添加了肝细胞维持补充剂的AdDMEM），并以1 µL/s的流速启动向下流动，持续3.5分钟</li>
	<li>吸除储液端出现的所有培养基，并向每孔加入1.4 mL共培养维持培养基I</li>
	<li>将板转移至37 °C、5% CO2的加湿培养箱内的对接站中，并以1 µL/s的流速启动向上流动，持续48小时</li>
	<li>将板转移至洗涤平台，吸除各孔中的全部培养基，加入400 µL共培养维持培养基II（不含地塞米松但添加了100 nM氢化可的松及肝细胞维持补充剂的Williams E培养基），并以1 µL/s的流速启动向下流动，持续3.5分钟</li>
	<li>吸除孔板储液端出现的所有培养基</li>
	<li>加入1.4 mL共培养维持培养基II，并将板转移至37 °C、5% CO2的加湿培养箱内的对接站中</li>
	<li>以1 µL/s的流速启动向上流动，持续48小时（图1e）</li>
	<li>每48小时更换一次共培养维持培养基II。为确保孔内培养基完全更换，在添加新鲜培养基前需执行洗涤步骤</li>
	<li>洗涤时，将板转移至洗涤平台，吸除各孔中的全部培养基，然后加入400 µL共培养维持培养基II</li>
	<li>以1 µL/s的流速启动向下流动3.5分钟，吸除储液端出现的所有培养基</li>
	<li>加入1.4 mL共培养维持培养基II，并将板转移至37 °C、5% CO2的加湿培养箱内的对接站中，以1 µL/s的流速启动向上流动，持续48小时（图1f）</li>
</ol>
4. 用于感染研究的传染性乙型肝炎病毒的制备
<ol>
	<li>在三级生物安全实验室中进行本方案的此部分操作。所有细胞接种、换液、培养基收集及病毒浓缩步骤均须在II级生物安全柜中进行。</li>
	<li>将HBV-producing细胞（例如HepDE19、HepAD38）在胶原蛋白包被的T1000五层培养瓶中，使用120 mL完全DMEM/F12培养基（含10% FBS、青霉素/链霉素、非必需氨基酸、500 μg/mL G418和1 μg/mL四环素）进行培养，直至细胞融合度达到90%。</li>
	<li>更换为诱导培养基（不含四环素的完全DMEM），以诱导HBV的产生。</li>
	<li>在撤除四环素后的12天内，每48小时收集一次全部培养基，并于4 °C保存。</li>
	<li>使用0.45 µm瓶顶滤器过滤所收集的培养基。</li>
	<li>向收集的培养基中加入无菌的聚乙二醇8000（PEG 8000）磷酸盐缓冲液（PBS），使其终浓度为4% w/w，倒置混匀8–10次，于4 °C孵育16小时。在4 °C下以10,000 × g离心1小时，收集PEG沉淀的病毒颗粒，并将沉淀重悬于含10% FBS的PBS中。</li>
	<li>合并所有时间点收集的PEG沉淀病毒，铺于20%蔗糖垫上。使用SW28转子在4 °C下以140,000 × g离心16小时。</li>
	<li>吸除上清液，将沉淀重悬于含10% FBS的PBS中，分装后于-80 °C保存。</li>
	<li>通过HBV DNA qPCR（步骤6）测定上清液中的HBV DNA拷贝数。</li>
</ol>
5. 乙肝病毒对三维培养物的感染
<ol>
	<li>在生物安全三级实验室的II级生物安全柜内进行感染操作。</li>
	<li>单层培养或共培养接种后第3天，在室温下解冻所需数量的含乙型肝炎病毒（HBV）的分装样品，并将所需病毒剂量分别用1.8 mL肝细胞维持培养基或共培养维持培养基II稀释至每孔。</li>
	<li>此1.8 mL稀释后的病毒液足以用于洗涤步骤（400 µL）和孔内培养基的更换（1.4 mL）。然而，感染复数（MOI）需根据最终培养体积1.6 mL进行相应调整。</li>
	<li>将培养板转移至洗涤平台，吸除各孔中的全部培养基。每孔加入400 µL含HBV的培养基，并以1 µL/s的流速启动向下流动，持续3.5分钟。吸除出现在储液端各孔中的全部培养基。</li>
	<li>每孔加入1.4 mL含HBV的维持培养基/共培养维持培养基II，将培养板转移至37 °C、5% CO2的湿化培养箱内的对接站。以1 µL/s的流速启动向下流动，持续8小时，随后切换为向上流动，流速同样为1 µL/s。</li>
	<li>加入HBV后24小时，将培养板转移至洗涤平台，吸除各孔中的全部培养基。</li>
	<li>根据步骤2.12–2.14中所述的培养类型，用相应的培养基对每孔进行3次洗涤，以清除孔中残留的病毒。与步骤2.12–2.14不同的是，每次洗涤需向每孔加入1.6 mL培养基，以预留额外体积用于取样，从而排除接种液残留的影响（图1g）。</li>
	<li>完成上述洗涤步骤后，从每孔收集200 µL培养基，用于通过定量细胞外HBV DNA确认HBV接种液是否被完全清除。</li>
	<li>将培养板转移至37 °C、5% CO2的湿化培养箱内的对接站，以1 µL/s的流速启动向上流动，持续48小时。</li>
	<li>48小时后，收集每孔的全部培养液体积用于下游分析，随后按照步骤2.12–2.14所述，用肝细胞维持培养基洗涤三次。此后每48小时更换培养基，并对每孔进行3次洗涤，直至实验结束。</li>
</ol>
6. 细胞外HBV DNA的定量
<ol>
	<li>在三级生物安全实验室中，按照试剂盒说明书从培养上清液中提取总DNA，加入1 µg载体RNA，以确保在将样本转移至其他区域前完成病毒灭活。</li>
	<li>配制qPCR主混合液，包含定量PCR预混液、600 nM正向引物、600 nM反向引物和300 nM探针。</li>
	<li>向384孔板的每个孔中加入7 µL主混合液。</li>
	<li>向qPCR板的每个孔中加入5 µL DNA样本（设复孔）、无模板对照，以及系列稀释的含HBV基因组的质粒标准品（如pCMV-HBV），浓度范围从每反应109拷贝至每反应102拷贝，每个浓度设复孔。</li>
	<li>在板上覆盖粘性封板膜，确保每个孔均密封良好。</li>
	<li>将板在300 x g条件下离心1分钟。</li>
	<li>按照试剂盒说明书启动qPCR程序。实时PCR的循环条件为：95 °C预变性10分钟，随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性15秒，60 °C退火延伸1分钟。</li>
	<li>根据标准曲线定量未知样本中的HBV DNA拷贝数。</li>
</ol>
7. 细胞内乙型肝炎病毒前基因组（pg）RNA的定量
<ol>
	<li>根据制造商说明书从支架中提取总RNA。为确保细胞完全裂解，每次涡旋振荡支架30秒，共进行3次，每次振荡后以300 × g 离心1分钟。细胞裂解步骤应在三级生物安全实验室中进行，以确保在将样品转移至其他区域前完成病毒灭活。</li>
	<li>根据制造商说明书，将提取的RNA反转录为cDNA。</li>
	<li>反转录反应的循环条件为：25 °C 反应10分钟，37 °C 反应120分钟，85 °C 反应5分钟。</li>
	<li>cDNA样品可短期保存于4 °C，或长期保存于-20 °C。</li>
	<li>配制pgRNA和RPS11的预混液，包含定量PCR预混液以及pgRNA和RPS11（作为看家基因）的正向与反向引物，引物终浓度为0.2 µM。</li>
	<li>在384孔板中，每孔加入7.5 µL预混液和2.5 µL cDNA。每个样品的RPS11和pgRNA均设复孔检测，并为两个基因均设置无模板对照孔。</li>
	<li>在板上覆盖粘性封板膜，确保每个孔完全密封。</li>
	<li>将板以300 × g 离心1分钟。</li>
	<li>将板放入qPCR仪中，根据制造商说明书使用标准定量PCR程序开始扩增反应。实时PCR的循环条件为：50 °C 2分钟，95 °C 2分钟，随后进行40个循环（95 °C 15秒，60 °C 1分钟）。</li>
	<li>计算pgRNA相对于RPS11的表达量。</li>
</ol>
8. 病毒抗原的免疫荧光染色
<ol>
	<li>在三级生物安全实验室的II级生物安全柜中，用镊子取下小室的固定环，并取出支架。</li>
	<li>在三级生物安全实验室中，将含有细胞的支架置于1 mL PBS中，加入4%多聚甲醛，室温固定30分钟。后续步骤可在其他区域进行。</li>
	<li>用1 mL PBS洗涤支架3次。</li>
	<li>使用含0.1% Triton-X 100的1 mL PBS溶液，室温孵育1小时，对细胞进行通透处理。</li>
	<li>用1 mL PBS洗涤支架3次。</li>
	<li>将支架在含1% BSA的1 mL PBS溶液中4 °C孵育16小时，以封闭非特异性结合位点。</li>
	<li>用1 mL PBS洗涤支架3次。</li>
	<li>使用兔抗乙型肝炎病毒核心抗原抗体，按1:200比例溶于含1% BSA的1 mL PBS中，4 °C孵育16小时，进行一抗染色。</li>
	<li>用1 mL含0.1% Tween的PBS（PBS-Tween）洗涤1次，再用1 mL PBS洗涤3次。</li>
	<li>使用山羊抗兔IgG (H+L) 交叉吸附的Alexa Fluor 594标记二抗，按1:2,000比例溶于含1% BSA的1 mL PBS中，4 °C孵育16小时，进行二抗染色。</li>
	<li>用1 mL含0.1% Tween的PBS洗涤1次，再用1 mL PBS洗涤3次。</li>
	<li>使用含2 µg/mL DAPI的1 mL PBS溶液，室温孵育10分钟，对支架进行DAPI复染。</li>
	<li>用1 mL含0.1% Tween的PBS洗涤1次，再用1 mL PBS洗涤3次。</li>
	<li>将支架转移至显微镜载玻片上，封片后准备成像。</li>
	<li>使用荧光显微镜对支架进行成像。</li>
</ol>
9. 人血清白蛋白ELISA
<ol>
	<li>若操作传染性材料，应在生物安全三级实验室内的II级生物安全柜中进行本方案的此部分操作。</li>
	<li>为评估原代人肝细胞（PHH）的存活率和代谢功能，可通过ELISA检测人白蛋白的生成水平。</li>
	<li>用包被缓冲液（100 mM 碳酸氢盐/碳酸盐，pH 9.6）将山羊抗人抗体按1:800稀释后，每孔加入50 µL至96孔板中。覆盖后于37 °C孵育2小时，或于4 °C过夜孵育。</li>
	<li>吸除孔板中的包被抗体，用200 µL 0.05% PBS-Tween溶液洗涤4次。</li>
	<li>每孔加入200 µL封闭缓冲液（含1% BSA的PBS），覆盖后于37 °C孵育1小时，或于4 °C保存3个月。如需长期保存，可在封闭缓冲液中添加0.05%叠氮化钠。</li>
	<li>吸除封闭缓冲液，用200 µL 0.05% PBS-Tween溶液洗涤1次。</li>
	<li>每孔加入50 µL已预先稀释的样品（1:100）。样品稀释液为含1% BSA的0.05% PBS-Tween溶液。于37 °C孵育1小时，或于4 °C过夜孵育。 
	注意：标准品应与样品同时孵育。建议使用500–0.488 ng/mL浓度范围（1:2倍比稀释）的标准品。所有人白蛋白的系列稀释均应在样品稀释液中进行。</li>
	<li>吸除孔板中的样品，用200 µL 0.05% PBS-Tween溶液洗涤4次。</li>
	<li>每孔加入50 µL已预先用样品稀释液按1:10,000稀释的HRP标记山羊抗人白蛋白抗体。于37 °C孵育2小时，或于4 °C过夜孵育。</li>
	<li>吸除孔板中的抗体，用200 µL 0.05% PBS-Tween溶液洗涤6次。</li>
	<li>每孔加入100 µL TMB显色试剂，当最高浓度标准品显色完全时，立即加入100 µL 1 M H2SO4以终止显色反应。</li>
	<li>使用96孔板读板仪在450 nm波长下测定吸光度，用于后续分析。</li>
</ol>
10. 三维共培养体系中白细胞介素（IL）6和肿瘤坏死因子（TNF）α的产生
<ol>
	<li>若使用传染性材料，应在生物安全三级实验室中指定的II级生物安全柜内进行本方案的此部分操作。</li>
	<li>定量检测IL6和TNFα的产生，以评估原代库普弗细胞的功能性和活力。为诱导库普弗细胞产生这些细胞因子，可在接种后第9天向共培养体系中加入1 µg/mL脂多糖（LPS），在共培养维持培养基II中处理48 h。</li>
	<li>接种后第11天，收集每孔培养上清液，并于-80 °C保存。</li>
	<li>采用适当的检测方法并按照试剂盒生产商的说明，测定培养上清液中IL6和TNFα的浓度。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

原代人肝细胞（PHH）长期培养所面临的挑战推动了多种功能更强、寿命更长的培养模型的发展，每种模型各有其优势与局限性。目前普遍认为，静态的二维PHH培养仅能在极有限的时间内模拟肝细胞生物学的某些方面。因此，微图形共培养12,13、球体培养14,15以及三维“肝脏芯片”培养16,17正迅速取代这些较为基础的培养系统。尤其是在研究与宿主共同进化并依赖特定微环境的人嗜性传染病时，提供生理相关环境的需求尤为突出，这正是由于培养诸如丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒（HBV）和疟疾等人类病原体常常具有挑战性所致。
进行三维肝芯片培养最关键的步骤是初始来源的原代细胞质量。应检测这些细胞的贴壁能力，仅使用可贴壁的原代人肝细胞（PHH）批次，以确保成功形成组织并建立培养。尽管可以使用 freshly isolated PHH，但其冷冻保存通常较为复杂，需要特殊的程序控温冷冻设备。
与传统的静态二维培养相比，宿主的遗传背景对HBV感染的易感性影响可忽略不计，迄今为止测试的所有肝细胞供体均能够建立HBV感染4。
尽管患者来源的乙型肝炎病毒（HBV）能够建立三维培养感染，但在使用可诱导的HBV生产细胞系制备病毒接种物时，必须采用聚乙二醇（PEG）沉淀结合蔗糖垫纯化的HBV。细胞培养上清液若直接应用于三维肝芯片培养系统，由于存在抑制因子或所含生长因子与肝细胞不相容，通常难以有效引发感染。此外，在选择患者来源的病毒接种物时，应仅使用血清，因为血浆不可避免地会发生凝固，堵塞培养平台的微流体循环系统。
无论使用何种病毒接种物，确保细胞的存活率和分化状态，以及彻底清除初始的乙型肝炎病毒（HBV）接种物，是成功开展长期感染研究的关键。最便捷的方法是在去除病毒接种物后取样培养物，并在整个培养期间检测人血清白蛋白水平。值得注意的是，与其他所有已描述平台相似，一旦建立HBV感染，病毒并不容易向未感染细胞扩散。其潜在机制尚不清楚，因为在体内，HBV感染能够轻易感染肝脏中大多数肝细胞。
对于原代人肝细胞（PHH）与库普弗细胞的共培养，建议对不同批次的库普弗细胞进行批次测试，以评估其在脂多糖（LPS）刺激下分泌IL6和TNFα的能力，因为并非所有 commercially available 的库普弗细胞供体都具有相同的反应性。
重要的是，在进行所有药物处理或使用 HBV 初始感染培养物时，必须考虑孔的总体积（1.4 mL）以及微流控通道的体积（0.2 mL），以便准确计算药物或接种物的浓度。为确保给药准确，需使用含有 HBV 或药物的培养基进行一次洗涤操作，以预处理微流控通道。
该平台每孔使用 600,000 个原代人肝细胞（PHH），可确保支架内形成多层肝细胞结构。尽管细胞数量可以调整，但所选的细胞浓度能够保证最佳实验结果。该培养板可容纳总共 12 个支架，最多可升级至 36 个支架。然而，由于微流控系统的要求，目前尚无法进一步扩大至更高孔数的培养板。
通过这些方法，细胞培养物可维持至少40天的最佳细胞功能，迄今为止，这为评估新型候选药物以及研究乙型肝炎病毒感染期间不同肝细胞群体之间的复杂相互作用提供了前所未有的机会。

乙型肝炎病毒（HBV）的研究因培养系统易感性差而变得复杂，通常需要每细胞数百至数千拷贝的HBV基因组才能启动感染1此外，原代人肝细胞通常极为脆弱，在常规培养过程中会迅速去分化。2这主要是因为平坦且坚硬的塑料表面无法模拟肝脏内天然的细胞外环境，同时在缺乏微流控循环的情况下，培养体系普遍缺乏氧合。在胶原包被的培养板上进行的传统静态肝细胞培养会迅速去分化，并失去对乙型肝炎病毒（HBV）感染的易感性。3在此，我们描述了在三维肝芯片培养系统中培养并感染原代人肝细胞（PHH）的建立方法。相较于传统的在胶原包被培养板上进行的二维静态PHH培养，该三维系统具有显著优势，因其可维持更长时间的代谢活性和功能完整性，支持至少40天以上的长期培养。4在该系统中，将原代人肝细胞（PHH）接种于胶原蛋白包被的支架上，并持续灌注培养基以向细胞提供氧气和营养物质。尽管基于小鼠成纤维细胞复杂共培养或球形体三维培养的其他PHH培养系统已被验证可感染乙型肝炎病毒（HBV），但其感染所需的病毒量为每个细胞500个基因组当量（GE），而唯有三维肝芯片培养系统仍为唯一可在每个细胞0.05 GE的低感染复数下实现HBV感染的体外模型系统。4此外，这些培养系统建立HBV感染需要使用高浓度的二甲基亚砜（DMSO）和聚乙二醇（PEG），而在3D肝芯片培养系统中感染则无需这些成分。4HBV感染的主要特征之一是cccDNA池，它作为所有新病毒转录的模板-产生的病毒颗粒5,6即使在常规的肝细胞培养中也能检测到cccDNA7,8目前尚不清楚cccDNA的调控机制以及旨在清除cccDNA的治疗策略是否在部分或完全去分化的肝细胞中仍然有效。我们已证实，在三维肝芯片培养系统中，cccDNA可功能性形成，能够响应生理刺激，并可通过干扰转录机器对cccDNA基因组的可及性来实现靶向干预。4.
在类器官芯片的三维肝脏模型中，宿主对乙型肝炎病毒（HBV）感染的反应与HBV感染患者的观察结果相似，从而能够识别感染相关的生物标志物以及治疗效果的指标。类器官芯片培养系统的一个独特优势在于，能够在三维环境中长期评估原代人肝细胞（PHH）与肝脏其他非实质细胞（包括库普弗细胞4、星状细胞9 和肝窦内皮细胞10,11）之间的相互作用，为在复杂的三维微环境中研究细胞与细胞间的相互作用提供了独特的机会。
此外，该&#160;平台&#160;的延长培养周期有利于评估序贯药物治疗及其对乙型肝炎病毒（HBV）持续性的影响，而这是传统肝细胞培养系统无法实现的。
本方案描述了如何建立三维肝芯片培养系统，可用于原代人肝细胞（PHH）的单培养，或PHH与库普弗细胞的共培养。此外，我们还介绍了用于低感染复数研究的纯化乙型肝炎病毒（HBV）的制备方法，以及后续对宿主和病毒应答的分析。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>威廉姆斯E培养基，无酚红</td><td>GIBCO</td><td>A12176-01</td><td></td></tr><tr><td>肝细胞解冻培养基</td><td>GIBCO</td><td>CM7500</td><td></td></tr><tr><td>原代肝细胞解冻与接种培养基添加剂</td><td>GIBCO</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>原代肝细胞培养维持添加剂</td><td>GIBCO</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>高级DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12491023</td><td></td></tr><tr><td>不含钙、镁的DPBS</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>MEM非必需氨基酸（NEAA）100×</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清，美国来源，经热灭活，经无菌过滤，适用于细胞培养</td><td>SIGMA</td><td>12106C</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>SIGMA</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>默克</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>小牛皮胶原蛋白</td><td>默克</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>SIGMA</td><td>G418-RO</td><td></td></tr><tr><td>四环素</td><td>SIGMA</td><td>T3258</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇 8000</td><td>SIGMA</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>SIGMA</td><td>SO389</td><td></td></tr><tr><td>无水碳酸钠</td><td>SIGMA</td><td>451614-25G</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>SIGMA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>SIGMA</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸，99.999%</td><td>SIGMA</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>白蛋白（人）</td><td>SIGMA</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagent&amp;nbsp;牛血清白蛋白，第五组分，热激处理</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9701-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II，不含UNG</td><td>应用生物系统公司</td><td>4440040</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>应用生物系统公司</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>脂多糖来自 &lt;em&gt;大肠杆菌&lt;/em&gt; K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂盒/耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌膜</td><td>CN Bio 创新</td><td>液相色谱-单细胞分析</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 灌注细胞培养板</td><td>CN Bio 创新</td><td>LC12</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 培养板盖</td><td>CN Bio 创新</td><td>液相色谱-单细胞分析</td><td></td></tr><tr><td>无菌圆形滤纸</td><td>CN Bio 创新</td><td>液相色谱-单细胞</td><td></td></tr><tr><td>细胞黏附支架</td><td>CN Bio 创新</td><td>液相色谱-单细胞分析</td><td></td></tr><tr><td>卡环</td><td>CN Bio 创新</td><td>液相色谱-单细胞分析</td><td></td></tr><tr><td>无菌推杆</td><td>CN Bio 创新</td><td>LC-ST</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy 血液 &amp;amp；组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>人类磁珠发光素检测</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-步超敏TMB-ELISA底物溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>高容量cDNA反转录试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp 病毒RNA小型附加试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>1048147</td><td>含RNA载体</td></tr><tr><td>Millipore Millicell HY 5层细胞培养瓶，T-1000，无菌</td><td>默克密理博（Millipore, Merck）</td><td>PFHYS1008</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 384 孔反应板（带条形码）</td><td>生命技术</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学粘性膜</td><td>生命技术</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>透明平底免疫非无菌96孔板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>96孔板封板膜</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 快速流速无菌一次性瓶顶滤器（PES 膜）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>295-3345</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;带磨砂边双面磨砂显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB58628</td><td></td></tr><tr><td>超薄管，超透明，38.5 mL，25 × 89 mm</td><td>贝克曼库尔特</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;原代细胞 / 细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人源可培养肝细胞，经转运体功能验证</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>HMCPTS</td><td></td></tr><tr><td>冻存人库普弗细胞</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>HepDE19细胞系</td><td>Haitao Guo（美国印第安纳州印第安纳大学）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;引物/探针/标准品&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBV DNA 正向引物</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GTGTCTGCGGCGTTTTATCA-3'</td></tr><tr><td>HBV DNA 逆转录引物</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'</td></tr><tr><td>HBV DNA 探针</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCATC-3'TAMRA</td></tr><tr><td>pgRNA 正向引物</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'</td></tr><tr><td>pgRNA 反向引物</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'</td></tr><tr><td>RPS11 正向引物</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'</td></tr><tr><td>RPS11 反向引物</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'</td></tr><tr><td>pCMV-HBV</td><td>Christopher Seeger 教授（美国宾夕法尼亚州福克斯蔡斯癌症中心）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗乙型肝炎病毒核心抗原IgG组分（多克隆）</td><td>DAKO</td><td>已停止</td><td>Lot 10102505</td></tr><tr><td>人白蛋白抗体，A80-129A</td><td>Bethyl Laboratories, Inc.</td><td>A80-129A</td><td></td></tr><tr><td>人白蛋白交叉吸附抗体，A80-229P</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-229P</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 594</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>#&amp;nbsp;A-11072</td><td>Lot 1431810</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;货号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;强&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;强&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 真空泵</td><td>CN Bio 创新</td><td>液相色谱-质谱联用</td><td></td></tr><tr><td>肝脏芯片气动连接</td><td>CN Bio 创新</td><td>液相色谱-光化学氮检测器</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 平台</td><td>CN Bio 创新</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 微流控芯片板清洗支架</td><td>CN Bio 创新</td><td></td><td></td></tr><tr><td>可高压灭菌的金属镊子</td><td>VWR</td><td>232-0106</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>科学产业</td><td>SKU: SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Optima XPN-80 超速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Multifuge X3R 离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75004500</td><td></td></tr><tr><td>SAM-12 医用吸引器 高真空 高流量</td><td>MGE 全球范围</td><td>&amp;nbsp;SAM12/01010101</td><td></td></tr><tr><td>NUAIRE 5800 系列培养箱</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5841</td><td></td></tr><tr><td>自动精密扭矩</td><td>CN Bio 创新</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手动扭矩</td><td>CN Bio 创新</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChip 压缩器</td><td>CN Bio 创新</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminex LX-200 仪器配备 xPONENT 3.1</td><td>Luminex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millipore 手持式磁力分离架</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Millipore&amp;trade; 40-285</td><td></td></tr><tr><td>FluoStar Optima 酶标仪</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLVER 精密电动螺丝刀</td><td>VTECH 有限公司</td><td>FAB10RE/FR</td><td></td></tr><tr><td>KOLVER 电源供应器</td><td>VTECH 有限公司</td><td>EDU1FR</td><td></td></tr><tr><td>BAMBI VTS75D</td><td>空气设备</td><td>已停止</td><td></td></tr><tr><td>Integra Vacuboy</td><td>INTEGRA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 实时荧光定量 PCR 系统（384 孔反应模块）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>4453536</td><td></td></tr></tbody></table>

用于乙型肝炎病毒感染的原代肝细胞与库普弗细胞“肝脏芯片”培养

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

尽管乙型肝炎病毒（HBV）在体内具有极强的感染性，仅需三个病毒基因组即可导致实验感染的黑猩猩出现慢性感染，但大多数体外模型需要每个细胞数百至数千个病毒基因组才能启动短暂感染。此外，原代人肝细胞（PHH）的静态二维培养由于细胞快速去分化，仅能支持短期研究。本文介绍了一种基于3D肝芯片的PHH培养系统，可采用单细胞培养或与非实质性的肝脏常驻细胞共培养。该系统显著改善了对长期HBV感染及生理性宿主细胞反应的研究。除了有助于药物疗效评估、毒理学分析和致病机制研究外，这些微流控培养系统还可用于评估旨在清除共价闭合环状（ccc）DNA的HBV治愈性疗法。本方法详细描述了PHH单培养及PHH/库普弗细胞共培养体系的建立、使用纯化HBV进行感染以及宿主反应的分析。该方法特别适用于评估HBV感染的长期影响、治疗组合方案以及致病机制。

我们介绍一种简单且多功能的平台，用于长期培养原代人库普弗细胞和/或肝细胞，并实现其乙型肝炎病毒（HBV）感染。将原代人细胞接种于微流控板组件内经胶原包被的聚苯乙烯支架上，通过该组件持续向细胞灌注生长培养基（图1a）。
原代人肝细胞（PHH）在传统培养系统中通常只能维持有限的时间，而通过该方法可实现其功能的长期维持。功能性的肝细胞会分泌人血清白蛋白，后者被公认为评估肝脏代谢功能的最佳标志物；在3D培养条件下，人血清白蛋白可自接种后持续至第40天稳定且高水平表达（图2）。对于共培养体系，可通过检测特定细胞因子（如IL6和TNFα）的分泌情况来评估库普弗细胞的功能性与存活状态。为测定细胞因子的产生，建议在脂多糖（LPS）刺激共培养体系后，采用基于捕获法的检测手段进行检测（图3）。
细胞形成肝微组织，通常在接种原代人肝细胞（PHH）后3天内即可观察到，表现出功能性的胆小管结构和完整的细胞极性。图2）。除了保持其生理状态下的细胞代谢外，这些培养物对乙型肝炎病毒（HBV）感染表现出极高的易感性。与其他培养系统相比，HBV DNA及其他病毒标志物在感染后第2天即可被轻易检测到（图4）。除了病毒性感染的分泌标志物外，还可从培养物中回收含肝细胞的支架，用于病毒抗原的免疫荧光检测（例如， HBsAg，HBcAg）图4）。传统的肝细胞培养需要每细胞接种至少500个HBV基因组当量（HBV GE），并添加2%二甲基亚砜（DMSO）和4%聚乙二醇（PEG），而在三维培养中，仅需0.05个HBV GE即可引发感染，且无需DMSO或PEG。图4).
<img alt="图1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg" /> 
图1：三维肝芯片培养系统的构建。（a）该图为培养板组装的示意图，以确保建立微流体循环系统。（b）此图展示了培养孔的局部放大视图，包括滤纸、支架材料和固定环。（c）此图展示了接种细胞前的培养板平衡过程。接下来的两个图示分别为（d）肝细胞单培养和（e）肝细胞/库普弗细胞共培养的接种过程。（f）此图展示了换液过程中的洗涤步骤。（g）此图展示了乙型肝炎病毒（HBV）感染实验的设置，包括接种液的移除。S.M. = 接种培养基，M.M. = 维持培养基。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="图2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg" /> 
图2：肝微组织形成及肝细胞活力。 （a）该图显示3D肝细胞单层培养在接种后形成微组织的纵向明场图像。（b）该图显示培养物的免疫荧光成像，细胞核染为蓝色，人白蛋白染为绿色。（c）该图显示在40天的肝细胞单层培养期间，总白蛋白以及按细胞数校正后的白蛋白生成量，检测方法为ELISA。所示数据为均值±标准差。本图改编自Ortega-Prieto等4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg" /> 
图3：三维共培养体系中库普弗细胞的功能性。 本图显示了在接种后第9天外源性添加脂多糖（LPS）刺激下，接种后第11天肝细胞单培养以及肝细胞/库普弗细胞共培养体系中（a）IL6 和（b）TNFα 的分泌水平，检测方法为人类磁性液相芯片分析法。该图改编自 Ortega-Prieto 等人4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="图4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg" /> 
图4：肝芯片培养物中的乙型肝炎病毒（HBV）感染。 （a）该图显示在用HBV感染培养物10天后，通过免疫荧光显微镜检测到的HBcAg（红色）、HBsAg（绿色）以及细胞核（蓝色）。（b）该图显示通过定量培养上清液中的HBV DNA所测定的不同感染复数（MOI）下培养物对HBV感染的易感性。（c）该图显示相对于管家基因RPS11的HBV前基因组RNA（pgRNA）纵向累积量的定量结果。所示数据为均值±标准差（SD）。本图改编自Ortega-Prieto等人的研究4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本实验方案的目的是提供一份逐步操作指南，用于进行乙型肝炎病毒感染的3-D&#34;肝脏芯片&#34;实验。

尽管乙型肝炎病毒（HBV）在体内具有极强的感染性，仅需三个病毒基因组即可在实验条件下导致慢性感染……

该方法有助于解答嗜肝性感染和肝病研究领域中的关键问题，例如肝脏常驻细胞群体在病毒致病机制、长期感染动力学、病毒复制机制、免疫浸润以及生理模型系统和药物测试研究中的作用。该技术的主要优势在于能够重建肝脏微环境。该模型可长期维持，并且在生理相关水平上天然易感乙型肝炎病毒感染。这在此前一直是乙型肝炎研究领域的基本限制因素。该技术的意义在于为乙型肝炎病毒（HBV）感染的治疗或诊断提供了可能，因为药物测试研究可以在生理相关的平台上进行，并持续较长时间。这使得能够评估序贯药物治疗，同时分析现有和新型治疗策略的有效性。该方法有助于深入了解乙型肝炎，也可应用于其他疾病研究，包括其他嗜肝性感染、肝脏疾病或药物代谢研究。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该方法需要特别关注诸多细节，以确保肝组织能够长期成功维持。以及熟悉专用工具和设备。该方法的可视化演示至关重要，包括培养板的组装，以及细胞的解冻和接种。由于使用新型培养系统进行肝源性细胞长期培养时涉及的步骤较为复杂。首先，启动与肝芯片平台相关的压缩机和真空泵。然后进入玻璃管柜中组装并平衡培养板。将无菌膜放置在板底上，开始无菌组装微流控板。确保无菌膜平整地置于底板的两个定位针上，然后添加带有孔的上层板。安装无菌的板盖，并使用设定为33磅的自动精密扭矩扳手，按照螺旋顺序拧紧板底的螺丝。使用手动扭矩扳手，确保所有螺丝均拧紧至 35 磅。接下来，在灌注前将肝细胞接种培养基预热至 37 摄氏度。将完全组装好的培养板放入清洗舱中。确保培养板完全卡紧。向每个孔的储液槽侧加入 400 µL 肝细胞接种培养基，以预润培养板。随后，以 1 µL/秒的流速向上流液 3.5 分钟。培养板侧面的红色指示器将显示微流控循环系统是否正常工作。当培养基被泵送至培养板的细胞生长侧后，再加入1.2毫升肝细胞接种培养基。小心将培养板转移至37摄氏度、5%CO2的加湿培养箱内的对接站中。以每秒一微升的流速向上启动流动，持续16小时。之后，将板转移至洗涤平台。轻轻吹打上下液面，以消除任何气泡。使用无菌镊子，向每个孔中加入一片无菌圆形滤纸。然后向每个孔中加入细胞贴壁支架和固定环。使用无菌推杆压下每个孔，使固定环和支架固定到位。接下来，吸除全部培养基。然后，轻柔地在支架上加入400微升预热的肝细胞接种培养基。以每秒1微升的流速，向下灌注3分30秒。吸出从培养板储液端泵出的全部培养基。向每个孔中加入1.4毫升肝细胞接种培养基。然后将培养板放回对接座，使每孔的总体积达到1.6毫升。首先，将肝细胞解冻培养基和肝细胞接种培养基预热至 37 摄氏度。接着，根据供应商的说明解冻一管原代人肝细胞。在生物安全柜中，用一毫升肝细胞接种培养基重悬细胞。然后将重悬的细胞置于冰上。使用台盼蓝对细胞进行计数，以确保细胞活力高于90%。将完全组装好的培养板转移至洗涤平台，并吸除各孔中的全部培养基。从冰上取出细胞，将 600,000 个肝细胞加入每个孔中，每孔加入 500 微升肝细胞接种培养基。以每秒 1 微升的流速启动向下的流动。向每个孔中加入 900 微升肝细胞接种培养基，使每孔总体积达到 1.6 毫升。将培养板转移至37摄氏度、含5% CO2的加湿培养箱内的对接站。以1微升/秒的流速向下流动8小时。随后，将流体方向反转，以1微升/秒的流速向上流动8小时。然后将培养板转移至清洗平台，吸出各孔中的全部培养基。向每孔加入400微升肝细胞维持培养基，并以每秒1微升的流速启动向下方向的流动，持续3分30秒。接下来，吸除储液槽中的全部培养基，并加入 1.4 毫升肝细胞维持培养基。将培养板转移至37摄氏度、5%CO2的湿润化培养箱内的对接站中。以每秒一微升的流速，向上启动流动，持续48小时。48小时后，将培养板转移至洗涤平台进行洗涤。吸出各孔中的全部培养基，并加入400微升维持培养基。以每秒一微升的速度向下启动流动，持续3.5分钟。然后吸除流经小孔并出现在储液池侧的所有培养基。加入1.4毫升肝细胞维持培养基。然后将培养板转移回加湿培养箱中的对接站。以每秒1 µL的流速向上流动，持续48小时。每48小时使用此清洗-替换流程更换一次培养基。在使用传统培养系统时，原代人肝细胞通常只能在有限的时间内保持稳定。然而，采用此处描述的方案，可使其功能维持更长时间。功能正常的肝细胞会分泌人血清白蛋白，该蛋白被认为是评估肝脏功能的最佳标志物。白蛋白在3D培养中显示出稳定且高水平的表达，至少持续至接种后第40天。对于共培养体系，通过检测特定细胞因子的分泌来评估库普弗细胞的功能性和存活率。如图所示，IL-6和TNF-α的检测水平表明，细胞保持了正常功能并具有活性。除了保持其生理状态下的细胞代谢外，这些培养物对乙型肝炎病毒（HBV）感染表现出极高的敏感性。感染后第二天即可轻松检测到HBV DNA及其他病毒标志物。传统培养方法需要接种至少500个HBV基因组当量，并补充DMSO和PEG，而这些3D培养物仅需05个未添加任何补充物的基因组当量即可实现感染。除了分泌的病毒感染标志物外，还可从这些培养物中回收含有肝细胞的支架。免疫荧光显微镜显示，这些支架中含有病毒抗原。在进行该操作时，务必注意在接种前轻柔处理肝细胞，以避免细胞死亡。此外，在接种肝细胞之前，必须确保板件正确组装，且所有流道均能实现培养基的正常循环。完成此步骤后，可进一步采用免疫荧光等其他方法来回答更多科学问题，例如感染细胞在组织中的位置及其发生频率。通过白蛋白染色或包括紧密连接蛋白ZO-1在内的肝细胞结构染色，也可评估肝细胞的生理状态。该技术的发展为病毒学领域的研究人员探索乙型肝炎病毒感染及免疫应答提供了一个生理性的三维模型系统。请注意，操作乙型肝炎病毒可能存在生物安全风险，因此在进行本实验时，必须采取相应预防措施，例如事先接种疫苗、使用适当的个人防护装备（PPE），并严格遵守相应的生物安全操作规范。

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

乙型肝炎病毒感染原代肝细胞和库珀细胞的 "肝片上" 培养

本文描述了一种从同一供体分离人类肝细胞和非实质肝脏细胞的技术。不同类型的肝脏细胞构成了功能性肝脏模型和组织工程的基础。该新方法旨在以高得率和高活性分离肝脏细胞。...

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本文展示了一种从成年小鼠分离原代肝细胞的酶法，并描述了使用ELISA和实时PCR定量炎症反应的方法。...

小鼠原代肝细胞培养物中炎症反应的诱导

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干细胞来源的病毒抗原特异性T淋巴细胞抑制小鼠中乙型肝炎病毒复制

本文描述了一种在新型基因工程293T细胞（293T-NE-3NRs，表达人源NTCP、HNF4α、RXRα和PPARα）以及传统肝细胞（HepG2-NE，表达人源NTCP）中进行乙型肝炎病毒（HBV）感染的详细实验方案。...

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本方案详细介绍了使用特殊静脉导管、标准化的一次性无菌管路、结合实时监测的温度控制以及报警系统，进行两步胶原酶灌注，以提高分离的原代大鼠肝细胞的活力、得率和功能的一致性。...

通过多参数灌注控制分离大鼠原代肝细胞

小鼠肝细胞类器官的建立与遗传操作

我们介绍了一种利用等温滴定量热法检测靶向乙肝病毒（HBV）进入宿主细胞前后生命周期阶段的抗病毒化合物的方案，该方法通过测定化合物与宿主钠-牛磺胆酸共转运多肽结合亲和力（KD）来评估其作用。抗病毒效果则通过检测病毒生命周期标志物（共价闭合环状DNA形成、转录及病毒组装）的抑制情况来确定。...

一种通过钠-牛磺胆酸共转运多肽研究乙型肝炎病毒进入的高效肝细胞模型作为治疗靶点

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用于肝脏疾病研究的外周血来源人肝类球体

在此，我们介绍一种可实现非侵入性 体内 小鼠眼前房移植肝类器官的成像。该实验流程涵盖从原代肝细胞生成类器官，到将其移植至小鼠眼前房的全过程 体内 通过共聚焦显微镜实现细胞分辨率成像。...

活体成像小鼠眼前房移植的肝类器官

本方案介绍了一种在大鼠模型中优化的两步胶原酶肝脏灌注技术，并展示了分离肝细胞的应用 体外...

大鼠肝脏灌注与原代肝细胞分离：一种对前沿3D类器官培养至关重要的传统方法

了解肝片上芯片培养技术用于乙型肝炎病毒感染研究，利用原代肝细胞和库珀细胞构建三维生理微环境。该方法支持长期培养并进行药物测试，为病毒发病机制和免疫逃逸研究提供重要平台。

用于乙型肝炎病毒感染的原代肝细胞与库普弗细胞“肝脏芯片”培养

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